丁胱亚磺酰亚胺对胶质瘤细胞谷光甘肽及放射增敏作用的实验研究
作者：仝海波 金一尊 江澄川 严敏芬 唐镇生 徐立明
单位：江澄川 唐镇生 (上海，上海医科大学华山医院神经外科 200040)；金一尊 严敏芬 徐立明 (上海放射医学研究所)；仝海波 (太原，山西医科大学第一医院神经外科 030001)
关键词：胶质瘤；丁胱亚磺酰亚胺；谷胱甘肽；放射敏感性
中华放射医学与防护杂志980610 目的 研究巯基修饰剂BSO对胶质瘤细胞GSH含量的修饰作用和放射增敏作用。方法 利用Tietze还原酶法观察BSO对体外培养的胶质瘤细胞株及裸小鼠移植瘤模型胶质瘤细胞GSH的作用。利用MTT法观察BSO对胶质瘤细胞放射敏感性的影响。结果 经BSO作用后胶质瘤细胞的GSH含量显著下降，放射敏感性增加。结论 无论是离体还是整体用药，BSO均能降低胶质瘤细胞的GSH含量。BSO对胶质瘤细胞有放射增敏作用。
, 百拇医药 Effect of buthionine sulfoximine on glutathione content and radiation sensitivity of glioma cells.
Tong Haibao,Jin Yizun,Jiang Chengchuan,et al.Institute of Neurology,Shanghai Medical University,Shanghai 200040,China.Institut of Radiation Medicine, Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China
Objective To observe the effect of buthionine sulfoximine (BSO) on glutathione (GSH) content and radiosensitvity of glioma cells. Methods Using Tietze method to detect BSO on cultured glioma cell line and glioma-bearing nude mice and MTT method to observe the effect of BSO on radiosensitivity of glioma cells.Results BSO depleted the GSH content of glioma cells effectively and increased the radiation sensitivity. Conclusion Both under hypoxic and aerobic conditions BSO can deplete intracellular GSH and increase the radiation sensitivity of glioma cell.
, 百拇医药
Key words Glioma Buthionine salfoximine Glutathione Radiation sensitivity
细胞内非蛋白巯基特别是谷胱甘肽(Glutathione,GSH)对细胞的放射敏感性起重要作用[1]。放射治疗是胶质瘤治疗的重要手段。由于射线对脑组织的损害，限制了照射剂量，其治疗效果并不满意。能否通过修饰细胞内GSH的水平提高对胶质瘤的放射治疗效果，我们作了初步的研究，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养：细胞株：SHG-44胶质瘤细胞株取材于人脑星形细胞瘤2～3级，由苏州医学院建立[2]，黄强教授提供。在实验前检测细胞株无突变及退化现象，以对数生长期细胞为实验材料进行研究。
1.2 动物模型：人脑胶质瘤裸小鼠实体瘤模型NHG-1，苏州医学院建立[3]。体重20～25g，鼠龄5～8周，两性兼用。肿瘤生长约100mm3大小开始给药。
, 百拇医药
1.3 药物及给药方法：丁胱亚磺酰亚胺(Buthionine sulfoximine,BSO),上海医科大学放射医学研究所合成。离体实验：BSO临用前新鲜配制，过滤除菌后按实验设定浓度加入培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱内培养。分别于加药后2，4，6，12，24，36，48小时收集细胞测定GSH含量。整体实验：BSO用灭菌生理盐水配制，分两种给药方案：①一次性腹腔注射，剂量为5mmol/kg体重；②三次腹腔注射，剂量同前，每次间隔12小时。均分别于给药后(后一种方案为最后一次给药)6，12，24，36，48小时脱颈处死动物，收集肿瘤、肝、肾及脑组织测定其GSH含量。
1.4 谷胱甘肽的测定：本实验采用Tietze还原酶法[4]
1.5 离体增敏实验
1.5.1 照射条件：137Csγ射线源，剂量率1.05548Gy/min；照射距离：35cm；照射野直径：30cm。
, 百拇医药
1.5.2 乏氧方法：99.99%的氮气经1%硫酸铜溶液灭菌后通入乏氧容器内30分钟，夹闭通气出入孔保持乏氧状态。
1.5.3 细胞存活率及放射剂量效应曲线：采用MTT方法。细胞贴壁24小时加BSO，分乏氧及有氧两组照射。BSO作用分2小时和24小时两组，室温下照射2，4，6，8，10，15，20Gy，照射完毕后去除BSO，重新加入培养液，37℃、5%CO2恒温培养箱培养，第5天测吸光度(A值)。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。以照射剂量为横坐标，细胞存活率为纵坐标，计算机拟合出剂量-效应曲线。根据曲线计算D0值。
2 结果
2.1 BSO对胶质瘤细胞系SHG-44 GSH含量的影响
SHG-44胶质瘤细胞内源性GSH含量为：(1.548±0.017)×10-11mmol/细胞。经BSO作用后GSH含量逐渐下降，随时间延长下降速度延缓(见表1)。均数t检验，P<0.01。
, http://www.100md.com
表1 BSO对SHG-44细胞GSH含量的影响 时间
(h)
GSH含量(%)
对照
0.05
0.1
0.5(mmol/L)
2
100
78.80
63.11
59.24
, http://www.100md.com
4
100
48.03
44.40
38.56
6
100
40.20
37.66
22.87
12
100
32.98
, 百拇医药
17.71
15.76
24
100
14.29
11.52
9.00
36
100
10.15
9.00
7.72
48
, http://www.100md.com
100
7.34
6.11
4.50
2.2 BSO整体给药后对肿瘤及主要脏器GSH含量的影响
荷瘤裸小鼠其肿瘤及脑、肝、肾组织的内源性GSH含量分别为：(0.386±0.94)μmol/g,(0.116±0.027)μmol/g,(3.399±0.112)μmol/g,(0.041±0.017)μmol/g。表2，3分别示BSO一次或三次给药后各种组织GSH含量的变化。各组织GSH下降速度、程度及恢复过程各不相同。
表2 BSO一次用药对NHG-1GSH含量的修饰作用(%) 时间
(h)
, 百拇医药
对照
肿瘤
脑
肝
肾
6
100
37.31*
94.83*
24.09***
60.0*
12
, http://www.100md.com
100
34.46*
85.34*
26.21***
45.00*
24
100
39.12*
77.59*
42.45**
55.00*
, http://www.100md.com
36
100
53.11*
100*
79.99*
100*
48
100
63.99*
105.17*
80.85*
, 百拇医药
87.50*
注：与对照相比*P>0.05; **P<0.05；***P<0.01
表3 BSO三次用药对NHG-1GSH含量的修饰作用(%) 时间
(h)
对照
肿瘤
脑
肝
肾
6
100
35.75*
, http://www.100md.com
72.11*
24.83***
44.00*
12
100
7.77*
62.12**
31.97**
41.00**
24
100
, 百拇医药
6.74**
9.55*
47.95**
30.80**
36
100
15.03**
94.36*
40.41**
17.29**
, 百拇医药
48
100
15.54**
98.33*
83.98*
68.13*
注：与对照相比*P>0.05； **P<0.05；***P<0.01
2.3 BSO对离体胶质瘤细胞的放射增敏作用
表4所示为在乏氧及有氧状态下BSO对SHG-44胶质瘤细胞放射敏感性的影响。实验所得有氧D0为4.4Gy，乏氧D0为12.8Gy，氧增比(OER)为2.91，说明本实验的乏氧条件是合适的。D0值为使细胞群体存活率下降至37%时所需的照射剂量。
, 百拇医药
表4 BSO对SHG-44胶质瘤的放射增敏作用 组别
GSH(%)
D0
SER
有氧
乏氧
有氧
乏氧
对照
100
4.4
12.8……
, http://www.100md.com 0.1mol/L×2h
63.11
4.4
9.2
1.00
1.39
0.5mol/L×2h
59.24
4.4
9.2
1.00
1.39
0.1mol/L×24h
, 百拇医药
11.52
3.0…
1.47…
0.5mol/L×24h
9.00
3.0…
1.47…
3 讨论
GSH是细胞内主要的非蛋白巯基，具有多种重要生理功能，能够通过供氢的单电子反应，清除射线所产生的活性自由基。降低细胞内GSH含量，细胞对射线所产生的自由基灭活减少，因而能提高细胞的放射敏感性[1，5～8]。
BSO为近年来研究较多的巯基修饰剂能抑制GSH合成的限速酶，有效的降低细胞内GSH含量[9]。离体及整体实验也表明，BSO有明显的放射增敏作用[6，10]。我们观察了BSO对离体培养的胶质瘤细胞GSH的修饰作用，结果三种浓度BSO均有效的降低了SHG-44胶质瘤细胞的GSH含量，在48小时作用时间内，GSH含量逐渐下降，最初下降速度快，随作用时间延长，下降速度延缓，36到48小时维持在较低水平。这可能是由于抑制了GSH的合成，GSH迅速下降，残余的GSH随细胞代谢逐渐降低，而线粒体中的GSH则由于BSO不能进入，保持一定的GSH含量[11]。
, 百拇医药
关于BSO的乏氧增敏作用文献有比较一致的报道，但其有氧增敏作用看法不一[12，13]。我们的实验结果表明BSO对胶质瘤SHG-44细胞的增敏作用，在有氧及乏氧状态下均可产生。只是有氧状态下GSH需要下降更大程度才能产生放射增敏作用。我们实验证实GSH下降约60%乏氧细胞SER为1.39；而有氧细胞SER为1.00。GSH进一步下降至约10%，有氧细胞SER增至1.47。可能原因有氧状态下GSH竞争作用相对较弱， 故需降低较大程度才能显示作用。
BSO抑制GSH合成的作用无选择性，故整体给药后肿瘤及各脏器的GSH含量均会下降，这样在对肿瘤增敏的同时，就有增加其他脏器毒副作用的可能性。故观察全身用药后肿瘤及各脏器GSH含量改变的规律，有助于我们决定合理的治疗方案。本实验结果显示，肿瘤组织对BSO反应快，GSH下降多，恢复慢；脑组织对BSO反应慢，GSH下降少，恢复快。单剂量BSO作用12小时，肿瘤GSH明显下降(67.7%)，而对脑组织GSH无明显影响(14.8%)。重复剂量BSO可使肿瘤GSH进一步下降，在低水平保持相当时间。Skapex[5]用35S标记BSO研究发现颅内移植瘤BSO积聚是周围脑组织的15倍。Lippitz[6]研究胶质瘤放射增敏治疗，证实BSO降低GSH后，125I内放射治疗平均生存期明显延长。本实验显示不同组织对BSO有不同的反应，提示我们在使用BSO配合放疗，两者之间的使用间隔时间可能相当重要。如时机选择合适则有可能提高射线对肿瘤细胞的杀灭作用，而尽量避免可能增加的副作用。BSO具有潜在的增敏治疗意义，能否应用于临床以达到提高肿瘤疗效的目的，还需进一步研究。
, 百拇医药
本课题受卫生部基金资助
参考文献
1 Biaglow JE,Varnes ME,Epp ER,et al.Role of glutathione in the aerobic radiation response.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1989,16:1311.
2 杜子威，徐庚达，王尧，等.人脑恶性胶质瘤体外细胞系SHG-44的建立及其特征.中华肿瘤杂志，1984，6：241.
3 黄强，杜子威，徐庚达.人胶质瘤细胞裸小鼠实体瘤模型NHG-1的建立及其特性研究.中华肿瘤杂志，1987，9：269.
4 Tietze.Enzymatic method for quantitatitive determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione.Anal Biochem,1969,27:502.
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5 Skapek SX,Colvin OM,Griffith OW.Buthionine sulfoximine mediated depletion of glutathione in intracranial human glioma-derived xenografts.Biochem Pharmacol,1988,37:4313.
6 Lippitz BE,Halperln EC,Griffith OW,et al.L-Buthionine sulfoximine mediated radiosensitization in experimental interstitial rediotherapy of intracerebral D-54 MG glioma xenografts in athymic mice.Neurosurgery,1990,26:255.
7 Loh SN,Dethiefsen LA,Newton GL,et al.Nuclear thiosis:technical limitations on the determination of endogenous nuclear glutathionine and the potential importance of sulhydryl proteins.Radiat Res,1990,121:98.
, 百拇医药
8 Halperin EC,Brizel DM, Honore G,et al.The radiation dose-response relationship in a human glioma xenograft and an evaluation of the influence of glutathione depletion by buthionine sulfoximine.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992,24:103.
9 Griffith OW and Meister A.Postent and specific inhibition of glutathione synthesis by buthionine sulfoximine.J Biol Chem,1979,253:7558.
10 Barranco SC.Relationship between GSH leves and drug or radiation sensitivity in human gastric cancer cell lines in vitro.Investigational New Drugs,1991,9:29
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11 Bremner.Glutathione depletion in tissues after administration of buthionine sulphoximine.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1984,10:1261.
12 Mitchell JB,Cook JA,Degraff W,et al.Glutathione modulation in cancer treatment:will it work? Int J Radiat Oncol Biol Phys,1989,16:1289.
13 Hodgkiss RJ and Middleton RW.Enhancement of misonidazole radiosensitization by an inhibitor of glutathione biosynthesis.Int J Radiat Biol,1983,43:179.
(收稿：1997-07-18 修回：1997-10-29), 百拇医药
单位：江澄川 唐镇生 (上海，上海医科大学华山医院神经外科 200040)；金一尊 严敏芬 徐立明 (上海放射医学研究所)；仝海波 (太原，山西医科大学第一医院神经外科 030001)
关键词：胶质瘤；丁胱亚磺酰亚胺；谷胱甘肽；放射敏感性
中华放射医学与防护杂志980610 目的 研究巯基修饰剂BSO对胶质瘤细胞GSH含量的修饰作用和放射增敏作用。方法 利用Tietze还原酶法观察BSO对体外培养的胶质瘤细胞株及裸小鼠移植瘤模型胶质瘤细胞GSH的作用。利用MTT法观察BSO对胶质瘤细胞放射敏感性的影响。结果 经BSO作用后胶质瘤细胞的GSH含量显著下降，放射敏感性增加。结论 无论是离体还是整体用药，BSO均能降低胶质瘤细胞的GSH含量。BSO对胶质瘤细胞有放射增敏作用。
, 百拇医药 Effect of buthionine sulfoximine on glutathione content and radiation sensitivity of glioma cells.
Tong Haibao,Jin Yizun,Jiang Chengchuan,et al.Institute of Neurology,Shanghai Medical University,Shanghai 200040,China.Institut of Radiation Medicine, Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China
Objective To observe the effect of buthionine sulfoximine (BSO) on glutathione (GSH) content and radiosensitvity of glioma cells. Methods Using Tietze method to detect BSO on cultured glioma cell line and glioma-bearing nude mice and MTT method to observe the effect of BSO on radiosensitivity of glioma cells.Results BSO depleted the GSH content of glioma cells effectively and increased the radiation sensitivity. Conclusion Both under hypoxic and aerobic conditions BSO can deplete intracellular GSH and increase the radiation sensitivity of glioma cell.
, 百拇医药
Key words Glioma Buthionine salfoximine Glutathione Radiation sensitivity
细胞内非蛋白巯基特别是谷胱甘肽(Glutathione,GSH)对细胞的放射敏感性起重要作用[1]。放射治疗是胶质瘤治疗的重要手段。由于射线对脑组织的损害，限制了照射剂量，其治疗效果并不满意。能否通过修饰细胞内GSH的水平提高对胶质瘤的放射治疗效果，我们作了初步的研究，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养：细胞株：SHG-44胶质瘤细胞株取材于人脑星形细胞瘤2～3级，由苏州医学院建立[2]，黄强教授提供。在实验前检测细胞株无突变及退化现象，以对数生长期细胞为实验材料进行研究。
1.2 动物模型：人脑胶质瘤裸小鼠实体瘤模型NHG-1，苏州医学院建立[3]。体重20～25g，鼠龄5～8周，两性兼用。肿瘤生长约100mm3大小开始给药。
, 百拇医药
1.3 药物及给药方法：丁胱亚磺酰亚胺(Buthionine sulfoximine,BSO),上海医科大学放射医学研究所合成。离体实验：BSO临用前新鲜配制，过滤除菌后按实验设定浓度加入培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱内培养。分别于加药后2，4，6，12，24，36，48小时收集细胞测定GSH含量。整体实验：BSO用灭菌生理盐水配制，分两种给药方案：①一次性腹腔注射，剂量为5mmol/kg体重；②三次腹腔注射，剂量同前，每次间隔12小时。均分别于给药后(后一种方案为最后一次给药)6，12，24，36，48小时脱颈处死动物，收集肿瘤、肝、肾及脑组织测定其GSH含量。
1.4 谷胱甘肽的测定：本实验采用Tietze还原酶法[4]
1.5 离体增敏实验
1.5.1 照射条件：137Csγ射线源，剂量率1.05548Gy/min；照射距离：35cm；照射野直径：30cm。
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1.5.2 乏氧方法：99.99%的氮气经1%硫酸铜溶液灭菌后通入乏氧容器内30分钟，夹闭通气出入孔保持乏氧状态。
1.5.3 细胞存活率及放射剂量效应曲线：采用MTT方法。细胞贴壁24小时加BSO，分乏氧及有氧两组照射。BSO作用分2小时和24小时两组，室温下照射2，4，6，8，10，15，20Gy，照射完毕后去除BSO，重新加入培养液，37℃、5%CO2恒温培养箱培养，第5天测吸光度(A值)。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。以照射剂量为横坐标，细胞存活率为纵坐标，计算机拟合出剂量-效应曲线。根据曲线计算D0值。
2 结果
2.1 BSO对胶质瘤细胞系SHG-44 GSH含量的影响
SHG-44胶质瘤细胞内源性GSH含量为：(1.548±0.017)×10-11mmol/细胞。经BSO作用后GSH含量逐渐下降，随时间延长下降速度延缓(见表1)。均数t检验，P<0.01。
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表1 BSO对SHG-44细胞GSH含量的影响 时间
(h)
GSH含量(%)
对照
0.05
0.1
0.5(mmol/L)
2
100
78.80
63.11
59.24
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4
100
48.03
44.40
38.56
6
100
40.20
37.66
22.87
12
100
32.98
, 百拇医药
17.71
15.76
24
100
14.29
11.52
9.00
36
100
10.15
9.00
7.72
48
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100
7.34
6.11
4.50
2.2 BSO整体给药后对肿瘤及主要脏器GSH含量的影响
荷瘤裸小鼠其肿瘤及脑、肝、肾组织的内源性GSH含量分别为：(0.386±0.94)μmol/g,(0.116±0.027)μmol/g,(3.399±0.112)μmol/g,(0.041±0.017)μmol/g。表2，3分别示BSO一次或三次给药后各种组织GSH含量的变化。各组织GSH下降速度、程度及恢复过程各不相同。
表2 BSO一次用药对NHG-1GSH含量的修饰作用(%) 时间
(h)
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对照
肿瘤
脑
肝
肾
6
100
37.31*
94.83*
24.09***
60.0*
12
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34.46*
85.34*
26.21***
45.00*
24
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39.12*
77.59*
42.45**
55.00*
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36
100
53.11*
100*
79.99*
100*
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63.99*
105.17*
80.85*
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87.50*
注：与对照相比*P>0.05; **P<0.05；***P<0.01
表3 BSO三次用药对NHG-1GSH含量的修饰作用(%) 时间
(h)
对照
肿瘤
脑
肝
肾
6
100
35.75*
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72.11*
24.83***
44.00*
12
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7.77*
62.12**
31.97**
41.00**
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6.74**
9.55*
47.95**
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15.03**
94.36*
40.41**
17.29**
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98.33*
83.98*
68.13*
注：与对照相比*P>0.05； **P<0.05；***P<0.01
2.3 BSO对离体胶质瘤细胞的放射增敏作用
表4所示为在乏氧及有氧状态下BSO对SHG-44胶质瘤细胞放射敏感性的影响。实验所得有氧D0为4.4Gy，乏氧D0为12.8Gy，氧增比(OER)为2.91，说明本实验的乏氧条件是合适的。D0值为使细胞群体存活率下降至37%时所需的照射剂量。
, 百拇医药
表4 BSO对SHG-44胶质瘤的放射增敏作用 组别
GSH(%)
D0
SER
有氧
乏氧
有氧
乏氧
对照
100
4.4
12.8……
, http://www.100md.com 0.1mol/L×2h
63.11
4.4
9.2
1.00
1.39
0.5mol/L×2h
59.24
4.4
9.2
1.00
1.39
0.1mol/L×24h
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11.52
3.0…
1.47…
0.5mol/L×24h
9.00
3.0…
1.47…
3 讨论
GSH是细胞内主要的非蛋白巯基，具有多种重要生理功能，能够通过供氢的单电子反应，清除射线所产生的活性自由基。降低细胞内GSH含量，细胞对射线所产生的自由基灭活减少，因而能提高细胞的放射敏感性[1，5～8]。
BSO为近年来研究较多的巯基修饰剂能抑制GSH合成的限速酶，有效的降低细胞内GSH含量[9]。离体及整体实验也表明，BSO有明显的放射增敏作用[6，10]。我们观察了BSO对离体培养的胶质瘤细胞GSH的修饰作用，结果三种浓度BSO均有效的降低了SHG-44胶质瘤细胞的GSH含量，在48小时作用时间内，GSH含量逐渐下降，最初下降速度快，随作用时间延长，下降速度延缓，36到48小时维持在较低水平。这可能是由于抑制了GSH的合成，GSH迅速下降，残余的GSH随细胞代谢逐渐降低，而线粒体中的GSH则由于BSO不能进入，保持一定的GSH含量[11]。
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关于BSO的乏氧增敏作用文献有比较一致的报道，但其有氧增敏作用看法不一[12，13]。我们的实验结果表明BSO对胶质瘤SHG-44细胞的增敏作用，在有氧及乏氧状态下均可产生。只是有氧状态下GSH需要下降更大程度才能产生放射增敏作用。我们实验证实GSH下降约60%乏氧细胞SER为1.39；而有氧细胞SER为1.00。GSH进一步下降至约10%，有氧细胞SER增至1.47。可能原因有氧状态下GSH竞争作用相对较弱， 故需降低较大程度才能显示作用。
BSO抑制GSH合成的作用无选择性，故整体给药后肿瘤及各脏器的GSH含量均会下降，这样在对肿瘤增敏的同时，就有增加其他脏器毒副作用的可能性。故观察全身用药后肿瘤及各脏器GSH含量改变的规律，有助于我们决定合理的治疗方案。本实验结果显示，肿瘤组织对BSO反应快，GSH下降多，恢复慢；脑组织对BSO反应慢，GSH下降少，恢复快。单剂量BSO作用12小时，肿瘤GSH明显下降(67.7%)，而对脑组织GSH无明显影响(14.8%)。重复剂量BSO可使肿瘤GSH进一步下降，在低水平保持相当时间。Skapex[5]用35S标记BSO研究发现颅内移植瘤BSO积聚是周围脑组织的15倍。Lippitz[6]研究胶质瘤放射增敏治疗，证实BSO降低GSH后，125I内放射治疗平均生存期明显延长。本实验显示不同组织对BSO有不同的反应，提示我们在使用BSO配合放疗，两者之间的使用间隔时间可能相当重要。如时机选择合适则有可能提高射线对肿瘤细胞的杀灭作用，而尽量避免可能增加的副作用。BSO具有潜在的增敏治疗意义，能否应用于临床以达到提高肿瘤疗效的目的，还需进一步研究。
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本课题受卫生部基金资助
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(收稿：1997-07-18 修回：1997-10-29), 百拇医药