定量和半定量PCR技术及其临床意义
作者：张 捷
单位：北京医科大学第三医院检验科，北京 100083
关键词：
北京医科大学学报990526 1 半定量和定量PCR及定量核酸的方法
1.1 内对照法
将已知的目的DNA及内对照DNA混合,加入两对引物同时进行PCR扩增,最后将PCR产物转膜,用特异性探针杂交,目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定[1]。
1.2 PCR杂交法(PCR-Hyb法)
合成的引物5′端连有生物素,所带有生物素的PCR产物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色,呈色的程度与PCR产物浓度呈正比。
, http://www.100md.com
1.3 分枝DNA法(b-DNA法[2])
两种特异性探针与待测的RNA杂交,其中一种探针的另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝DNA杂交,分枝DNA的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物,底物在酶的作用下,产生光的强度与待测DNA或RNA浓度成正比。此方法有放大和定量的作用。
1.4 PCR-杂交定量的荧光检测
PCR产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后，首先给第一个荧光团激发光,使它的发射光去激发第二个荧光团,荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算PCR产物。此方法的特异性很高。
1.5 连续荧光检测PCR产物
在进行PCR扩增的同时,荧光染料SYBPR GreenⅠ结合到双链DNA产物上,在一定温度下,连续监测荧光发射的最高峰,则可计算出PCR产物的量。
, 百拇医药
1.6 5′核酸酶分析(荧光定量PCR)
探针的5′端标有荧光团,3′端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内,淬灭团控制荧光团的发光。此探针杂交在待测的DNA上,然后放引物进行PCR扩增,当引物延伸到探针的5′端,切断探针5′端的荧光团,淬灭团失去控制荧光团的作用,则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。
2 PCR技术检测病原微生物的临床意义
如果原有检测技术的灵敏度和特异性基本上已达到临床需要，则不必一律采用PCR技术。
对于目前还没有其它诊断技术可以检测的疾病(如基因缺失、易位、突变)，需要培养时间较长或培养难度大的病原体的检测，则可考虑应用PCR方法。
如人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原(HIV-Ag)或抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。
, http://www.100md.com
用PCR和杂交方法对丙型肝炎(HCV)的基因分型、早期诊断和治疗监测的临床价值,已被国内外医学界所公认。
美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒，也批准了HPV的过筛检测,对于HPV各型的检测,目前尚未批准。MTB的靶序列是16 SDNA的584 bp，其最后带有杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒是1993年通过FDA批准,目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法进行检测。但在美国通过CAP检查的某些教学医院实验室也可适量检测其它项目。
某些病毒、(如CMV[3]、EBV等)支原体、细菌可在普通人体内存在,称条件致病病原体，所以检测这些病毒、支原体、细菌最好用定量PCR,复制数量要达到一定程度才考虑有临床意义。据国外文献报道,在严格的实验条件下,一些标本进行细菌培养结果和DNA结果不一致尚难以解释时，但对有临床症状病人的标本某些细菌培养结果是阴性,mRNA的检测结果呈阳性,应考虑体内的细菌在致病[4]。
, 百拇医药
参考文献
1 刘陶文. 定量PCR技术. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 1998,19:(1)15
2 Gilliiand G, Perrin S, Blanchard K, et al. Analysis of cytokine mRNA and DNA:Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,87:2725-2729
3 Storch GA, Ballei RS, Bailey TC, et al, Comparison of PCR and PP65 antigenemia assay with quantitative shell viral culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant recipients. J Clin Microbiol, 1994,32(4):997-1003
4 Rayner MG, Zhang y, Gorry MC. Evidence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion. JAMA, 1998,279(4):296
(1998-10-12收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第三医院检验科，北京 100083
关键词：
北京医科大学学报990526 1 半定量和定量PCR及定量核酸的方法
1.1 内对照法
将已知的目的DNA及内对照DNA混合,加入两对引物同时进行PCR扩增,最后将PCR产物转膜,用特异性探针杂交,目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定[1]。
1.2 PCR杂交法(PCR-Hyb法)
合成的引物5′端连有生物素,所带有生物素的PCR产物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色,呈色的程度与PCR产物浓度呈正比。
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1.3 分枝DNA法(b-DNA法[2])
两种特异性探针与待测的RNA杂交,其中一种探针的另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝DNA杂交,分枝DNA的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物,底物在酶的作用下,产生光的强度与待测DNA或RNA浓度成正比。此方法有放大和定量的作用。
1.4 PCR-杂交定量的荧光检测
PCR产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后，首先给第一个荧光团激发光,使它的发射光去激发第二个荧光团,荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算PCR产物。此方法的特异性很高。
1.5 连续荧光检测PCR产物
在进行PCR扩增的同时,荧光染料SYBPR GreenⅠ结合到双链DNA产物上,在一定温度下,连续监测荧光发射的最高峰,则可计算出PCR产物的量。
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1.6 5′核酸酶分析(荧光定量PCR)
探针的5′端标有荧光团,3′端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内,淬灭团控制荧光团的发光。此探针杂交在待测的DNA上,然后放引物进行PCR扩增,当引物延伸到探针的5′端,切断探针5′端的荧光团,淬灭团失去控制荧光团的作用,则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。
2 PCR技术检测病原微生物的临床意义
如果原有检测技术的灵敏度和特异性基本上已达到临床需要，则不必一律采用PCR技术。
对于目前还没有其它诊断技术可以检测的疾病(如基因缺失、易位、突变)，需要培养时间较长或培养难度大的病原体的检测，则可考虑应用PCR方法。
如人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原(HIV-Ag)或抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。
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用PCR和杂交方法对丙型肝炎(HCV)的基因分型、早期诊断和治疗监测的临床价值,已被国内外医学界所公认。
美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒，也批准了HPV的过筛检测,对于HPV各型的检测,目前尚未批准。MTB的靶序列是16 SDNA的584 bp，其最后带有杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒是1993年通过FDA批准,目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法进行检测。但在美国通过CAP检查的某些教学医院实验室也可适量检测其它项目。
某些病毒、(如CMV[3]、EBV等)支原体、细菌可在普通人体内存在,称条件致病病原体，所以检测这些病毒、支原体、细菌最好用定量PCR,复制数量要达到一定程度才考虑有临床意义。据国外文献报道,在严格的实验条件下,一些标本进行细菌培养结果和DNA结果不一致尚难以解释时，但对有临床症状病人的标本某些细菌培养结果是阴性,mRNA的检测结果呈阳性,应考虑体内的细菌在致病[4]。
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参考文献
1 刘陶文. 定量PCR技术. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 1998,19:(1)15
2 Gilliiand G, Perrin S, Blanchard K, et al. Analysis of cytokine mRNA and DNA:Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,87:2725-2729
3 Storch GA, Ballei RS, Bailey TC, et al, Comparison of PCR and PP65 antigenemia assay with quantitative shell viral culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant recipients. J Clin Microbiol, 1994,32(4):997-1003
4 Rayner MG, Zhang y, Gorry MC. Evidence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion. JAMA, 1998,279(4):296
(1998-10-12收稿), http://www.100md.com