60Co-γ射线照射对大鼠肺一氧化氮合酶和内皮素系统基因表达的影响
作者：宋良文 马宪梅 崔雪梅 白蕴红 王德文
单位：(北京，北京放射医学研究所 100850)
关键词：辐射；基因表达；一氧化氮合酶；内皮素；肺
中华放射医学与防护杂志980609
目的 探讨一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)和内皮素(endothelin,ET)及ET转换酶(endothelin converting enzyme,ECE)等在受照射肺中的基因表达变化，揭示其在肺纤维化发生中的参与作用。方法 用60Co对大鼠肺进行30Gy照射，照后4，8，24天提取总RNA，分别做RT-PCR；对照射后1，3，5个月肺组织进行ET肽的Western blot和NOS-mRNA原位杂交。结果 照射后肺NOS mRNA转录减弱，ET mRNA增强，ECE mRNA在第8和24天增强，ETB-R mRNA在第24天转为阴性。照射后1，3，5月肺组织ET肽合成增加。照射后5个月NOS mRNA原位杂交呈阴性。结论 ET和NO之间平衡失调可能与肺纤维化发生有关。
, 百拇医药
Effect of 60Co γ-rays on gene expression of nitric oxide synthase and endothelin system in rat lung.
Song Liangwen,Ma Xianmei,Cui Xuemei,et al.Institute of Radiation Medicne,Beijing 100850,China.
Objective Gene expressions of nitric oxide synthase (NOS) and endothelin (ET) as well as ET converting enzyme (ECE) in rat lung after irradiation and their roles in genesis of pulmonary fibrosis were investigated. Methods Rat lung was irradiated with 30Gy of 60Coγ-rays and pulmonary total RNA was extracted at days 4,8 and 24 after irradiation, respectively.RT-PCR was made.Western blot of ET peptide in lung tissues was performed at 1,3 and 5 months after irradiation.Meanwhile in situ hybridization of NOS mRNA in rat pulmonary tissues was made at 5 months after irradiation. Results NOS mRNA transcription in pulmonary tissues turned into negative;ET mRNA transcription displayed strong positivity; positive ECE mRNA transcription appeared at days 8 and 24 after irradiation and ETB-R mRNA transcription turned to negative at day 24 after irradiation.Western blot of ET in plumonary tissue all displayed positive at 1,3,and 5 months after irradiation,especially at 1 month.In situ hybridization of NOS mRNA was negative at 5 moths after irradiation. Conclusion Dysregulation of balance between ET and NO may be involved in genesis of radiation pulmonary fibrosis.
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Key words Radiation Gene expression Nitric oxide synthase Endothelin Lungs
60Co-γ射线肺照射后早期出现间质性肺炎，经炎症和免疫反应最终导致纤维化[1～3]。近年的研究证明，NO和ET调节某些细胞增殖并保持动态平衡。许多慢性增生性疾病如动脉粥样硬化斑块和高血压血管壁平滑肌细胞增殖肥大皆表现为NOS和ET基因调节的平衡失调[4，5]。本实验对照射后早期肺内NOS和ET及ECE基因表达变化进行检测以进一步阐明放射性肺纤维化发生的确切机制。
1 材料和方法
选用健康雄性Wistar大鼠39只，体重180～200g，随机分为①照射后短期组(4，8，24天，n=6;对照n=3);②照射后长期组(1，3，5个月，n=18;对照n=12)。双肺60Co单次照射，吸收剂量为30Gy，照射剂量率为5.962×10-2C.kg-1，照射距离2.5m。短期组分别于4，8，24天取右肺中叶提取总RNA并用琼脂糖电泳证实RNA的完整性，灭活DNA，RNA反转录和PCR扩增，引物用Perkin Elmer公司产DNA合成仪合成。引物用量各为100pmol/L，反转录总体积为20μl,42℃ 90分钟，94℃ 20分钟灭活反转录酶；扩增体积为50μl,94℃ 1分钟变性，55℃ 1～2分钟退火，72℃ 2～3分钟延伸，25～35个循环，最后一个循环72℃延伸5分钟，取10μl产物进行琼脂糖凝胶(1.4%～1.8%)电泳，紫外灯下照相。照射后长期组分别于1，3，5个月取材称重，匀浆，每克组织加入PBS 3ml,3000r/min离心取上清，进行ET肽Western blot,ET抗体为多克隆，1∶1000稀释，小牛血清白蛋白作阴性对照。照射后5个月大鼠于右肺下叶取材冰冻切片，cNOS原位杂交。cNOS-cDNA探针由北医心血管研究所提供，地高辛标记，42℃杂交18～24小时，NBT-BCIP显色4～6小时。
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2 结果
2.1 肺总RNA：260nm/280nm=1.66～1.73，取10μg进行琼脂糖凝胶电泳，28s条带明显亮于18s。
2.2 早期基因表达变化：照射后4，8，24天，电泳出现明显的ET基因表达，24天最强，而未照射动物仅有微弱表达(图1)，照射后8天和24天，出现较强的ECE基因表达(图2)，照射后4和8天仍可见较弱的ETB-R基因表达，而24天时基因表达消失；与ET电泳相反，未照射组有较强的NOS基因表达，而照射后各时间点NOS基因表达明显减弱(图3)。
图1 内皮素反转录多聚酶链式反应琼脂糖凝胶电泳检测
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图2 内皮素转换酶反转录多聚酶链式反应琼脂糖凝胶电泳检测
图3 一氧化氮合酶反转录多聚酶链式反应琼脂糖凝胶电泳检测
2.3 内皮素肽Western blot显示，照射后1，3，5月，肺匀浆中ET免疫反应皆呈阳性，其中照射后1个月最明显(图4)。
图4 内皮素Western Blot 免疫化学反应
2.4 NOS原位杂交：未照射大鼠肺泡间隔细胞NOS杂交信号呈蓝色强阳性，分布丰富，而照射后5个月肺组织有广泛纤维组织增生，除个别小血管的内皮细胞呈NOS弱阳性信号外，肺泡间隔细胞未见阳性信号反应(图5，6)。
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图5 未照射大鼠5个月后肺泡间隔细胞NOSmRNA原位杂交信号显示强阳性，×200
图6 受照射大鼠5个月后肺泡间隔细胞和纤维化的肺实质NOS原位杂交信号呈阴性，仅有个别少数内皮细胞显示弱阳性信号，×200
3 讨论
心肺肾中能表达丰富的ET，经ET受体发挥作用。受体分为ETA和ETB 两种[6]，前者介导细胞增殖，后者介导细胞增殖抑制。ET能促进成纤维细胞增殖，在培养液中加入微量ET即可增加3H-TdR掺入和DNA合成，缩短细胞周期，细胞分裂速率增加。此作用是通过c-fos,c-myc和c-myb介导的。1987年Palmer确认了NO[7]，其作用是舒张血管，抑制细胞异常增殖，消除氧自由基和保护细胞[8]。除细胞外，中枢及外周神经元、肝、肺、血管平滑肌细胞、巨噬细胞也产生NO[9]。NOS是NO合成的限速酶[10]。
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许多实验证明，ET基因激活和NOS基因受抑是许多细胞异常增殖性疾病的主要因素之一。当组织细胞中NO生成减少时其对细胞增殖的抑制作用即减弱[11～13]。我们的研究发现，照射可引起肺组织和培养的人胚肺成纤维细胞中NO和NOS含量减少或抑制，而丝裂原物质血管紧张素II生成增多，补充NO前体物质硝普钠或L-精氨酸可抑制丝裂原刺激成纤维细胞增生的作用。
本实验结果表明，内皮素基因对放射极为敏感，照后4天即可见到mRNA转录明显增强，24天更为典型；内皮素转换酶的作用是将ET前体转换成ET，照射后第8天即出现基因表达，24天仍持续表达，提示ECE基因表达对ET的生成至关重要。由于ETB-R的功能是激活NOS基因表达和促进NO产生，因此参与细胞增殖的抑制。照射后24天ETB-R基因表达消失表明机体对抗ET的作用丧失。在正常大鼠肺中，NOS基因表达旺盛，而照射后4～24天，NOS基因表达明显减弱，提示照射抑制了NOS基因表达，从而消除了NO对ET丝裂原的拮抗作用。
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在正常组织中ET含量较低，其作用只是维持血管系统的张力，但在组织损伤等异常刺激下，局部组织和血液中ET含量明显增多，并通过ETA-R刺激细胞增生。Western blot表明，照射后1～5个月，大鼠肺组织中ET维持较高的浓度，而照后5个月的肺组织中NOS mRNA转录几乎完全消失。
上述结果表明，肺组织在60Co照射后早期即出现NOS和ET系统基因表达平衡失调，与间质细胞异常增殖有一定关系，在放射性肺纤维化的形成中可能具有重要作用。
参考文献
1 Martel MK,Haken R,Hazuka MB,et al.Dose-volume histogram and 3-D treatment planning evaluation of patients with pneumonitis.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,28:575.
, http://www.100md.com
2 Morgan GW,Pharm B,Breit SN, et al.Radiation and the lung:a reevaluation of the mechanisms mediating pulmonary injury.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1995,31:361.
3 Penney DP,Siemann DW,Rubin P,et al.Morphological correlates of fractionated radiation of the mouse lung:early and late effects.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,29:789.
4 Li QH,Zhang CH,Tang J,et al.Endothelium-derived relaxing factor/NO and hypertension.Chin J Circulat,1994,9:435
, 百拇医药
5 Song LW,Wang DW,Wang TL,et al.Expression and antagonist role of endothelin and NOS in atherosclerotic plaque.Chin J Pathol,1997,26:12.
6 Loffler BM,Kalina B,Kunze H.Partial characterization and subcellular distribution patterns of endothelin-1,-2 and -3 binding sites in human liver.Biochem Biophys Res Commun,1991,181:840.
7 Plmer R,Asbton D,Moncada S,et al.Vascular endothelial cells synthesize NO from L-arginin.Nature,1988,333:660.
, 百拇医药
8 Mooradian DL,Hutsell TC,Keefer LK,et al.NO donor molecules:effect of NO release rate on vascular smooth muscle cell proliferation in vitro.J Cardiovas Pharmacol,1995,25:674.
9 Knowles RG,Merrett M,Salter M,et al.Differential induction of brain,lung and liver NOS by endotoxin in the rat.Biochem Biophys Res Commun,1991,182:1504.
10 Vincent SR,Hope BT.Neurons that say NO.Trends In Neurosciences,1992,15:108.
, 百拇医药
11 Marletta MA.NOS:aspects concerning structure and catalysis.Cell,1994,78:927.
12 Nathan C,Xie QW.NOS:roles,tolls and controls.Cell,1994,78:915.
13 Warren JB,Pons F,Brady AJ.Nitric oxide biology:implications for cardiovascular therapeutics.Cardiovasc Res,1994,28:25.
(收稿：1997-08-12 修回：1997-12-22), 百拇医药
单位：(北京，北京放射医学研究所 100850)
关键词：辐射；基因表达；一氧化氮合酶；内皮素；肺
中华放射医学与防护杂志980609
目的 探讨一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)和内皮素(endothelin,ET)及ET转换酶(endothelin converting enzyme,ECE)等在受照射肺中的基因表达变化，揭示其在肺纤维化发生中的参与作用。方法 用60Co对大鼠肺进行30Gy照射，照后4，8，24天提取总RNA，分别做RT-PCR；对照射后1，3，5个月肺组织进行ET肽的Western blot和NOS-mRNA原位杂交。结果 照射后肺NOS mRNA转录减弱，ET mRNA增强，ECE mRNA在第8和24天增强，ETB-R mRNA在第24天转为阴性。照射后1，3，5月肺组织ET肽合成增加。照射后5个月NOS mRNA原位杂交呈阴性。结论 ET和NO之间平衡失调可能与肺纤维化发生有关。
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Effect of 60Co γ-rays on gene expression of nitric oxide synthase and endothelin system in rat lung.
Song Liangwen,Ma Xianmei,Cui Xuemei,et al.Institute of Radiation Medicne,Beijing 100850,China.
Objective Gene expressions of nitric oxide synthase (NOS) and endothelin (ET) as well as ET converting enzyme (ECE) in rat lung after irradiation and their roles in genesis of pulmonary fibrosis were investigated. Methods Rat lung was irradiated with 30Gy of 60Coγ-rays and pulmonary total RNA was extracted at days 4,8 and 24 after irradiation, respectively.RT-PCR was made.Western blot of ET peptide in lung tissues was performed at 1,3 and 5 months after irradiation.Meanwhile in situ hybridization of NOS mRNA in rat pulmonary tissues was made at 5 months after irradiation. Results NOS mRNA transcription in pulmonary tissues turned into negative;ET mRNA transcription displayed strong positivity; positive ECE mRNA transcription appeared at days 8 and 24 after irradiation and ETB-R mRNA transcription turned to negative at day 24 after irradiation.Western blot of ET in plumonary tissue all displayed positive at 1,3,and 5 months after irradiation,especially at 1 month.In situ hybridization of NOS mRNA was negative at 5 moths after irradiation. Conclusion Dysregulation of balance between ET and NO may be involved in genesis of radiation pulmonary fibrosis.
, 百拇医药
Key words Radiation Gene expression Nitric oxide synthase Endothelin Lungs
60Co-γ射线肺照射后早期出现间质性肺炎，经炎症和免疫反应最终导致纤维化[1～3]。近年的研究证明，NO和ET调节某些细胞增殖并保持动态平衡。许多慢性增生性疾病如动脉粥样硬化斑块和高血压血管壁平滑肌细胞增殖肥大皆表现为NOS和ET基因调节的平衡失调[4，5]。本实验对照射后早期肺内NOS和ET及ECE基因表达变化进行检测以进一步阐明放射性肺纤维化发生的确切机制。
1 材料和方法
选用健康雄性Wistar大鼠39只，体重180～200g，随机分为①照射后短期组(4，8，24天，n=6;对照n=3);②照射后长期组(1，3，5个月，n=18;对照n=12)。双肺60Co单次照射，吸收剂量为30Gy，照射剂量率为5.962×10-2C.kg-1，照射距离2.5m。短期组分别于4，8，24天取右肺中叶提取总RNA并用琼脂糖电泳证实RNA的完整性，灭活DNA，RNA反转录和PCR扩增，引物用Perkin Elmer公司产DNA合成仪合成。引物用量各为100pmol/L，反转录总体积为20μl,42℃ 90分钟，94℃ 20分钟灭活反转录酶；扩增体积为50μl,94℃ 1分钟变性，55℃ 1～2分钟退火，72℃ 2～3分钟延伸，25～35个循环，最后一个循环72℃延伸5分钟，取10μl产物进行琼脂糖凝胶(1.4%～1.8%)电泳，紫外灯下照相。照射后长期组分别于1，3，5个月取材称重，匀浆，每克组织加入PBS 3ml,3000r/min离心取上清，进行ET肽Western blot,ET抗体为多克隆，1∶1000稀释，小牛血清白蛋白作阴性对照。照射后5个月大鼠于右肺下叶取材冰冻切片，cNOS原位杂交。cNOS-cDNA探针由北医心血管研究所提供，地高辛标记，42℃杂交18～24小时，NBT-BCIP显色4～6小时。
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2 结果
2.1 肺总RNA：260nm/280nm=1.66～1.73，取10μg进行琼脂糖凝胶电泳，28s条带明显亮于18s。
2.2 早期基因表达变化：照射后4，8，24天，电泳出现明显的ET基因表达，24天最强，而未照射动物仅有微弱表达(图1)，照射后8天和24天，出现较强的ECE基因表达(图2)，照射后4和8天仍可见较弱的ETB-R基因表达，而24天时基因表达消失；与ET电泳相反，未照射组有较强的NOS基因表达，而照射后各时间点NOS基因表达明显减弱(图3)。
图1 内皮素反转录多聚酶链式反应琼脂糖凝胶电泳检测
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图2 内皮素转换酶反转录多聚酶链式反应琼脂糖凝胶电泳检测
图3 一氧化氮合酶反转录多聚酶链式反应琼脂糖凝胶电泳检测
2.3 内皮素肽Western blot显示，照射后1，3，5月，肺匀浆中ET免疫反应皆呈阳性，其中照射后1个月最明显(图4)。
图4 内皮素Western Blot 免疫化学反应
2.4 NOS原位杂交：未照射大鼠肺泡间隔细胞NOS杂交信号呈蓝色强阳性，分布丰富，而照射后5个月肺组织有广泛纤维组织增生，除个别小血管的内皮细胞呈NOS弱阳性信号外，肺泡间隔细胞未见阳性信号反应(图5，6)。
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图5 未照射大鼠5个月后肺泡间隔细胞NOSmRNA原位杂交信号显示强阳性，×200
图6 受照射大鼠5个月后肺泡间隔细胞和纤维化的肺实质NOS原位杂交信号呈阴性，仅有个别少数内皮细胞显示弱阳性信号，×200
3 讨论
心肺肾中能表达丰富的ET，经ET受体发挥作用。受体分为ETA和ETB 两种[6]，前者介导细胞增殖，后者介导细胞增殖抑制。ET能促进成纤维细胞增殖，在培养液中加入微量ET即可增加3H-TdR掺入和DNA合成，缩短细胞周期，细胞分裂速率增加。此作用是通过c-fos,c-myc和c-myb介导的。1987年Palmer确认了NO[7]，其作用是舒张血管，抑制细胞异常增殖，消除氧自由基和保护细胞[8]。除细胞外，中枢及外周神经元、肝、肺、血管平滑肌细胞、巨噬细胞也产生NO[9]。NOS是NO合成的限速酶[10]。
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许多实验证明，ET基因激活和NOS基因受抑是许多细胞异常增殖性疾病的主要因素之一。当组织细胞中NO生成减少时其对细胞增殖的抑制作用即减弱[11～13]。我们的研究发现，照射可引起肺组织和培养的人胚肺成纤维细胞中NO和NOS含量减少或抑制，而丝裂原物质血管紧张素II生成增多，补充NO前体物质硝普钠或L-精氨酸可抑制丝裂原刺激成纤维细胞增生的作用。
本实验结果表明，内皮素基因对放射极为敏感，照后4天即可见到mRNA转录明显增强，24天更为典型；内皮素转换酶的作用是将ET前体转换成ET，照射后第8天即出现基因表达，24天仍持续表达，提示ECE基因表达对ET的生成至关重要。由于ETB-R的功能是激活NOS基因表达和促进NO产生，因此参与细胞增殖的抑制。照射后24天ETB-R基因表达消失表明机体对抗ET的作用丧失。在正常大鼠肺中，NOS基因表达旺盛，而照射后4～24天，NOS基因表达明显减弱，提示照射抑制了NOS基因表达，从而消除了NO对ET丝裂原的拮抗作用。
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在正常组织中ET含量较低，其作用只是维持血管系统的张力，但在组织损伤等异常刺激下，局部组织和血液中ET含量明显增多，并通过ETA-R刺激细胞增生。Western blot表明，照射后1～5个月，大鼠肺组织中ET维持较高的浓度，而照后5个月的肺组织中NOS mRNA转录几乎完全消失。
上述结果表明，肺组织在60Co照射后早期即出现NOS和ET系统基因表达平衡失调，与间质细胞异常增殖有一定关系，在放射性肺纤维化的形成中可能具有重要作用。
参考文献
1 Martel MK,Haken R,Hazuka MB,et al.Dose-volume histogram and 3-D treatment planning evaluation of patients with pneumonitis.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,28:575.
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2 Morgan GW,Pharm B,Breit SN, et al.Radiation and the lung:a reevaluation of the mechanisms mediating pulmonary injury.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1995,31:361.
3 Penney DP,Siemann DW,Rubin P,et al.Morphological correlates of fractionated radiation of the mouse lung:early and late effects.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,29:789.
4 Li QH,Zhang CH,Tang J,et al.Endothelium-derived relaxing factor/NO and hypertension.Chin J Circulat,1994,9:435
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5 Song LW,Wang DW,Wang TL,et al.Expression and antagonist role of endothelin and NOS in atherosclerotic plaque.Chin J Pathol,1997,26:12.
6 Loffler BM,Kalina B,Kunze H.Partial characterization and subcellular distribution patterns of endothelin-1,-2 and -3 binding sites in human liver.Biochem Biophys Res Commun,1991,181:840.
7 Plmer R,Asbton D,Moncada S,et al.Vascular endothelial cells synthesize NO from L-arginin.Nature,1988,333:660.
, 百拇医药
8 Mooradian DL,Hutsell TC,Keefer LK,et al.NO donor molecules:effect of NO release rate on vascular smooth muscle cell proliferation in vitro.J Cardiovas Pharmacol,1995,25:674.
9 Knowles RG,Merrett M,Salter M,et al.Differential induction of brain,lung and liver NOS by endotoxin in the rat.Biochem Biophys Res Commun,1991,182:1504.
10 Vincent SR,Hope BT.Neurons that say NO.Trends In Neurosciences,1992,15:108.
, 百拇医药
11 Marletta MA.NOS:aspects concerning structure and catalysis.Cell,1994,78:927.
12 Nathan C,Xie QW.NOS:roles,tolls and controls.Cell,1994,78:915.
13 Warren JB,Pons F,Brady AJ.Nitric oxide biology:implications for cardiovascular therapeutics.Cardiovasc Res,1994,28:25.
(收稿：1997-08-12 修回：1997-12-22), 百拇医药