脉冲磁场对γ射线诱导HL-60细胞凋亡的影响
作者：刘晓秋 赵文正 赵阿津
单位：(天津，中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所 300192)
关键词：
中华放射医学与防护杂志980616 细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(PCD)，是一种不同于坏死且受基因指导的主动性细胞自我消亡的过程。许多外环境因素都可诱发细胞凋亡，如电离辐射[11]等。发生凋亡的细胞显示出一系列特征性变化，诸如：染色质凝聚，核固缩，形成凋亡小体，染色体DNA在核小体连接区断裂形成非随机的寡聚核苷酸片段[2]。电磁场是继药物增敏和热增敏后用于肿瘤放疗的一种新的增敏手段，我们经实验研究发现，电磁场可增加γ射线诱导HL-60细胞凋亡，其结果对肿瘤研究和治疗有重要的理论和实际意义。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 细胞培养：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液37℃，5%CO2条件下培养HL-60细胞。以0.5%苔盼蓝拒染实验确定死活细胞数。
1.2 照射条件：本所137Cs辐射源，照射量率约2.657×10-2C.kg-1.min-1，剂量4Gy。取对数生长期细胞，调浓度为1×106/ml，随机分成4组，即对照组，磁场组，γ射线组及磁场+γ射线组。第一天磁场照射细胞2小时，第二天经137Cs γ射线照射后，再经磁场照射2小时，第三天观察结果。
1.3 细胞形态学检测：取细胞经离心涂片机甩干后瑞氏染色，光镜下观察细胞并拍照片。
1.4 流式细胞仪(FCM)检测：70%乙醇固定细胞，4℃染色30分钟。FCM分析应用FCS-EPICS型流式细胞仪，用Cellfit软件收集细胞并分析数据，每个样品收集1 000个细胞。
, 百拇医药
1.5 DNA片段电泳：常规酚，氯仿抽提DNA。1%琼脂糖凝胶，1×TBE电泳缓冲液，电压70V，电泳2小时。
2 结果
2.1 细胞存活率观察：采用苔盼蓝拒染实验对不同组别细胞进行存活记数，可看出磁场组，γ射线组，磁场+γ射线组细胞对苔盼蓝染色的阴性率均大于94%，与对照组比较差异无显著性，说明这些细胞仍为存活细胞或凋亡细胞。
2.2 细胞形态学观察：每份样品均观察1 000个细胞，从细胞形态学观察可看到磁场+γ射线组大部分细胞体积明显变小，胞膜皱缩，胞核固缩，染色质浓染，有的细胞表现为核碎裂(图1)。对照组凋亡细胞阳检率为0.2%，γ射线组为16.8%，两组比较，差异有非常显著性，P<0.01。磁场+γ射线组为40.8%，与γ射线组比较，差异有非常显著性,P<0.01。
, 百拇医药
图1 磁场与γ射线联合作用HL-60细胞后
凋亡细胞的形态，箭头所示为凋亡细胞
2.3 DNA断裂分析：DNA凝胶电泳分析显示，γ射线组，γ射线+磁场组细胞DNA均发生断裂，但磁场+γ射线组细胞DNA断裂更明显(图2)，说明电磁场作用后可增加γ射线诱导HL-60细胞凋亡。
图2 磁场或/和γ射线作用HL-60细胞后DNA电泳
A：对细胞 B：磁场+γ射线照射细胞
C：磁场照射细胞 D：γ-射线照射细胞
2.4 DNA含量分析：HL-60细胞经γ射线或磁场+γ射线照射后，DNA直方图上G0/G1峰前均出现细胞凋亡时特有的低宽亚二倍体DNA波峰，即为程序化死亡细胞峰。从其出现的百分率上看，磁场+γ射线组凋亡细胞为33.36%，明显高于单独γ射线组(18.65%)。
, 百拇医药
3 讨论
电离辐射是细胞凋亡的诱因之一。细胞经4Gy γ射线照射，或经磁场与γ射线联合照射后，细胞仍有94%以上对苔盼蓝染料呈阴性反应，但形态学观察和DNA断片分析显示这些细胞核染色质凝聚，DNA降解呈细胞凋亡状态。
γ射线照射能诱导HL-60细胞凋亡，且呈剂量依赖性关系。当4Gy γ射线照射HL-60细胞，从细胞形态学观察，凋亡细胞为16.8%，琼脂糖凝胶电泳可看到DNA断片出现。当射线与电磁场联合作用后，凋亡细胞从16.8%增加到40.8%，凝胶电泳分析，DNA断片明显可见，同时用FCM检测细胞DNA含量变化时发现，G0/G1期峰前出现一个低DNA含量的细胞峰，指示此时细胞中有一群凋亡细胞占总细胞的33.36%。
最近一系列的研究揭示，细胞凋亡至少有两种途径。一为p53依赖性凋亡，一为p53非依赖性凋亡。而一般因DNA损伤而诱发的细胞凋亡中，p53蛋白表达是必不可少的[4]。DNA断裂可引起p53转录水平的增加，p53蛋白表达暂时性地升高，同时引发GADD45、MDM2和p21WAF/CIPI等基因的转录增加，所有这些都促使细胞阻滞于G1期[5]。但也发现某些辐射诱导凋亡细胞，又检测不到p53蛋白，因此认为，可能有更多的调节因子参与电离辐射诱导细胞凋亡，如jun/fos和EGR-1基因家族、转录因子NF-kB的激活[6]等。HL-60细胞为p53基因缺陷型细胞，经电磁场作用后细胞周期有改变，使细胞滞阻于G2+M期。电磁场增加γ射线诱导HL-60细胞凋亡，可能是通过与p53基因外更多的调节因子共同参与诱发细胞凋亡。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Nakano H,Shinohera K.X-ray induced cell death:apoptosis and necrosis.Radiat Res,1994,40:1-4.
2 Wyllie AH.Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation.Nature,1980,334:620-625.
3 Searle J.An electromicroscope study of the mode of cell death induced by cancer chemotherapeutic agents in populations of proliferating normal and neoplastic cells.J Pathol,1975,116:129-138.
, 百拇医药
4 Clark A R.Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways.Nature,1993,362:849-853.
5 Michael B.Modulation of p53-mediated G1 arrest and apoptosis.Proc Am Assoc Cancer Res,1995,36:708-715.
6 Manome Y.Conduction of c-jun gene expression and internucleosomal DNA fragmentation by ionizing radiation.Biochemistry,1993,32:1060-1068.
(收稿：1998-01-13 修回：1998-06-19), 百拇医药
单位：(天津，中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所 300192)
关键词：
中华放射医学与防护杂志980616 细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(PCD)，是一种不同于坏死且受基因指导的主动性细胞自我消亡的过程。许多外环境因素都可诱发细胞凋亡，如电离辐射[11]等。发生凋亡的细胞显示出一系列特征性变化，诸如：染色质凝聚，核固缩，形成凋亡小体，染色体DNA在核小体连接区断裂形成非随机的寡聚核苷酸片段[2]。电磁场是继药物增敏和热增敏后用于肿瘤放疗的一种新的增敏手段，我们经实验研究发现，电磁场可增加γ射线诱导HL-60细胞凋亡，其结果对肿瘤研究和治疗有重要的理论和实际意义。
1 材料和方法
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1.1 细胞培养：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液37℃，5%CO2条件下培养HL-60细胞。以0.5%苔盼蓝拒染实验确定死活细胞数。
1.2 照射条件：本所137Cs辐射源，照射量率约2.657×10-2C.kg-1.min-1，剂量4Gy。取对数生长期细胞，调浓度为1×106/ml，随机分成4组，即对照组，磁场组，γ射线组及磁场+γ射线组。第一天磁场照射细胞2小时，第二天经137Cs γ射线照射后，再经磁场照射2小时，第三天观察结果。
1.3 细胞形态学检测：取细胞经离心涂片机甩干后瑞氏染色，光镜下观察细胞并拍照片。
1.4 流式细胞仪(FCM)检测：70%乙醇固定细胞，4℃染色30分钟。FCM分析应用FCS-EPICS型流式细胞仪，用Cellfit软件收集细胞并分析数据，每个样品收集1 000个细胞。
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1.5 DNA片段电泳：常规酚，氯仿抽提DNA。1%琼脂糖凝胶，1×TBE电泳缓冲液，电压70V，电泳2小时。
2 结果
2.1 细胞存活率观察：采用苔盼蓝拒染实验对不同组别细胞进行存活记数，可看出磁场组，γ射线组，磁场+γ射线组细胞对苔盼蓝染色的阴性率均大于94%，与对照组比较差异无显著性，说明这些细胞仍为存活细胞或凋亡细胞。
2.2 细胞形态学观察：每份样品均观察1 000个细胞，从细胞形态学观察可看到磁场+γ射线组大部分细胞体积明显变小，胞膜皱缩，胞核固缩，染色质浓染，有的细胞表现为核碎裂(图1)。对照组凋亡细胞阳检率为0.2%，γ射线组为16.8%，两组比较，差异有非常显著性，P<0.01。磁场+γ射线组为40.8%，与γ射线组比较，差异有非常显著性,P<0.01。
, 百拇医药
图1 磁场与γ射线联合作用HL-60细胞后
凋亡细胞的形态，箭头所示为凋亡细胞
2.3 DNA断裂分析：DNA凝胶电泳分析显示，γ射线组，γ射线+磁场组细胞DNA均发生断裂，但磁场+γ射线组细胞DNA断裂更明显(图2)，说明电磁场作用后可增加γ射线诱导HL-60细胞凋亡。
图2 磁场或/和γ射线作用HL-60细胞后DNA电泳
A：对细胞 B：磁场+γ射线照射细胞
C：磁场照射细胞 D：γ-射线照射细胞
2.4 DNA含量分析：HL-60细胞经γ射线或磁场+γ射线照射后，DNA直方图上G0/G1峰前均出现细胞凋亡时特有的低宽亚二倍体DNA波峰，即为程序化死亡细胞峰。从其出现的百分率上看，磁场+γ射线组凋亡细胞为33.36%，明显高于单独γ射线组(18.65%)。
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3 讨论
电离辐射是细胞凋亡的诱因之一。细胞经4Gy γ射线照射，或经磁场与γ射线联合照射后，细胞仍有94%以上对苔盼蓝染料呈阴性反应，但形态学观察和DNA断片分析显示这些细胞核染色质凝聚，DNA降解呈细胞凋亡状态。
γ射线照射能诱导HL-60细胞凋亡，且呈剂量依赖性关系。当4Gy γ射线照射HL-60细胞，从细胞形态学观察，凋亡细胞为16.8%，琼脂糖凝胶电泳可看到DNA断片出现。当射线与电磁场联合作用后，凋亡细胞从16.8%增加到40.8%，凝胶电泳分析，DNA断片明显可见，同时用FCM检测细胞DNA含量变化时发现，G0/G1期峰前出现一个低DNA含量的细胞峰，指示此时细胞中有一群凋亡细胞占总细胞的33.36%。
最近一系列的研究揭示，细胞凋亡至少有两种途径。一为p53依赖性凋亡，一为p53非依赖性凋亡。而一般因DNA损伤而诱发的细胞凋亡中，p53蛋白表达是必不可少的[4]。DNA断裂可引起p53转录水平的增加，p53蛋白表达暂时性地升高，同时引发GADD45、MDM2和p21WAF/CIPI等基因的转录增加，所有这些都促使细胞阻滞于G1期[5]。但也发现某些辐射诱导凋亡细胞，又检测不到p53蛋白，因此认为，可能有更多的调节因子参与电离辐射诱导细胞凋亡，如jun/fos和EGR-1基因家族、转录因子NF-kB的激活[6]等。HL-60细胞为p53基因缺陷型细胞，经电磁场作用后细胞周期有改变，使细胞滞阻于G2+M期。电磁场增加γ射线诱导HL-60细胞凋亡，可能是通过与p53基因外更多的调节因子共同参与诱发细胞凋亡。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Nakano H,Shinohera K.X-ray induced cell death:apoptosis and necrosis.Radiat Res,1994,40:1-4.
2 Wyllie AH.Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation.Nature,1980,334:620-625.
3 Searle J.An electromicroscope study of the mode of cell death induced by cancer chemotherapeutic agents in populations of proliferating normal and neoplastic cells.J Pathol,1975,116:129-138.
, 百拇医药
4 Clark A R.Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways.Nature,1993,362:849-853.
5 Michael B.Modulation of p53-mediated G1 arrest and apoptosis.Proc Am Assoc Cancer Res,1995,36:708-715.
6 Manome Y.Conduction of c-jun gene expression and internucleosomal DNA fragmentation by ionizing radiation.Biochemistry,1993,32:1060-1068.
(收稿：1998-01-13 修回：1998-06-19), 百拇医药