放射性核素235U诱发Molt-4细胞和Ana-1细胞凋亡
作者：付强 张澜生 朱寿彭
单位：付强 (上海，复旦大学遗传所 200433)；张澜生 朱寿彭 (苏州医学院)
关键词：放射性核素235U；细胞凋亡
中华放射医学和防护杂志980608 目的 对放射性核素235U内照射诱发Molt-4和Ana-1细胞的死亡形式进行研究。方法 通过形态学、琼脂糖电泳、MTT和JAM实验对核素诱发的细胞死亡进行了定性及定量分析。结果 放射性核素235U诱发的细胞死亡具有典型的细胞凋亡形态学特征，且细胞凋亡的程度及DNA链断裂量与235U作用的时间和内照射的累积吸收剂量有关。结论 放射性核素235U内照射可诱发细胞凋亡。
Radionuclide 235U induced apoptotic cell death in Molt-4 and Ana-1 cell lines.
, http://www.100md.com
Fu Qiang,Zhang Lansheng， Zhu Shoupeng. Suzhou Medical College,Suzhou 215007,China.
Objective The mode of cell death in Molt-4 and Ana-1 cell lines were studied after treatment with radionuclide 235U. Methods The morphological changes,agarose gel electrophoresis,MTT and JAM assays were used for qualitative and quantitative analysis. Result Dying cells induced by 235U displayed the morphological changes of apoptosis.Apoptotic cells and DNA fragmentation induced by 235U in both Molt-4 and Ana-1 cell lines were dependent on the treatment time and accumulated radiation dose.Conclusion Internal exposure with radionuclide 235U induces apoptosis in Molt-4 and Ana-1 cell lines.
, 百拇医药
Key words Radionuclide 235U Apoptosis
X射线和γ射线外照射可诱发细胞凋亡[1]，我们的研究显示适当剂量的β辐射体核素147Pm内照射也可诱发细胞凋亡。为了更为全面的了解放射性核素内照射诱发细胞凋亡的这一生物学作用，我们进一步观察了α辐射体核素235U诱发人Molt-4细胞株及小鼠Ana-1细胞株凋亡的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞受235U内照射的剂量估算：指数生长期Molt-4及Ana-1细胞于24孔培养板内与128.4Bq/ml 235UO2F2工作液充分混匀，使实验孔终放射活度每毫升为64.2Bq。培养板于37℃、5%CO2培养箱内培养，在3，6，9，12，24，及48小时分别收获细胞用于细胞凋亡的定性及定量分析。细胞受235U内照射不同时期的累计吸收剂量参照公式D=AE/mt[2]计算分别为：0.49mGy/3h，0.98mGy/6h，1.47mGy/9h,1.96mGy/12h,3.92mGy/24h和7.84mGy/48h。
, 百拇医药
1.2 细胞的形态学观察：235U作用不同时期的Molt-4和Ana-1细胞，用Hank's液洗涤去除游离核素后，经低渗荧光溶液处理或树脂包埋，用于荧光镜和电镜观察细胞形态。
1.3 DNA的琼脂糖电泳：2×106实验组或对照组细胞，洗涤后用酚及氯仿溶液抽提DNA，经适当体积的TE缓冲液溶解，取10μl DNA样品在含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带。
1.4 细胞存活率检测：采用MTT法检测235U作用后细胞的存活率[3]。细胞存活率以实验组与对照组590nm A值(吸光度)的百分比表示。
1.5 DNA链断裂量的检测：采用JAM法检测235U作用后细胞DNA链的断裂量[4]。指数生长期Molt-4及Ana-1细胞，先用3H-TdR掺入法标记细胞DNA，洗涤去除未掺入的3H-TdR后，细胞用64.2Bq/ml 235U工作液或RPMI-1640培养基调整细胞浓度。细胞于24孔板内培养，用多头细胞收集器将235U作用不同时期的细胞收获于49型玻璃纤维滤膜上，并用生理盐水反复冲洗，膜片烘干后液闪法计数膜片上3H-TdR的放射活性。235U诱发细胞DNA链断裂量按以下公式计算：
, 百拇医药
1.6 实验组和对照组细胞存活率及DNA链断裂百分比均数的比较采用方差分析。
2 结果
2.1 235U诱发细胞凋亡形态学特征的观察：经荧光镜及电镜观察显示，235U作用的Molt-4及Ana-1细胞呈现核固缩，染色体边聚以及凋亡小体形成等细胞凋亡所具有的典型形态学特征。235U作用不同时期细胞的DNA，琼脂糖电泳显示出DNA核小体间断裂所具有的阶梯状电泳条带(图1～3)。
图1 235U作用24小时Ana-1细胞出现染色质边界及凋亡小体的形成
, 百拇医药
图2 Molt-4细胞DNA电泳图
A：对照细胞DNA
B：235U作用3小时提取的DNA,C：6小时DNA
图3 Ana-1幼儿细胞DNA电泳图
A：对照组细胞DNA
B,C,D为235U作用3,6,9小时提取的DNA
2.2 235U诱发细胞凋亡的定量分析：通过MTT法，检测了235U作用不同时期细胞存活率的变化，其反映了凋亡细胞的数量。结果表明随着235U作用时间的增加，细胞存活率逐渐降低，与对照组相比有着显著的统计学差异，见表1。以细胞存活率为Y，细胞的累积以收率量为X，其作用的量效关系可拟合回归方程为，Molt-4：Y=e4.39-0.14x(r=-0.96\,P<0.01)。Ana-1:Y=e4.5-0.22x(r=-0.99\,P<0.01)。
, 百拇医药
表1 235U作用后Molt-4和Ana-1细胞存活率(%) 时间
(h)
剂量
(mGy)
Molt-4
Ana-1
对照组
235U
对照组
235U
3
0.49
, 百拇医药
100
94±5
100
95±2*
6
0.98
99±6
79±10**
95±2
70±5**
9
1.47
, http://www.100md.com
93±10
67±1**
90±8
57±2**
12
1.96
92±10
58±6**
83±6
44±1**
24
3.92
, http://www.100md.com
73±5
43±3**
70±10
16±2**
48
7.84
51±4
30±4**
46±2
30±5**
注：n=5,与对照组比，*P<0.05,**P<0.01
, 百拇医药
2.3 235U诱发凋亡细胞DNA链断裂的定量分析：DNA链的断裂是细胞凋亡的主要指征，通过JAM实验对235U诱发凋亡细胞DNA链断裂的定量分析表明，235U作用后Molt-4和Ana-1细胞均出现大量DNA链断裂，与对照组相比差异有显著性，见表2。随着235U作用时间的增加，二株细胞DNA链断裂量也进一步增强。
表2 235U作用后Molt-4和Ana-1细胞
DNA链断裂的定量分析(%) 时间
(h)
剂量
(mGy)
Molt-4
, 百拇医药
Ana-1
对照组
235U
对照组
235U
3
0.49
0
37±4**
0
19±2**
6
, 百拇医药
0.98
5±0.3
41±6**
6±0.7
26±2**
9
1.47
8±0.8
54±3**
10±0.8
39±3**
12
, http://www.100md.com
1.96
9±1
67±8**
14±0.9
56±8**
24
3.92
13±1
75±7**
19±0.9
62±2**
48
, 百拇医药
7.84
37±2
76±8**
45±5
71±8**
注：n=5,与对照组比，**P<0.01
3 讨论
细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，是细胞针对所处环境因素特定改变产生的应答，适当剂量的电离辐射可启动细胞凋亡机制引起细胞凋亡，以α辐射体核素235U为内照射源，我们对核素作用的人淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞和小鼠巨噬细胞株Ana-1细胞的形态观察显示，放射性核素235U内照射导致的二株细胞死亡具有核固缩，染色质边聚，凋亡小体形成等典型凋亡细胞所具有的形态学特征，死亡细胞DNA琼脂糖电泳也显示出凋亡细胞特有的阶梯状电泳条带，表明放射性核素235U可诱发Molt-4和Ana-1细胞的凋亡机制，引起细胞凋亡。利用MTT实验和JAM实验对235U诱发Molt-4和Ana-1细胞凋亡进一步定量分析表明，两株细胞的凋亡程度及凋亡细胞DNA链断裂量与细胞受235U作用的时间，也即细胞受235U照射后的累积放射吸收剂量有关，随着235U作用时间的延长，细胞累积吸收剂量的增加，Molt-4和Ana-1细胞的凋亡程度及DNA链断裂数量明显地增强，与对照组相比差异具有非常显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
细胞凋亡如同细胞分化增殖一样涉及到细胞内信号传递、酶的活化、蛋白质合成、以及基因表达等一系列细胞代谢的主动过程，在放射生物学领域内，对细胞凋亡的研究大多集中在X射线及γ射线外照射方面。有报道2～30Gy剂量的外照射引起Molt-4细胞凋亡与坏死，而且凋亡的Molt-4细胞DNA不呈现阶梯状电泳带[5]。我们的观察则显示，0.49mGy的235U内照射即可诱发Molt-4和Ana-1细胞的凋亡，并且凋亡细胞的DNA呈现出阶梯状电泳条带。这可能表明细胞死亡形式除与辐射剂量有关外还与不同的辐射形式有关，事实上内照射核素可通过细胞膜及核膜沉积于胞浆和胞核内，使其辐射作用具有持续性和效应的累积性[6]，因此它们诱发细胞凋亡所需的辐射剂量，诱发凋亡的途径及机制有别于外照射。
本实验放射性活度为235UO2F2贡献，235UO2F2作为化合物也具有一定的化学毒性，但是与放射性活度相比，实验用235UO2F2工作液中235UO2F2化合物的含量极低，因而我们认为对其细胞凋亡的诱导主要是辐射所至，但是不排除适当剂量的235UO2F2化合物诱发细胞凋亡的可能性，这有待于进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Szumiel I.Ionizing radiation-induced cell death.Int J Radiat Biol,1994,66:329.
2 李士骏.电离辐射剂量学.北京：原子能出版社，1981，286.
3 Price P.McMillan TJ.Use of the tetrazolium assay in measuring the response of human tumor cells to ionizing radiation. Cancer Res,1990,50:1392.
4 Matzinger P.The JAM test:a simple assay for DNA fragmentation and cell death.J Immunol Method,1991,145:185.
5 Akagi Y.Ito K, Sawada S.Radiation induced apoptosis and necrosis in Molt-4 cells:a study of dose-effect relationships and their modification.Int J Radiat Biol,1993,64:47.
6 朱寿彭.放射毒理学. 北京：原子能出版社，1992，57.
(收稿：1997-12-22 修回：1998-04-25), 百拇医药
单位：付强 (上海，复旦大学遗传所 200433)；张澜生 朱寿彭 (苏州医学院)
关键词：放射性核素235U；细胞凋亡
中华放射医学和防护杂志980608 目的 对放射性核素235U内照射诱发Molt-4和Ana-1细胞的死亡形式进行研究。方法 通过形态学、琼脂糖电泳、MTT和JAM实验对核素诱发的细胞死亡进行了定性及定量分析。结果 放射性核素235U诱发的细胞死亡具有典型的细胞凋亡形态学特征，且细胞凋亡的程度及DNA链断裂量与235U作用的时间和内照射的累积吸收剂量有关。结论 放射性核素235U内照射可诱发细胞凋亡。
Radionuclide 235U induced apoptotic cell death in Molt-4 and Ana-1 cell lines.
, http://www.100md.com
Fu Qiang,Zhang Lansheng， Zhu Shoupeng. Suzhou Medical College,Suzhou 215007,China.
Objective The mode of cell death in Molt-4 and Ana-1 cell lines were studied after treatment with radionuclide 235U. Methods The morphological changes,agarose gel electrophoresis,MTT and JAM assays were used for qualitative and quantitative analysis. Result Dying cells induced by 235U displayed the morphological changes of apoptosis.Apoptotic cells and DNA fragmentation induced by 235U in both Molt-4 and Ana-1 cell lines were dependent on the treatment time and accumulated radiation dose.Conclusion Internal exposure with radionuclide 235U induces apoptosis in Molt-4 and Ana-1 cell lines.
, 百拇医药
Key words Radionuclide 235U Apoptosis
X射线和γ射线外照射可诱发细胞凋亡[1]，我们的研究显示适当剂量的β辐射体核素147Pm内照射也可诱发细胞凋亡。为了更为全面的了解放射性核素内照射诱发细胞凋亡的这一生物学作用，我们进一步观察了α辐射体核素235U诱发人Molt-4细胞株及小鼠Ana-1细胞株凋亡的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞受235U内照射的剂量估算：指数生长期Molt-4及Ana-1细胞于24孔培养板内与128.4Bq/ml 235UO2F2工作液充分混匀，使实验孔终放射活度每毫升为64.2Bq。培养板于37℃、5%CO2培养箱内培养，在3，6，9，12，24，及48小时分别收获细胞用于细胞凋亡的定性及定量分析。细胞受235U内照射不同时期的累计吸收剂量参照公式D=AE/mt[2]计算分别为：0.49mGy/3h，0.98mGy/6h，1.47mGy/9h,1.96mGy/12h,3.92mGy/24h和7.84mGy/48h。
, 百拇医药
1.2 细胞的形态学观察：235U作用不同时期的Molt-4和Ana-1细胞，用Hank's液洗涤去除游离核素后，经低渗荧光溶液处理或树脂包埋，用于荧光镜和电镜观察细胞形态。
1.3 DNA的琼脂糖电泳：2×106实验组或对照组细胞，洗涤后用酚及氯仿溶液抽提DNA，经适当体积的TE缓冲液溶解，取10μl DNA样品在含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带。
1.4 细胞存活率检测：采用MTT法检测235U作用后细胞的存活率[3]。细胞存活率以实验组与对照组590nm A值(吸光度)的百分比表示。
1.5 DNA链断裂量的检测：采用JAM法检测235U作用后细胞DNA链的断裂量[4]。指数生长期Molt-4及Ana-1细胞，先用3H-TdR掺入法标记细胞DNA，洗涤去除未掺入的3H-TdR后，细胞用64.2Bq/ml 235U工作液或RPMI-1640培养基调整细胞浓度。细胞于24孔板内培养，用多头细胞收集器将235U作用不同时期的细胞收获于49型玻璃纤维滤膜上，并用生理盐水反复冲洗，膜片烘干后液闪法计数膜片上3H-TdR的放射活性。235U诱发细胞DNA链断裂量按以下公式计算：
, 百拇医药
1.6 实验组和对照组细胞存活率及DNA链断裂百分比均数的比较采用方差分析。
2 结果
2.1 235U诱发细胞凋亡形态学特征的观察：经荧光镜及电镜观察显示，235U作用的Molt-4及Ana-1细胞呈现核固缩，染色体边聚以及凋亡小体形成等细胞凋亡所具有的典型形态学特征。235U作用不同时期细胞的DNA，琼脂糖电泳显示出DNA核小体间断裂所具有的阶梯状电泳条带(图1～3)。
图1 235U作用24小时Ana-1细胞出现染色质边界及凋亡小体的形成
, 百拇医药
图2 Molt-4细胞DNA电泳图
A：对照细胞DNA
B：235U作用3小时提取的DNA,C：6小时DNA
图3 Ana-1幼儿细胞DNA电泳图
A：对照组细胞DNA
B,C,D为235U作用3,6,9小时提取的DNA
2.2 235U诱发细胞凋亡的定量分析：通过MTT法，检测了235U作用不同时期细胞存活率的变化，其反映了凋亡细胞的数量。结果表明随着235U作用时间的增加，细胞存活率逐渐降低，与对照组相比有着显著的统计学差异，见表1。以细胞存活率为Y，细胞的累积以收率量为X，其作用的量效关系可拟合回归方程为，Molt-4：Y=e4.39-0.14x(r=-0.96\,P<0.01)。Ana-1:Y=e4.5-0.22x(r=-0.99\,P<0.01)。
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表1 235U作用后Molt-4和Ana-1细胞存活率(%) 时间
(h)
剂量
(mGy)
Molt-4
Ana-1
对照组
235U
对照组
235U
3
0.49
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100
94±5
100
95±2*
6
0.98
99±6
79±10**
95±2
70±5**
9
1.47
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93±10
67±1**
90±8
57±2**
12
1.96
92±10
58±6**
83±6
44±1**
24
3.92
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73±5
43±3**
70±10
16±2**
48
7.84
51±4
30±4**
46±2
30±5**
注：n=5,与对照组比，*P<0.05,**P<0.01
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2.3 235U诱发凋亡细胞DNA链断裂的定量分析：DNA链的断裂是细胞凋亡的主要指征，通过JAM实验对235U诱发凋亡细胞DNA链断裂的定量分析表明，235U作用后Molt-4和Ana-1细胞均出现大量DNA链断裂，与对照组相比差异有显著性，见表2。随着235U作用时间的增加，二株细胞DNA链断裂量也进一步增强。
表2 235U作用后Molt-4和Ana-1细胞
DNA链断裂的定量分析(%) 时间
(h)
剂量
(mGy)
Molt-4
, 百拇医药
Ana-1
对照组
235U
对照组
235U
3
0.49
0
37±4**
0
19±2**
6
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0.98
5±0.3
41±6**
6±0.7
26±2**
9
1.47
8±0.8
54±3**
10±0.8
39±3**
12
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1.96
9±1
67±8**
14±0.9
56±8**
24
3.92
13±1
75±7**
19±0.9
62±2**
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7.84
37±2
76±8**
45±5
71±8**
注：n=5,与对照组比，**P<0.01
3 讨论
细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，是细胞针对所处环境因素特定改变产生的应答，适当剂量的电离辐射可启动细胞凋亡机制引起细胞凋亡，以α辐射体核素235U为内照射源，我们对核素作用的人淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞和小鼠巨噬细胞株Ana-1细胞的形态观察显示，放射性核素235U内照射导致的二株细胞死亡具有核固缩，染色质边聚，凋亡小体形成等典型凋亡细胞所具有的形态学特征，死亡细胞DNA琼脂糖电泳也显示出凋亡细胞特有的阶梯状电泳条带，表明放射性核素235U可诱发Molt-4和Ana-1细胞的凋亡机制，引起细胞凋亡。利用MTT实验和JAM实验对235U诱发Molt-4和Ana-1细胞凋亡进一步定量分析表明，两株细胞的凋亡程度及凋亡细胞DNA链断裂量与细胞受235U作用的时间，也即细胞受235U照射后的累积放射吸收剂量有关，随着235U作用时间的延长，细胞累积吸收剂量的增加，Molt-4和Ana-1细胞的凋亡程度及DNA链断裂数量明显地增强，与对照组相比差异具有非常显著性(P<0.01)。
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细胞凋亡如同细胞分化增殖一样涉及到细胞内信号传递、酶的活化、蛋白质合成、以及基因表达等一系列细胞代谢的主动过程，在放射生物学领域内，对细胞凋亡的研究大多集中在X射线及γ射线外照射方面。有报道2～30Gy剂量的外照射引起Molt-4细胞凋亡与坏死，而且凋亡的Molt-4细胞DNA不呈现阶梯状电泳带[5]。我们的观察则显示，0.49mGy的235U内照射即可诱发Molt-4和Ana-1细胞的凋亡，并且凋亡细胞的DNA呈现出阶梯状电泳条带。这可能表明细胞死亡形式除与辐射剂量有关外还与不同的辐射形式有关，事实上内照射核素可通过细胞膜及核膜沉积于胞浆和胞核内，使其辐射作用具有持续性和效应的累积性[6]，因此它们诱发细胞凋亡所需的辐射剂量，诱发凋亡的途径及机制有别于外照射。
本实验放射性活度为235UO2F2贡献，235UO2F2作为化合物也具有一定的化学毒性，但是与放射性活度相比，实验用235UO2F2工作液中235UO2F2化合物的含量极低，因而我们认为对其细胞凋亡的诱导主要是辐射所至，但是不排除适当剂量的235UO2F2化合物诱发细胞凋亡的可能性，这有待于进一步研究。
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参考文献
1 Szumiel I.Ionizing radiation-induced cell death.Int J Radiat Biol,1994,66:329.
2 李士骏.电离辐射剂量学.北京：原子能出版社，1981，286.
3 Price P.McMillan TJ.Use of the tetrazolium assay in measuring the response of human tumor cells to ionizing radiation. Cancer Res,1990,50:1392.
4 Matzinger P.The JAM test:a simple assay for DNA fragmentation and cell death.J Immunol Method,1991,145:185.
5 Akagi Y.Ito K, Sawada S.Radiation induced apoptosis and necrosis in Molt-4 cells:a study of dose-effect relationships and their modification.Int J Radiat Biol,1993,64:47.
6 朱寿彭.放射毒理学. 北京：原子能出版社，1992，57.
(收稿：1997-12-22 修回：1998-04-25), 百拇医药