染色体着丝粒探针的制备及其在检测染色体畸变中的应用
作者：张泽云 金璀珍 刘秀林 程昕 叶常青 孙志贤
单位：(北京，北京放射医学研究所 100850)
关键词：
中华放射医学与防护杂志980615 人类染色体的着丝粒区含有多种高度重序列家族，其中α卫星DNA在每号染色体的着丝粒区都存在，它们由171bp长的重复序列单元构成，其中大部分序列高度保守[1]。本文通过简并引物扩增171bp的重复单元，生物素标记制备成着丝粒探针，并应用此探针对辐射诱发的染色体畸变进行了初步检测。
1 材料和方法
1.1 着丝粒探针的制备
根据Weier等[2]的报道合成两简并引物5′GCTGCAGATC(A/C)C(A/C)AAG(A/T/C)AGTTTC3′和5′CAAGCTTA(A/T)(C/G)T(C/A)ACAGAGTT(G/T)AA3′，PCR扩增条件：100μl反应液中含人基因组DNA 0.1μg，两种引物分别为1.2μmol/L,0.2mmol/L dNTPS,3单位Taq聚合酶。模板在97℃变性5分钟，前5个循环，95℃ 0.5分钟，45℃ 1.5分钟，然后在2分钟内，由45℃升至72℃，72℃ 1.5分钟。再进行25轮循环，95℃ 0.5分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，最后72℃继续延伸5分钟。
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探针的标记：在100μl PCR反应体系中含5μl第一次PCR产物，0.2mmol/L dGTP,dCTP,dATP,0.05mmol/L dTTP,0.15mmol/L生物素-11-dUTP，1.2μmol/L两种引物，5单位Taq聚合酶，以相同条件循环25次。PCR产物用2%琼脂糖电泳检测。
1.2 原位杂交及检测
参考文献报道略作改进[3]，常规方法制备的染色体标本经70℃变性液(70%甲酰胺，2×SSC，pH7.0)变性3分钟，立即依次置70%，85%和100%预冷酒精中脱水2分钟，自然干燥。杂交反应液的组成为2～10ng/μl探针，55%的甲酰胺，10%的硫酸葡聚糖，1μg/μl的鲑精DNA(约400bp)，2×SSC，pH7.0。取10μl杂交液经72℃变性5分钟，冰浴冷却，加在染色体标本上，覆以20mm×20mm的盖玻片，四周用橡皮泥密封，置湿盒中37℃杂交过夜。取出标本，去掉盖玻片，用洗片液(50%甲酰胺，2×SSC，pH7.0)在42℃洗涤10分钟，然后经2×SSC，0.1%NP-40室温洗涤两次，每次15分钟，尽量除去标本上的液体。加40μl 5μg/ml的FITC-亲和素于标本杂交区，覆以盖玻片，室温孵育20分钟。去掉盖玻片，用2×SSC，0.1%NP-40室温洗涤两次，加10μl含1μg/ml PI的抗荧光退色液，覆以盖玻片，吸掉多余的液体。荧光显微镜检测，激发光为455nm，发射滤片为520nm，染色体图像用ASA400彩色胶卷拍摄。
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2 结果
PCR扩增产物经电泳检测，出现两条带，分子量分别约为171bp和342bp，带后面有拖尾，表明PCR产物主要由171bp的α重复序列的单个重复单元和2个重复单元构成，同时还有少量大分子DNA片断，可能由多个重复单元构成。DNA经生物素标记后，电泳速率略有下降。
应用该探针进行荧光原位杂交，染色体为红色，着丝粒区为黄绿色。由于着丝粒区DNA序列的差异，各染色体的杂交信号强度不完全一致，但所有染色体的着丝粒都可见清晰的杂交信号。该探针与辐射诱发的畸变细胞进行杂交后，着丝粒环，双着丝粒和无着丝粒断片都可根据染色体上杂交信号的多少快速检测。
3 讨论
采用简并引物扩增α卫星DNA序列制备探针，探针DNA含有多种α卫星DNA重复单元，因而能与所有染色体的着丝粒杂交，与克隆的DNA探针相比，杂交信号具有更好的一致性和重复性。
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辐射生物剂量的估计基于辐射诱发染色体畸变的精确识别。应用染色体特异性探针进行染色体绘图检测易位染色体已证明是一种快速和可靠的方法，但荧光显微镜下，染色体的着丝粒有时观察不清，容易将双着丝粒染色体误认成易位染色体，因而有必要在进行染色体绘图时，同时对所有染色体的着丝粒进行特异地染色，这不仅可以提高镜检的速度和精度，而且对细胞形态较差的标本也可进行可靠的分析。显示染色体着丝粒已有多种方法，如C显带方法和着丝粒抗体显示法，然而它们都不能与染色体绘图技术同时使用。应用着丝粒探针进行荧光原位杂交虽然方法比较复杂，但它能与染色体特异性探针一起使用，快速、准确识别易位染色体和双着丝粒染色体，因而在早期受照者和慢性受照者的辐射剂量估计中具有广泛的应用前景。
参考文献
1 Vissel B and Choo KH.Human alpha satellite DNA-consensus sequence and conserved regions.Nucl Aci Res,1987,15(16):6751.
, http://www.100md.com
2 Weier HUG,Lucas JN,Poggensee M,et al.Two-color hybridization with high complexity chromosome-specific probes and a degenerate alpha satellite probe DNA allows unambiguous discrimination between symmetrical and asymmetrical translocations.Chromosoma,1991,100:371.
3 Pinkel D,Landegent J,Collins C,et al.Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries:detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4.Proc Natl Sci USA,1988,85:9138.
(收稿：1997-12-03 修回：1998-05-08), 百拇医药
单位：(北京，北京放射医学研究所 100850)
关键词：
中华放射医学与防护杂志980615 人类染色体的着丝粒区含有多种高度重序列家族，其中α卫星DNA在每号染色体的着丝粒区都存在，它们由171bp长的重复序列单元构成，其中大部分序列高度保守[1]。本文通过简并引物扩增171bp的重复单元，生物素标记制备成着丝粒探针，并应用此探针对辐射诱发的染色体畸变进行了初步检测。
1 材料和方法
1.1 着丝粒探针的制备
根据Weier等[2]的报道合成两简并引物5′GCTGCAGATC(A/C)C(A/C)AAG(A/T/C)AGTTTC3′和5′CAAGCTTA(A/T)(C/G)T(C/A)ACAGAGTT(G/T)AA3′，PCR扩增条件：100μl反应液中含人基因组DNA 0.1μg，两种引物分别为1.2μmol/L,0.2mmol/L dNTPS,3单位Taq聚合酶。模板在97℃变性5分钟，前5个循环，95℃ 0.5分钟，45℃ 1.5分钟，然后在2分钟内，由45℃升至72℃，72℃ 1.5分钟。再进行25轮循环，95℃ 0.5分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，最后72℃继续延伸5分钟。
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探针的标记：在100μl PCR反应体系中含5μl第一次PCR产物，0.2mmol/L dGTP,dCTP,dATP,0.05mmol/L dTTP,0.15mmol/L生物素-11-dUTP，1.2μmol/L两种引物，5单位Taq聚合酶，以相同条件循环25次。PCR产物用2%琼脂糖电泳检测。
1.2 原位杂交及检测
参考文献报道略作改进[3]，常规方法制备的染色体标本经70℃变性液(70%甲酰胺，2×SSC，pH7.0)变性3分钟，立即依次置70%，85%和100%预冷酒精中脱水2分钟，自然干燥。杂交反应液的组成为2～10ng/μl探针，55%的甲酰胺，10%的硫酸葡聚糖，1μg/μl的鲑精DNA(约400bp)，2×SSC，pH7.0。取10μl杂交液经72℃变性5分钟，冰浴冷却，加在染色体标本上，覆以20mm×20mm的盖玻片，四周用橡皮泥密封，置湿盒中37℃杂交过夜。取出标本，去掉盖玻片，用洗片液(50%甲酰胺，2×SSC，pH7.0)在42℃洗涤10分钟，然后经2×SSC，0.1%NP-40室温洗涤两次，每次15分钟，尽量除去标本上的液体。加40μl 5μg/ml的FITC-亲和素于标本杂交区，覆以盖玻片，室温孵育20分钟。去掉盖玻片，用2×SSC，0.1%NP-40室温洗涤两次，加10μl含1μg/ml PI的抗荧光退色液，覆以盖玻片，吸掉多余的液体。荧光显微镜检测，激发光为455nm，发射滤片为520nm，染色体图像用ASA400彩色胶卷拍摄。
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2 结果
PCR扩增产物经电泳检测，出现两条带，分子量分别约为171bp和342bp，带后面有拖尾，表明PCR产物主要由171bp的α重复序列的单个重复单元和2个重复单元构成，同时还有少量大分子DNA片断，可能由多个重复单元构成。DNA经生物素标记后，电泳速率略有下降。
应用该探针进行荧光原位杂交，染色体为红色，着丝粒区为黄绿色。由于着丝粒区DNA序列的差异，各染色体的杂交信号强度不完全一致，但所有染色体的着丝粒都可见清晰的杂交信号。该探针与辐射诱发的畸变细胞进行杂交后，着丝粒环，双着丝粒和无着丝粒断片都可根据染色体上杂交信号的多少快速检测。
3 讨论
采用简并引物扩增α卫星DNA序列制备探针，探针DNA含有多种α卫星DNA重复单元，因而能与所有染色体的着丝粒杂交，与克隆的DNA探针相比，杂交信号具有更好的一致性和重复性。
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辐射生物剂量的估计基于辐射诱发染色体畸变的精确识别。应用染色体特异性探针进行染色体绘图检测易位染色体已证明是一种快速和可靠的方法，但荧光显微镜下，染色体的着丝粒有时观察不清，容易将双着丝粒染色体误认成易位染色体，因而有必要在进行染色体绘图时，同时对所有染色体的着丝粒进行特异地染色，这不仅可以提高镜检的速度和精度，而且对细胞形态较差的标本也可进行可靠的分析。显示染色体着丝粒已有多种方法，如C显带方法和着丝粒抗体显示法，然而它们都不能与染色体绘图技术同时使用。应用着丝粒探针进行荧光原位杂交虽然方法比较复杂，但它能与染色体特异性探针一起使用，快速、准确识别易位染色体和双着丝粒染色体，因而在早期受照者和慢性受照者的辐射剂量估计中具有广泛的应用前景。
参考文献
1 Vissel B and Choo KH.Human alpha satellite DNA-consensus sequence and conserved regions.Nucl Aci Res,1987,15(16):6751.
, http://www.100md.com
2 Weier HUG,Lucas JN,Poggensee M,et al.Two-color hybridization with high complexity chromosome-specific probes and a degenerate alpha satellite probe DNA allows unambiguous discrimination between symmetrical and asymmetrical translocations.Chromosoma,1991,100:371.
3 Pinkel D,Landegent J,Collins C,et al.Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries:detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4.Proc Natl Sci USA,1988,85:9138.
(收稿：1997-12-03 修回：1998-05-08), 百拇医药