应用微型渗透压泵进行耳蜗慢性灌流的方法
作者：胡博华 Richard J.Salvi Donald Henderson
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科(胡博华)；美国纽约洲立布法罗大学听力研究中心(Richard J.Salvi,Donald Henderson)
关键词：耳蜗；渗透压；灌注；局部
中华耳鼻咽喉科杂志980312 【摘要】 目的 介绍微型渗透压泵进行耳蜗灌注的方法，达到耳蜗慢性给药。方法 将耳蜗埋置管置于5只灰鼠耳蜗底回鼓阶中，再将渗透压泵埋置于动物背部，利用泵内、外渗透压之差将泵内液体缓慢挤压释放。观察耳蜗灌流Hank液(3耳)和L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO) 液(2耳)对下丘电位和耳蜗毛细胞的影响。结果 应用渗透压泵耳蜗灌流Hank液后，下丘电位阈值维持正常，耳蜗毛细胞无损伤；灌流BSO液14天后，所测频率 (1、 2、 4和8 kHz)的下丘电位阈值平均升高28 dB，内耳毛细胞平均缺失39.3%，缺失分布于耳蜗各回，表明渗透压泵工作良好。结论 应用渗透压泵进行耳蜗灌流是一种慢性耳蜗给药的有效方法，灌流Hank液不会对耳蜗产生明显影响。
, 百拇医药
The technique of chronic infusion of drugs into the cochlea by an osmotic pump Hu Bohua*,Richard J. Salvi,Donald Henderson.*Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853
【Abstract】 Objective To introduce a method of chronic infusion of drugs into the cochlea using a osmotic pump. Methods A stainless steel tube was surgically implanted into the basal turn of the chinchilla cochlea and connected to the pump. To assess the reliability of the procedure, and the pump, Hank's solution or L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO) was infused into the cochlea by this pump and inferior colliculus (IC) potential and hair cell morphology were examined. Results In three Hank's solution infused cochleas, the thresholds of IC potential were kept in the normal level and no hair cell loss was found 14 days after the beginning of the infusion, suggested that the pump implantation and Hank's solution infusion had no significant effects on the cochlear functions. In contrast, threshold shifts of IC potentials and hair cell loss were found in two BSO infused animals, suggested that the infused solution had distributed into the whole cochlea. Conclusion This study indicates that the osmotic pump can be used in chronic delivery of experimental drugs into the cochlea.
, 百拇医药
【Key words】 Cochlea Osmotic pressure Perfusion, regional
耳蜗局部给药以往多采用圆窗给药、耳蜗骨壁钻孔灌流或耳蜗动脉灌流等方法[1,2]，不能长期慢性给药。我们采用耳蜗埋置微型渗透压泵的方法，达到长期慢性给药的目的，现报道如下。
材料和方法
1.动物:灰鼠5只，体重450～600 g。按常规方法安装双侧下丘电极[3]。下丘电位测试听力正常。3只动物右耳蜗灌入Hank液，2只动物右耳蜗灌入含L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO, 150 mol/L，Sigma Chemicals, 美国)的Hank液。
2.下丘电位测试方法:刺激声为短纯音(持续时间10 ms，上升、下降时间各5 ms)。刺激频率为1、2、4和 8 kHz。刺激强度为0～80 dB SPL, 间隔5 dB。下丘电位信号经放大 (20 000倍) 和滤波(100～3 000 Hz), 输入计算机。目测判断反应阈值。
, 百拇医药
3.微型渗透压泵准备:选用Alza 公司的2ML 4型渗透压泵，流速为5 μL/小时，灌流时间持续14天。在无菌条件下按渗透压泵使用说明将Hank液或含有150 mol/L BSO的Hank液灌入渗透压泵。为防止渗透压泵埋置后导管阻塞，泵体接导管后置于37℃恒温箱孵育24小时，以使渗透压泵在手术置管时已开始压出泵内液体。
4.耳蜗埋置管制作方法: 取12 mm长不锈钢细管(外径：0.4 mm，内径：0.2 mm)，内置外径为0.2 mm 、内径为0.1 mm的细钢管(Small Parts，美国)，顶部外露0.5 mm，用生物硅胶密封二管接口(图1A)。待生物硅胶固化后，超声清洗，高压蒸气消毒，灌入Hank液或BSO液备用。
5.手术方法:常规动物麻醉。按圆窗电极埋置方法作耳后切口，暴露听泡背侧。于听泡背侧开小孔，显露耳蜗底回。显微镜下用细针头在耳蜗底回钻直径约0.2 mm小孔，将已灌注入了Hank液的金属埋置管插入耳蜗鼓阶。稍用力按压埋置管，使埋置管顶部硅胶封闭耳蜗钻孔(图1B)。用牙托粉固定埋置管，封闭听泡小孔。将渗透压泵埋置于动物背部皮下，将其导管接已固定好的耳蜗埋置管。缝合切口。
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A 耳蜗埋置管示意 B 耳蜗置管位置 C 渗透压泵示意
图1 微型渗透压泵耳蜗埋置示意
6.术后观察:术后应用抗生素3天。分别于术后1、3、14天测量下丘电位，14天动物麻醉后断头，取出耳蜗，10%甲醛固定。琥珀酸脱氢酶(SDH)染色，光镜观察，计数毛细胞。
结果
1.术后动物一般情况良好，无食欲不佳、体重下降。
2.术后下丘电位测试结果:3只耳蜗灌流Hank液动物下丘平均电反应阈值于灌流后不同时间与正常状态时相比无明显变化(图2)。2只耳蜗灌流BSO液动物下丘平均电反应阈值与正常状态时相比明显提高，灌流后14天，所测频率 (1、2、4和8 kHz)的下丘电反应阈值平均提高28 dB(图3)。
, 百拇医药
3.病理检查结果:耳蜗持续灌流14天后，中耳检查除1只动物有轻度的分泌性中耳炎外，其余动物中耳正常。3只耳蜗灌流Hank液的动物灌流14天后耳蜗毛细胞SDH染色良好，无毛细胞缺失。2只耳蜗灌流BSO液灌流14天后耳蜗毛细胞有不同程度的缺失，毛细胞缺失分布于耳蜗各回，平均缺失率为39.3%(图4)。
图2 Hank液灌流后下丘平均电反应阈值(n=3)
图3 BSO液灌流后下丘平均电反应阈值(n=2)
图4 耳蜗灌流后内、外毛细胞缺失率
, 百拇医药 讨论
应用微型渗透压泵耳蜗灌流是近年开始应用的一种耳蜗局部给药方法[4]，它可以排除全身给药的副作用。通过更换渗透压泵体而保留耳蜗埋置管，还可以达到向耳蜗内灌流不同药物的目的，是内耳研究的一项重要技术。渗透压泵的工作原理十分简单：渗透压泵外面包以半透膜，其内层为含有渗透压高于组织液的内置液，中心为储存灌流液的储液囊。当渗透压泵埋入体内后，因半透膜内的内置液渗透压高于组织液渗透压，将半透膜外的组织液吸入，挤压泵体中心的储液囊，将囊内药液压出泵体 (图1C)。
良好的渗透压泵工作状态和尽可能小的耳蜗创伤是本方法成功的关键。手术埋置灌流管的难点之一是防止外淋巴自埋置管与耳蜗钻孔之间缝隙外渗。因硅胶凝固后仍十分柔软，本实验借用粘封埋置管前口的硅胶，将耳蜗上小孔十分紧密地封住，达到防止鼓阶外淋巴外渗的目的。
本实验将耳蜗埋置管设计为内、外管式。其优点是：内管管径细，对耳蜗损伤小；外管管径粗，前端可防止内管插入耳蜗过深，后端便于与软管相接。
, 百拇医药
以往耳蜗外淋巴灌流液多选用人工外淋巴液，配制较为繁琐。本实验采用商品Hank液替代人工外淋巴液。耳蜗生理和病理检查结果表明Hank液对耳蜗生理功能和形态无明显影响。其原因可能为渗透压泵的流量小，灌入的Hank液占外淋巴比例少，当Hank液与内耳外淋巴混合后，不至引起耳蜗生理功能和形态改变。
BSO是谷胱甘肽半胱氨酸合成酶抑制剂，可抑制毛细胞内谷胱甘肽的合成，破坏毛细胞内抗氧化物酶的作用。本实验应用BSO破坏耳蜗毛细胞，以观察渗透压泵灌入液体在耳蜗内的作用范围。如图4所示，灌入BSO液后，耳蜗各回毛细胞均有不同程度的缺失，说明灌流的液体可达耳蜗各回。
目前应用渗透压泵还存在一些问题，如因微型渗透压泵不可重复使用，实验费用较高；手术安装耳蜗灌流管和渗透压泵较为复杂；由于渗透压泵的给药速率和给药量是由厂商提供的不同型号渗透压泵所决定，实验者没有太多的选择。尽管如此，本项技术仍不失为一种耳蜗慢性给药的好方法。
, 百拇医药
参考文献
1Hu BH, Zheng XY, McFadden SL, et al. R-PIA attenuates noise-induced hearing loss in the chinchilla. Hear Res, 1997, 113: 198-206.
2丁大连，金晓杰，赵纪余.卡那霉素在耳蜗基底膜细胞中的积聚部位. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1995, 30: 323-325.
3Henderson D, Hamernik RP, Sitler RW, et al. Evoked-response audibility curve in the chinchilla. J Acoust Soc Am, 1973, 55: 1099-1101.
4Brown JN, Miller JM, Altschuler RA, et al. Osmotic pump implant for chronic infusion of drugs into the inner ear. Hear Res, 1993, 70: 167-172.
(收稿：1997-10-23 修回：1997-12-28), http://www.100md.com
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科(胡博华)；美国纽约洲立布法罗大学听力研究中心(Richard J.Salvi,Donald Henderson)
关键词：耳蜗；渗透压；灌注；局部
中华耳鼻咽喉科杂志980312 【摘要】 目的 介绍微型渗透压泵进行耳蜗灌注的方法，达到耳蜗慢性给药。方法 将耳蜗埋置管置于5只灰鼠耳蜗底回鼓阶中，再将渗透压泵埋置于动物背部，利用泵内、外渗透压之差将泵内液体缓慢挤压释放。观察耳蜗灌流Hank液(3耳)和L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO) 液(2耳)对下丘电位和耳蜗毛细胞的影响。结果 应用渗透压泵耳蜗灌流Hank液后，下丘电位阈值维持正常，耳蜗毛细胞无损伤；灌流BSO液14天后，所测频率 (1、 2、 4和8 kHz)的下丘电位阈值平均升高28 dB，内耳毛细胞平均缺失39.3%，缺失分布于耳蜗各回，表明渗透压泵工作良好。结论 应用渗透压泵进行耳蜗灌流是一种慢性耳蜗给药的有效方法，灌流Hank液不会对耳蜗产生明显影响。
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The technique of chronic infusion of drugs into the cochlea by an osmotic pump Hu Bohua*,Richard J. Salvi,Donald Henderson.*Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853
【Abstract】 Objective To introduce a method of chronic infusion of drugs into the cochlea using a osmotic pump. Methods A stainless steel tube was surgically implanted into the basal turn of the chinchilla cochlea and connected to the pump. To assess the reliability of the procedure, and the pump, Hank's solution or L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO) was infused into the cochlea by this pump and inferior colliculus (IC) potential and hair cell morphology were examined. Results In three Hank's solution infused cochleas, the thresholds of IC potential were kept in the normal level and no hair cell loss was found 14 days after the beginning of the infusion, suggested that the pump implantation and Hank's solution infusion had no significant effects on the cochlear functions. In contrast, threshold shifts of IC potentials and hair cell loss were found in two BSO infused animals, suggested that the infused solution had distributed into the whole cochlea. Conclusion This study indicates that the osmotic pump can be used in chronic delivery of experimental drugs into the cochlea.
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【Key words】 Cochlea Osmotic pressure Perfusion, regional
耳蜗局部给药以往多采用圆窗给药、耳蜗骨壁钻孔灌流或耳蜗动脉灌流等方法[1,2]，不能长期慢性给药。我们采用耳蜗埋置微型渗透压泵的方法，达到长期慢性给药的目的，现报道如下。
材料和方法
1.动物:灰鼠5只，体重450～600 g。按常规方法安装双侧下丘电极[3]。下丘电位测试听力正常。3只动物右耳蜗灌入Hank液，2只动物右耳蜗灌入含L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO, 150 mol/L，Sigma Chemicals, 美国)的Hank液。
2.下丘电位测试方法:刺激声为短纯音(持续时间10 ms，上升、下降时间各5 ms)。刺激频率为1、2、4和 8 kHz。刺激强度为0～80 dB SPL, 间隔5 dB。下丘电位信号经放大 (20 000倍) 和滤波(100～3 000 Hz), 输入计算机。目测判断反应阈值。
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3.微型渗透压泵准备:选用Alza 公司的2ML 4型渗透压泵，流速为5 μL/小时，灌流时间持续14天。在无菌条件下按渗透压泵使用说明将Hank液或含有150 mol/L BSO的Hank液灌入渗透压泵。为防止渗透压泵埋置后导管阻塞，泵体接导管后置于37℃恒温箱孵育24小时，以使渗透压泵在手术置管时已开始压出泵内液体。
4.耳蜗埋置管制作方法: 取12 mm长不锈钢细管(外径：0.4 mm，内径：0.2 mm)，内置外径为0.2 mm 、内径为0.1 mm的细钢管(Small Parts，美国)，顶部外露0.5 mm，用生物硅胶密封二管接口(图1A)。待生物硅胶固化后，超声清洗，高压蒸气消毒，灌入Hank液或BSO液备用。
5.手术方法:常规动物麻醉。按圆窗电极埋置方法作耳后切口，暴露听泡背侧。于听泡背侧开小孔，显露耳蜗底回。显微镜下用细针头在耳蜗底回钻直径约0.2 mm小孔，将已灌注入了Hank液的金属埋置管插入耳蜗鼓阶。稍用力按压埋置管，使埋置管顶部硅胶封闭耳蜗钻孔(图1B)。用牙托粉固定埋置管，封闭听泡小孔。将渗透压泵埋置于动物背部皮下，将其导管接已固定好的耳蜗埋置管。缝合切口。
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A 耳蜗埋置管示意 B 耳蜗置管位置 C 渗透压泵示意
图1 微型渗透压泵耳蜗埋置示意
6.术后观察:术后应用抗生素3天。分别于术后1、3、14天测量下丘电位，14天动物麻醉后断头，取出耳蜗，10%甲醛固定。琥珀酸脱氢酶(SDH)染色，光镜观察，计数毛细胞。
结果
1.术后动物一般情况良好，无食欲不佳、体重下降。
2.术后下丘电位测试结果:3只耳蜗灌流Hank液动物下丘平均电反应阈值于灌流后不同时间与正常状态时相比无明显变化(图2)。2只耳蜗灌流BSO液动物下丘平均电反应阈值与正常状态时相比明显提高，灌流后14天，所测频率 (1、2、4和8 kHz)的下丘电反应阈值平均提高28 dB(图3)。
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3.病理检查结果:耳蜗持续灌流14天后，中耳检查除1只动物有轻度的分泌性中耳炎外，其余动物中耳正常。3只耳蜗灌流Hank液的动物灌流14天后耳蜗毛细胞SDH染色良好，无毛细胞缺失。2只耳蜗灌流BSO液灌流14天后耳蜗毛细胞有不同程度的缺失，毛细胞缺失分布于耳蜗各回，平均缺失率为39.3%(图4)。
图2 Hank液灌流后下丘平均电反应阈值(n=3)
图3 BSO液灌流后下丘平均电反应阈值(n=2)
图4 耳蜗灌流后内、外毛细胞缺失率
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应用微型渗透压泵耳蜗灌流是近年开始应用的一种耳蜗局部给药方法[4]，它可以排除全身给药的副作用。通过更换渗透压泵体而保留耳蜗埋置管，还可以达到向耳蜗内灌流不同药物的目的，是内耳研究的一项重要技术。渗透压泵的工作原理十分简单：渗透压泵外面包以半透膜，其内层为含有渗透压高于组织液的内置液，中心为储存灌流液的储液囊。当渗透压泵埋入体内后，因半透膜内的内置液渗透压高于组织液渗透压，将半透膜外的组织液吸入，挤压泵体中心的储液囊，将囊内药液压出泵体 (图1C)。
良好的渗透压泵工作状态和尽可能小的耳蜗创伤是本方法成功的关键。手术埋置灌流管的难点之一是防止外淋巴自埋置管与耳蜗钻孔之间缝隙外渗。因硅胶凝固后仍十分柔软，本实验借用粘封埋置管前口的硅胶，将耳蜗上小孔十分紧密地封住，达到防止鼓阶外淋巴外渗的目的。
本实验将耳蜗埋置管设计为内、外管式。其优点是：内管管径细，对耳蜗损伤小；外管管径粗，前端可防止内管插入耳蜗过深，后端便于与软管相接。
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以往耳蜗外淋巴灌流液多选用人工外淋巴液，配制较为繁琐。本实验采用商品Hank液替代人工外淋巴液。耳蜗生理和病理检查结果表明Hank液对耳蜗生理功能和形态无明显影响。其原因可能为渗透压泵的流量小，灌入的Hank液占外淋巴比例少，当Hank液与内耳外淋巴混合后，不至引起耳蜗生理功能和形态改变。
BSO是谷胱甘肽半胱氨酸合成酶抑制剂，可抑制毛细胞内谷胱甘肽的合成，破坏毛细胞内抗氧化物酶的作用。本实验应用BSO破坏耳蜗毛细胞，以观察渗透压泵灌入液体在耳蜗内的作用范围。如图4所示，灌入BSO液后，耳蜗各回毛细胞均有不同程度的缺失，说明灌流的液体可达耳蜗各回。
目前应用渗透压泵还存在一些问题，如因微型渗透压泵不可重复使用，实验费用较高；手术安装耳蜗灌流管和渗透压泵较为复杂；由于渗透压泵的给药速率和给药量是由厂商提供的不同型号渗透压泵所决定，实验者没有太多的选择。尽管如此，本项技术仍不失为一种耳蜗慢性给药的好方法。
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参考文献
1Hu BH, Zheng XY, McFadden SL, et al. R-PIA attenuates noise-induced hearing loss in the chinchilla. Hear Res, 1997, 113: 198-206.
2丁大连，金晓杰，赵纪余.卡那霉素在耳蜗基底膜细胞中的积聚部位. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1995, 30: 323-325.
3Henderson D, Hamernik RP, Sitler RW, et al. Evoked-response audibility curve in the chinchilla. J Acoust Soc Am, 1973, 55: 1099-1101.
4Brown JN, Miller JM, Altschuler RA, et al. Osmotic pump implant for chronic infusion of drugs into the inner ear. Hear Res, 1993, 70: 167-172.
(收稿：1997-10-23 修回：1997-12-28), http://www.100md.com