头颈部60钴照射豚鼠耳蜗毛细胞DNA损伤的检测
作者：张孝文 张承发 张建平 杜瀚
单位：435001 湖北省黄石市第一医院耳鼻咽喉-头颈外科(张孝文、张承发)；同济医科大学协和医院(张建平、杜瀚)
关键词：
由于耳颞部接受射线而出现感音性聋临床上较多见 由于耳颞部接受射线而出现感音性聋临床上较多见,我们采用60钴(60Co)照射豚鼠的耳颞区，对各组照射耳的耳蜗毛细胞进行DNA损伤检测，报告如下。
一、材料与方法
1.动物模型：选用耳廓反应灵敏,体重250～400 g的红目雌性豚鼠随机分成4组，即对照组(空白对照)、照射40 Gy组、70 Gy组、70 Gy后存活10周组，每组12只动物。应用 FCC-7000型同中心回转式60Co治疗机(山东产)进行照射。60Co照射豚鼠左侧耳颞区野宽3 cm，源皮距80 cm，辐射深度2.5 cm，每次辐射2 Gy，每周5次， 直至预定量40 Gy 及70 Gy。
, 百拇医药
2.毛细胞悬液制备:断头,迅速取照射耳颞骨于低温(4℃)充氧的外液中，在立体显微镜(XTL-1，北京)下游离基底膜，每4个耳为一组置入37℃预先充氧的胶原酶Ⅰ型(0.5 g/L, Sigma，美国)和牛血清白蛋白(2.0 g/L，上海生物技术有限公司)消化15分钟，吸出消化液， 用毛细胞外液(单位：mmol/L,成分：NaCl 137.0,KCl 5.4,CaCl2 1.3,MgCl2 0.9,Na2HPO4 0.4, KH2PO4 0.4,HEPES 5.0,葡萄糖 5.0)清洗标本两次，800 r/min离心后置入Hank液备用，取一滴悬液在显微镜下观察毛细胞的活性并计数。
3.单细胞凝胶电泳(single cell gelelectrophoresis)：在载玻片上将10 μl细胞悬液 ( 含细胞数10 000左右)包埋于低融点琼脂糖凝胶(终浓度0.5%～1.0%)中,在碱性裂解液[NaCl 2.5 mol/L, Na-乙二胺四乙酸(Na-EDTA) 100 mmol/L, Tris 10 mmol/L, pH值：10]中裂解1小时，裂解后将玻片置于水平电泳槽内,电泳缓冲液 (NaOH 10.3 mol/L,EDTA 1 mmol/L)超过胶面2.5 mm，解链20分钟，然后进行电泳， 电泳完毕后以0.4 mol/L Tris (pH值：7.5)冲洗3次，每次5分钟，然后再用溴化乙啶染色，在FX-35DX荧光显微镜(Nicon，日本)下观察，拍照。
, 百拇医药
4.DNA损伤的测量：DNA损伤后其电泳图像呈慧星样外观(Comet方法)。在400倍荧光显微镜下4耳共取100个图像，测量DNA迁移长度( image length,IL),取其平均值±标准差。 损伤程度分为3级：轻度损伤IL<40 μm(图1)，中度损伤IL=40～80 μm(图2)，重度损伤损伤IL>80 μm(图3)。
二、结果
豚鼠听泡约黄豆大,单耳内耳粘膜量少，因此取4耳为一组进行单细胞凝胶电泳,然后取其平均值±标准差,t检验进行统计学分析。结果：未照射的空白对照组毛细胞DNA损伤轻度(%)占90±2，中度占9±2，IL为22±1μm；40 Gy组毛细胞DNA损伤轻、中、重度(%)分别占70±5、19±5、4±1，IL为33±5 μm；70 Gy组DNA损伤轻、中、重度(%)分别占46±8、44±9、9±1，IL为53±13 μm；照射70 Gy后存活10周组DNA损伤轻、中、重度(%)分别占45±9、44±7、10±4，IL为56±14 μm。实验各组结果与对照组比较P<0.05或P<0.01，差异均有显著性。
, http://www.100md.com
三、讨论
电离辐射对DNA的损伤包括直接和间接两种。DNA 的损伤可造成染色体畸形、突变，细胞分裂受阻，导致细胞死亡。单细胞凝胶电泳又称Comet方法，是stling等[1]1984 年发明的一种单细胞DNA电泳技术，经过改进已成为一项日臻完善的定量检测DNA单或双链缺口的技术，具有样本需要量少，不需放射标记等优点。本实验结果表明：对照组与各照射组之间内耳毛细胞DNA的损伤经统计学处理差异均存在显著性 (P<0.05或0.01) 且随放射剂量的增加，DNA的损伤加重，甚至出现凋亡形态 (图4)。故认为，放射治疗后内耳毛细胞DNA损伤导致细胞凋亡是致聋的重要机制之一。
志谢 承蒙同济医科大学协和医院汪广平、孔维佳教授悉心指导
参考文献
1
stling O，Johnson KJ. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun， 1984，123：291-298.
(收稿：1997-07-07 修回：1998-03-20), 百拇医药
单位：435001 湖北省黄石市第一医院耳鼻咽喉-头颈外科(张孝文、张承发)；同济医科大学协和医院(张建平、杜瀚)
关键词：
由于耳颞部接受射线而出现感音性聋临床上较多见 由于耳颞部接受射线而出现感音性聋临床上较多见,我们采用60钴(60Co)照射豚鼠的耳颞区，对各组照射耳的耳蜗毛细胞进行DNA损伤检测，报告如下。
一、材料与方法
1.动物模型：选用耳廓反应灵敏,体重250～400 g的红目雌性豚鼠随机分成4组，即对照组(空白对照)、照射40 Gy组、70 Gy组、70 Gy后存活10周组，每组12只动物。应用 FCC-7000型同中心回转式60Co治疗机(山东产)进行照射。60Co照射豚鼠左侧耳颞区野宽3 cm，源皮距80 cm，辐射深度2.5 cm，每次辐射2 Gy，每周5次， 直至预定量40 Gy 及70 Gy。
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2.毛细胞悬液制备:断头,迅速取照射耳颞骨于低温(4℃)充氧的外液中，在立体显微镜(XTL-1，北京)下游离基底膜，每4个耳为一组置入37℃预先充氧的胶原酶Ⅰ型(0.5 g/L, Sigma，美国)和牛血清白蛋白(2.0 g/L，上海生物技术有限公司)消化15分钟，吸出消化液， 用毛细胞外液(单位：mmol/L,成分：NaCl 137.0,KCl 5.4,CaCl2 1.3,MgCl2 0.9,Na2HPO4 0.4, KH2PO4 0.4,HEPES 5.0,葡萄糖 5.0)清洗标本两次，800 r/min离心后置入Hank液备用，取一滴悬液在显微镜下观察毛细胞的活性并计数。
3.单细胞凝胶电泳(single cell gelelectrophoresis)：在载玻片上将10 μl细胞悬液 ( 含细胞数10 000左右)包埋于低融点琼脂糖凝胶(终浓度0.5%～1.0%)中,在碱性裂解液[NaCl 2.5 mol/L, Na-乙二胺四乙酸(Na-EDTA) 100 mmol/L, Tris 10 mmol/L, pH值：10]中裂解1小时，裂解后将玻片置于水平电泳槽内,电泳缓冲液 (NaOH 10.3 mol/L,EDTA 1 mmol/L)超过胶面2.5 mm，解链20分钟，然后进行电泳， 电泳完毕后以0.4 mol/L Tris (pH值：7.5)冲洗3次，每次5分钟，然后再用溴化乙啶染色，在FX-35DX荧光显微镜(Nicon，日本)下观察，拍照。
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4.DNA损伤的测量：DNA损伤后其电泳图像呈慧星样外观(Comet方法)。在400倍荧光显微镜下4耳共取100个图像，测量DNA迁移长度( image length,IL),取其平均值±标准差。 损伤程度分为3级：轻度损伤IL<40 μm(图1)，中度损伤IL=40～80 μm(图2)，重度损伤损伤IL>80 μm(图3)。
二、结果
豚鼠听泡约黄豆大,单耳内耳粘膜量少，因此取4耳为一组进行单细胞凝胶电泳,然后取其平均值±标准差,t检验进行统计学分析。结果：未照射的空白对照组毛细胞DNA损伤轻度(%)占90±2，中度占9±2，IL为22±1μm；40 Gy组毛细胞DNA损伤轻、中、重度(%)分别占70±5、19±5、4±1，IL为33±5 μm；70 Gy组DNA损伤轻、中、重度(%)分别占46±8、44±9、9±1，IL为53±13 μm；照射70 Gy后存活10周组DNA损伤轻、中、重度(%)分别占45±9、44±7、10±4，IL为56±14 μm。实验各组结果与对照组比较P<0.05或P<0.01，差异均有显著性。
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三、讨论
电离辐射对DNA的损伤包括直接和间接两种。DNA 的损伤可造成染色体畸形、突变，细胞分裂受阻，导致细胞死亡。单细胞凝胶电泳又称Comet方法，是stling等[1]1984 年发明的一种单细胞DNA电泳技术，经过改进已成为一项日臻完善的定量检测DNA单或双链缺口的技术，具有样本需要量少，不需放射标记等优点。本实验结果表明：对照组与各照射组之间内耳毛细胞DNA的损伤经统计学处理差异均存在显著性 (P<0.05或0.01) 且随放射剂量的增加，DNA的损伤加重，甚至出现凋亡形态 (图4)。故认为，放射治疗后内耳毛细胞DNA损伤导致细胞凋亡是致聋的重要机制之一。
志谢 承蒙同济医科大学协和医院汪广平、孔维佳教授悉心指导
参考文献
1
stling O，Johnson KJ. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun， 1984，123：291-298.(收稿：1997-07-07 修回：1998-03-20), 百拇医药