流感嗜血杆菌b型与急性呼吸道感染关系的研究
作者：刘秀云 江载芳 杨永弘 张桂荣 傅曙光 王雪莲 姚德秀 江沁波
单位：作者单位：100045 北京，首都医科大学附属北京儿童医院内科
关键词：嗜血菌；流感；；；急性呼吸道感染；；嗜血菌感染
论 著 A study on the relationship between Haemophilus influenzae b and
acute respiratory infection
刘秀云 江载芳 杨永弘 张桂荣 傅曙光 王雪莲 姚德秀 江沁波
Liu Xiuyun, Jiang Zaifang, Yang Yonghong, et al
, 百拇医药
【摘要】 目的 进一步了解急性呼吸道感染中流感嗜血杆菌(HI)感染的发病情况。
方法 采用单克隆抗体夹心酶联免疫吸咐法，对36例上呼吸道感染、32例支气管炎、70例肺炎患儿及45例健康对照组的血、尿进行b型HI外膜蛋白(Hib OMP)抗原的检测，并对70例肺炎患儿的血清进行Hib OMP抗体检测。结果 36例上呼吸道感染患儿中有4例为Hib OMP抗体阳性，32例支气管肺炎患儿中有4例阳性，70例肺炎患儿中有18例为阳性；45例健康对照组中仅1例为Hib OMP抗原阳性。肺炎组抗原检出率高于对照组(c2=10.960,P〈0.01)。70例肺炎中18例Hib OMP抗体阳性。抗原、抗体检测共有24例(包括抗原、抗体均阳性12例，仅抗原或抗体阳性各6例)肺炎获得阳性结果。结论 11.1%的上呼吸道感染、12.5%支气管炎和34.3%的肺炎患儿为Hib感染；抗原、抗体联合检测可使Hib检出率提高。
A study on the relationship between Haemophilus influenzae b and acute respiratory
, http://www.100md.com
infection Liu Xiuyun, Jiang Zaifang, Yang Yonghong, et al. Beijing Children′s Hospital
Affiliated to Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045
【Abstract】 Objective To study the role of Haemophilus influenzae (HI) in the acute
respiratory tract infection. Methods The Mab-enzyme linked immunosorbent assay was
used to detect Haemophilus influenzae type b outer membrane protein (Hib OMP) antigen
, http://www.100md.com
in the serum and urine of 70 cases of pneumonia, 32 cases of brochitis, 36 cases of acute
upper respiratory tract infection, and 45 healthy controls. Patients with pneumonia were
further studied by the assay of Hib OMP antibody. Results Eighteen out of 70 cases of
pneumonia, 4 out of 32 cases of bronchitis and 4 out of the 36 cases of acute upper respiratorytract infection were Hib OMP antigen positive. However, only 1 out of 45 healthy controls was Hib OMP antigen positive. The positive rate for Hib antigen in cases of pneumonia was much higher than that of healthy controls (c2=10.960, P〈0.01). By means of Hib OMP antibody assay, 18/70(25.7%) cases of pneunmonia were found positive. A total of 24 cases of pneumonia including 12 cases had both positive Hib OMP antigen and its antibody, 6 cases positive Hib OMP antigen only and another 6 positive Hib OMP antibody only were revealed to have HI infection. Conclusion 11.1% of cases of upper respiratory tract infection, 12.5% of cases of bronchitis and 34.3% of cases of pneumonia had Hib infection. A combined application of Hib OMP antibody and antigen detection can enhance the detective rate of Hib infection.
, http://www.100md.com
【Key words】 Haemophilus influenzae Acute respiratory tract infections Haemophilus infections
流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae, HI)是急性呼吸道感染(ARI)中最常见
的细菌病原之一。1984年报道HI在发展中国家小儿急性下呼吸道感染(ALRI)中分离率高达45%[1]，近年来，发展中国家报道HI所致的ARI并不少见[2，3]。国内对ARI的细菌病原学研究相对薄弱，有关在ARI中HI感染的发病情况尚缺乏确切的流行病学资料。为此，我们进行了ARI(包括上呼吸道感染、支气管炎、肺炎)中b型流感嗜血杆菌(Hib)致病情况的研究。
对象和方法
, http://www.100md.com 一、研究对象
依制订的临床诊断标准[4]，于1994年12月～1995年5月，在北京儿童医院病
房和门诊选择5岁以下(新生儿除外)、起病1周以内的ARI患儿138例。其中，肺炎(包括6例毛细支气管炎)70例，平均年龄1岁6月(2月～5岁)；支气管炎32例，平均年龄为1岁10月(3个月～5岁)；上呼吸道感染36例，平均年龄为2岁(5个月～5岁)。138例患儿中男91例，女47例。患儿组取血前均用抗生素超过24小时。同时选择45例5岁以下(新生儿除外)健康儿童为对照组，男24例，女21例，平均年龄为2岁(4个月～5岁)。
二、标本的收集和处理
1.血：于入院当时或门诊初诊时经严格无菌操作抽取受检者静脉血3ml，放入含有30～50ml HI特殊培养基的瓶内。并立即转至CO2孵箱内培养。同时取2ml静脉血离心，留血清置-30℃冰箱内保存待检。出院时留第2份血清。第1份血清均取自发病3～7天(平均4天)，第2份血清取自起病的2～3周。双份血清间隔时间为7～14天(平均12天)。
, http://www.100md.com
2.咽分泌物：于入院当时或门诊初诊时取受检者咽后壁和两侧扁桃体区分泌物，放入含X、V因子的培养基肉汤中做咽分泌物培养[5]。标本在1小时内转入CO2孵箱内，增菌16～18小时，增菌液变混浊后转种至培养皿。
3.尿：收集入院24小时内或初诊当天的尿液30～50ml，置透析袋内用聚乙二醇
浓缩25～50倍，置-30℃冰箱保存待检。
三、实验方法
1.细菌培养及鉴定：用含有Levinthol原液的特殊HI培养基进行咽分泌物、血细
菌培养，对所得可疑的透明菌落进一步分纯，以卫星试验及X、V因子需要试验来鉴
定HI。进一步血清分型采用Hib抗血清、a～f多价抗血清。若与Hib抗血清凝集者为Hib菌株。
, 百拇医药
2.Hib外膜蛋白(OMP)抗原检测法：采用两种单克隆抗体夹心的酶联免疫吸附法
(ELISA)检测Hib OMP抗原。由于单克隆抗体P2-18可识别到目前为止所有的HI，且亲和力较强[6]；P2-4仅可识别Hib菌株[7，8]。两种针对不同抗原决定簇的单克隆抗体联合应用可提高检测的敏感性。因此，选用P2-18作为包被抗体，P2-4作为酶标抗体。对受检者的血、尿进行检测。血或尿任一阳性即为Hib感染证据。
3.Hib OMP抗体测定：采用Scarcosyl方法提取Hib菌的外膜蛋白，以国际标准
株6880的OMP与临床分离株C44的OMP进行混合作为包被抗原，用间接ELISA法测定其
特异性抗体IgG、IgM。以急性期血清抗体IgM水平高于同年龄±2s及双份血清抗体3倍以上增高为产生抗体反应的阳性标准。抗原或抗体反应任一阳性即为Hib感染。
, 百拇医药
结 果
一、Hib细菌培养结果(表1)
138例ARI患儿中无1例血培养分离出Hib，咽分泌物培养在对照组与患儿组之
间Hib的分离率的差异无显著意义(c2=1.039,P>0.05)。
二、Hib OMP抗原检测结果(表2)
经c2检验，各组间Hib OMP抗原检出率的差异具非常显著意义(c2=12.814,P〈0.01)，两两比较，肺炎组与对照组的Hib OMP抗原检出率的差异具有显著意义(c2=10.960,P〈0.01)。
表1 各组Hib细菌培养的结果
, 百拇医药
分组
总例数
血培养阳性数
咽分泌物培养
阳性数
率(%)
对照组
45
1
2.2
上感组
36
0
, 百拇医药
2
5.5
支气管炎组
32
0
1
3.1
肺炎组
70
0
4
5.7
表2 ELISA法检测Hib OMP抗原的结果
, 百拇医药
组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
对照组
45
1
2.2
ARI组
(138)
(26)
(18.8)
上感组
, 百拇医药
36
4
11.1
支气管炎组
32
4
12.5
肺炎组
70
18
25.7
组间比较c2值
12.814*
, http://www.100md.com
* P〈0.01
三、Hib OMP抗体测定的结果
70例肺炎患儿中有19例测出了Hib OMP抗体，除1例查出非b型的HI抗原系交叉反应所致外，余18例(25.7%)可确证为Hib感染，其中12例同时检出Hib OMP抗原，6例未查到Hib OMP抗原。
结合抗原、抗体测定的结果，24例肺炎患儿确定了Hib感染的诊断(34.3%，包括
抗原、抗体共同阳性12例，仅Hib OMP抗原和Hib OMP特异抗体反应阳性各6例)。
讨 论
HI和肺炎链球菌既是呼吸道的正常菌群，又是ARI的最常见的致病菌。因而，咽分泌物培养不能代表下呼吸道感染的致病菌。痰标本在5岁以内小儿又不易获得。血培养特异性强，敏感性差，ARI时很难得到阳性的血培养结果。本组138例ARI中无1例血培养分离出HI，可能与取血前受检者均用过抗生素致细菌死亡有关。细菌抗原检测为ARI的细菌病原学诊断提供了新的途径。与血培养相比其敏感性较高。单克隆抗体使其特异性大大提高[9]。我们应用两种识别不同抗原位点的单克隆抗体建立了双抗体夹心的ELISA方法，其检测各种ARI中Hib OMP抗原的检出率依次为：上呼吸道感染为11.1%，支气管炎为12.5%，肺炎25.7%，以肺炎的为最高。而健康对照组仅2.2%。表明Hib感染在小儿肺炎中占重要地位。
, http://www.100md.com
如果抗原、抗体联合检测，70例肺炎患儿中24例(34.3%)体内存在Hib感染的证据，因此，联合抗原、抗体测定可进一步提高呼吸道感染患儿中Hib感染的检出率。
志谢 本研究在完成过程中得到加拿大Quebec大学Hamel博士提供的单克隆抗体，同时得到儿童医院内十病房、微生物室全体同志的大力协助，谨致谢忱
参考文献
1Shan F, Gratten M, Germer S, et al. Aetiology of pneumonia in children in coroka
hospital, papua new guinea. Lancet, 1984,8:537-541.
2Forgie IM, O′Neill KP, Lloyd-Evans N, et al. Etiology of acute lower respirtory
, http://www.100md.com
tract infection in Gambian children: I. acute lower respiratory infections in infants presenting
at hospitol. Pediatr Infect Dis J, 1991,10:33-41.
3Ghafoor A, Nomani NK, Ishaq Z, et al. Diagnosis of actue lower respirtory tract
infections in children in Rawalpindi and Islamabad, Pakistan. Rev Infect Dis, 1990,12(Suppl 8):907-914.
4吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编.诸福棠实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社，1995，1132-1150.
, 百拇医药
5付曙光，沈叙庄，张桂荣.细菌性脑膜炎培养基的选择和制备.生物制品学杂志，1990，3：189.
6Hamel J, Dugourd D, Martin D, et al. Localization of conserved B-cell epitopes among
encapsulated and nonencapsulated Haemonphilus influenzae P2 porin proteins using synthetic
peptides. J Gen Micro, 1992,138:161-168.
7Martin D, Munson R, Jr, Grass S, et al. Mapping of B-cell epitopes on the outer membrane
, 百拇医药
P2 porin protein of Haemophilus infuenzae by using recombinant proteins and synthetic peptides.
Infect Immun, 1991,59:1457-1464.
8Martin D, Hamel J, Brodeur BR, et al. Antigenic relationships among the porin proteins of
encapsulated Haemophilus influenzae clones. J Clin Micro, 1990,28:1720-1724.
9Belmeanza A, Hamel J, Mousseau S, et al. Rapid diagnosis of severa Haemophilus influenzae
serotype b infection by monoclonal antibody enzyme immunassay for outer membrane protiens.
J Clin Micro, 1986,24:440-445.
(收稿：1996-10-17 修回：1997-09-30), 百拇医药
单位：作者单位：100045 北京，首都医科大学附属北京儿童医院内科
关键词：嗜血菌；流感；；；急性呼吸道感染；；嗜血菌感染
论 著 A study on the relationship between Haemophilus influenzae b and
acute respiratory infection
刘秀云 江载芳 杨永弘 张桂荣 傅曙光 王雪莲 姚德秀 江沁波
Liu Xiuyun, Jiang Zaifang, Yang Yonghong, et al
, 百拇医药
【摘要】 目的 进一步了解急性呼吸道感染中流感嗜血杆菌(HI)感染的发病情况。
方法 采用单克隆抗体夹心酶联免疫吸咐法，对36例上呼吸道感染、32例支气管炎、70例肺炎患儿及45例健康对照组的血、尿进行b型HI外膜蛋白(Hib OMP)抗原的检测，并对70例肺炎患儿的血清进行Hib OMP抗体检测。结果 36例上呼吸道感染患儿中有4例为Hib OMP抗体阳性，32例支气管肺炎患儿中有4例阳性，70例肺炎患儿中有18例为阳性；45例健康对照组中仅1例为Hib OMP抗原阳性。肺炎组抗原检出率高于对照组(c2=10.960,P〈0.01)。70例肺炎中18例Hib OMP抗体阳性。抗原、抗体检测共有24例(包括抗原、抗体均阳性12例，仅抗原或抗体阳性各6例)肺炎获得阳性结果。结论 11.1%的上呼吸道感染、12.5%支气管炎和34.3%的肺炎患儿为Hib感染；抗原、抗体联合检测可使Hib检出率提高。
A study on the relationship between Haemophilus influenzae b and acute respiratory
, http://www.100md.com
infection Liu Xiuyun, Jiang Zaifang, Yang Yonghong, et al. Beijing Children′s Hospital
Affiliated to Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045
【Abstract】 Objective To study the role of Haemophilus influenzae (HI) in the acute
respiratory tract infection. Methods The Mab-enzyme linked immunosorbent assay was
used to detect Haemophilus influenzae type b outer membrane protein (Hib OMP) antigen
, http://www.100md.com
in the serum and urine of 70 cases of pneumonia, 32 cases of brochitis, 36 cases of acute
upper respiratory tract infection, and 45 healthy controls. Patients with pneumonia were
further studied by the assay of Hib OMP antibody. Results Eighteen out of 70 cases of
pneumonia, 4 out of 32 cases of bronchitis and 4 out of the 36 cases of acute upper respiratorytract infection were Hib OMP antigen positive. However, only 1 out of 45 healthy controls was Hib OMP antigen positive. The positive rate for Hib antigen in cases of pneumonia was much higher than that of healthy controls (c2=10.960, P〈0.01). By means of Hib OMP antibody assay, 18/70(25.7%) cases of pneunmonia were found positive. A total of 24 cases of pneumonia including 12 cases had both positive Hib OMP antigen and its antibody, 6 cases positive Hib OMP antigen only and another 6 positive Hib OMP antibody only were revealed to have HI infection. Conclusion 11.1% of cases of upper respiratory tract infection, 12.5% of cases of bronchitis and 34.3% of cases of pneumonia had Hib infection. A combined application of Hib OMP antibody and antigen detection can enhance the detective rate of Hib infection.
, http://www.100md.com
【Key words】 Haemophilus influenzae Acute respiratory tract infections Haemophilus infections
流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae, HI)是急性呼吸道感染(ARI)中最常见
的细菌病原之一。1984年报道HI在发展中国家小儿急性下呼吸道感染(ALRI)中分离率高达45%[1]，近年来，发展中国家报道HI所致的ARI并不少见[2，3]。国内对ARI的细菌病原学研究相对薄弱，有关在ARI中HI感染的发病情况尚缺乏确切的流行病学资料。为此，我们进行了ARI(包括上呼吸道感染、支气管炎、肺炎)中b型流感嗜血杆菌(Hib)致病情况的研究。
对象和方法
, http://www.100md.com 一、研究对象
依制订的临床诊断标准[4]，于1994年12月～1995年5月，在北京儿童医院病
房和门诊选择5岁以下(新生儿除外)、起病1周以内的ARI患儿138例。其中，肺炎(包括6例毛细支气管炎)70例，平均年龄1岁6月(2月～5岁)；支气管炎32例，平均年龄为1岁10月(3个月～5岁)；上呼吸道感染36例，平均年龄为2岁(5个月～5岁)。138例患儿中男91例，女47例。患儿组取血前均用抗生素超过24小时。同时选择45例5岁以下(新生儿除外)健康儿童为对照组，男24例，女21例，平均年龄为2岁(4个月～5岁)。
二、标本的收集和处理
1.血：于入院当时或门诊初诊时经严格无菌操作抽取受检者静脉血3ml，放入含有30～50ml HI特殊培养基的瓶内。并立即转至CO2孵箱内培养。同时取2ml静脉血离心，留血清置-30℃冰箱内保存待检。出院时留第2份血清。第1份血清均取自发病3～7天(平均4天)，第2份血清取自起病的2～3周。双份血清间隔时间为7～14天(平均12天)。
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2.咽分泌物：于入院当时或门诊初诊时取受检者咽后壁和两侧扁桃体区分泌物，放入含X、V因子的培养基肉汤中做咽分泌物培养[5]。标本在1小时内转入CO2孵箱内，增菌16～18小时，增菌液变混浊后转种至培养皿。
3.尿：收集入院24小时内或初诊当天的尿液30～50ml，置透析袋内用聚乙二醇
浓缩25～50倍，置-30℃冰箱保存待检。
三、实验方法
1.细菌培养及鉴定：用含有Levinthol原液的特殊HI培养基进行咽分泌物、血细
菌培养，对所得可疑的透明菌落进一步分纯，以卫星试验及X、V因子需要试验来鉴
定HI。进一步血清分型采用Hib抗血清、a～f多价抗血清。若与Hib抗血清凝集者为Hib菌株。
, 百拇医药
2.Hib外膜蛋白(OMP)抗原检测法：采用两种单克隆抗体夹心的酶联免疫吸附法
(ELISA)检测Hib OMP抗原。由于单克隆抗体P2-18可识别到目前为止所有的HI，且亲和力较强[6]；P2-4仅可识别Hib菌株[7，8]。两种针对不同抗原决定簇的单克隆抗体联合应用可提高检测的敏感性。因此，选用P2-18作为包被抗体，P2-4作为酶标抗体。对受检者的血、尿进行检测。血或尿任一阳性即为Hib感染证据。
3.Hib OMP抗体测定：采用Scarcosyl方法提取Hib菌的外膜蛋白，以国际标准
株6880的OMP与临床分离株C44的OMP进行混合作为包被抗原，用间接ELISA法测定其
特异性抗体IgG、IgM。以急性期血清抗体IgM水平高于同年龄±2s及双份血清抗体3倍以上增高为产生抗体反应的阳性标准。抗原或抗体反应任一阳性即为Hib感染。
, 百拇医药
结 果
一、Hib细菌培养结果(表1)
138例ARI患儿中无1例血培养分离出Hib，咽分泌物培养在对照组与患儿组之
间Hib的分离率的差异无显著意义(c2=1.039,P>0.05)。
二、Hib OMP抗原检测结果(表2)
经c2检验，各组间Hib OMP抗原检出率的差异具非常显著意义(c2=12.814,P〈0.01)，两两比较，肺炎组与对照组的Hib OMP抗原检出率的差异具有显著意义(c2=10.960,P〈0.01)。
表1 各组Hib细菌培养的结果
, 百拇医药
分组
总例数
血培养阳性数
咽分泌物培养
阳性数
率(%)
对照组
45
1
2.2
上感组
36
0
, 百拇医药
2
5.5
支气管炎组
32
0
1
3.1
肺炎组
70
0
4
5.7
表2 ELISA法检测Hib OMP抗原的结果
, 百拇医药
组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
对照组
45
1
2.2
ARI组
(138)
(26)
(18.8)
上感组
, 百拇医药
36
4
11.1
支气管炎组
32
4
12.5
肺炎组
70
18
25.7
组间比较c2值
12.814*
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* P〈0.01
三、Hib OMP抗体测定的结果
70例肺炎患儿中有19例测出了Hib OMP抗体，除1例查出非b型的HI抗原系交叉反应所致外，余18例(25.7%)可确证为Hib感染，其中12例同时检出Hib OMP抗原，6例未查到Hib OMP抗原。
结合抗原、抗体测定的结果，24例肺炎患儿确定了Hib感染的诊断(34.3%，包括
抗原、抗体共同阳性12例，仅Hib OMP抗原和Hib OMP特异抗体反应阳性各6例)。
讨 论
HI和肺炎链球菌既是呼吸道的正常菌群，又是ARI的最常见的致病菌。因而，咽分泌物培养不能代表下呼吸道感染的致病菌。痰标本在5岁以内小儿又不易获得。血培养特异性强，敏感性差，ARI时很难得到阳性的血培养结果。本组138例ARI中无1例血培养分离出HI，可能与取血前受检者均用过抗生素致细菌死亡有关。细菌抗原检测为ARI的细菌病原学诊断提供了新的途径。与血培养相比其敏感性较高。单克隆抗体使其特异性大大提高[9]。我们应用两种识别不同抗原位点的单克隆抗体建立了双抗体夹心的ELISA方法，其检测各种ARI中Hib OMP抗原的检出率依次为：上呼吸道感染为11.1%，支气管炎为12.5%，肺炎25.7%，以肺炎的为最高。而健康对照组仅2.2%。表明Hib感染在小儿肺炎中占重要地位。
, http://www.100md.com
如果抗原、抗体联合检测，70例肺炎患儿中24例(34.3%)体内存在Hib感染的证据，因此，联合抗原、抗体测定可进一步提高呼吸道感染患儿中Hib感染的检出率。
志谢 本研究在完成过程中得到加拿大Quebec大学Hamel博士提供的单克隆抗体，同时得到儿童医院内十病房、微生物室全体同志的大力协助，谨致谢忱
参考文献
1Shan F, Gratten M, Germer S, et al. Aetiology of pneumonia in children in coroka
hospital, papua new guinea. Lancet, 1984,8:537-541.
2Forgie IM, O′Neill KP, Lloyd-Evans N, et al. Etiology of acute lower respirtory
, http://www.100md.com
tract infection in Gambian children: I. acute lower respiratory infections in infants presenting
at hospitol. Pediatr Infect Dis J, 1991,10:33-41.
3Ghafoor A, Nomani NK, Ishaq Z, et al. Diagnosis of actue lower respirtory tract
infections in children in Rawalpindi and Islamabad, Pakistan. Rev Infect Dis, 1990,12(Suppl 8):907-914.
4吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编.诸福棠实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社，1995，1132-1150.
, 百拇医药
5付曙光，沈叙庄，张桂荣.细菌性脑膜炎培养基的选择和制备.生物制品学杂志，1990，3：189.
6Hamel J, Dugourd D, Martin D, et al. Localization of conserved B-cell epitopes among
encapsulated and nonencapsulated Haemonphilus influenzae P2 porin proteins using synthetic
peptides. J Gen Micro, 1992,138:161-168.
7Martin D, Munson R, Jr, Grass S, et al. Mapping of B-cell epitopes on the outer membrane
, 百拇医药
P2 porin protein of Haemophilus infuenzae by using recombinant proteins and synthetic peptides.
Infect Immun, 1991,59:1457-1464.
8Martin D, Hamel J, Brodeur BR, et al. Antigenic relationships among the porin proteins of
encapsulated Haemophilus influenzae clones. J Clin Micro, 1990,28:1720-1724.
9Belmeanza A, Hamel J, Mousseau S, et al. Rapid diagnosis of severa Haemophilus influenzae
serotype b infection by monoclonal antibody enzyme immunassay for outer membrane protiens.
J Clin Micro, 1986,24:440-445.
(收稿：1996-10-17 修回：1997-09-30), 百拇医药