多药耐药基因反义寡核苷酸体内逆转耐药的初步研究
作者：李惠芳 孙桂香 卢薇薇 于载泺
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：抗药性；多药；；；白血病；实验性；；寡核苷酸类；反义
论著 Reversal of multidrug resistance with mdr1 antisense oligodeoxynucleotides in vivo
Li Huifang, Sun Guixiang, Lu Weiwei, et al
【摘要】 目的 为研究多药耐药(multidrng resistance MDR)基因mdr1反义寡核苷酸体内逆转肿瘤耐药的作用。方法 采用白血病耐药细胞株细胞移植于胸腺缺陷裸小鼠(BALB/C)皮下，建立肿瘤耐药模型，局部或腹腔注射mdr1反义DNA，或以脂质体Lipofectin为载体，腹腔注射mdr1反义DNA，经柔红霉素(DNR)和鬼臼乙叉甙(VP-16)联合化疗。结果 实验组肿瘤生长速度明显低于对照组，从用药后的第5～6天开始，实验组肿瘤体积的增长速率也明显低于相应的对照组，以脂质体为载体的实验组，肿瘤生长出现了暂停的趋势。结论 mdr1反义寡核苷酸在动物体内具有耐药逆转的作用，脂质体能增强这些作用。
, 百拇医药
Reversal of multidrug resistance with mdr1 antisense oligodeoxynucleotides in vivo Li
Huifang, Sun Guixiang, Lu Weiwei, et al. Department of Pediatrics, The First Hospital of Beijing
Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To study the reversal of the multidrug resistance (MDR) in vivo by
MDR gene mdr1 antisense oligodeoxynucleotides. Methods The authors established a model
, 百拇医药
of nude mice which was transplanted with the leukemia resistant cell line HR-20. The mdr1 antisense
oligodeoxynucleotides were injected locally or intraperitoneally or injected with lipofectin. Results
After treatment by daunorubincin (DNR) and VP-16 the growth rate of the tumor in the experimental
groups significantly slowed down compared with that of controls. After 5 or 6 days of treatment, the
, 百拇医药
speed of growth of tumor′s size also slowed down compared with that of controls. The growth of
the tumor tended to suspend temporarily with lipofectin as a vector. Conclusion The results of this study
suggested that mdr1 antisense oligodeoxynucleotides, promoted by lipofectin, played a role in reversal of MDR.
【Key words】 Drug resistance, multiple Leukemia, experimental Oligonucleotides, untisense
, 百拇医药
多药耐药(MDR)的逆转研究始于本世纪80年代初。此后虽然许多体外研究显示，钙离子通道阻滞剂等药物有明显MDR逆转作用[1，2]，但体内研究结果仍不理想。近年来反义基因疗法，已在多个研究领域中取得初步成果[3，4]。以往我们已采用mdr1反义寡核苷酸(DNA)进行体外逆转肿瘤细胞株细胞的耐药特性的研究，在此基础上，现在又建立了裸小鼠肿瘤耐药模型，初步探讨了mdr1反义基因片段在体内对肿瘤耐药的逆转作用。
材料和方法
一、主要试剂
反义及正义DNA：人工合成并用硫甙修饰的20bp，互补于mdr1基因转录起始部位(美国Cybersyn公司)；脂质体采用Lipofectin(美国Sigma公司)。
, 百拇医药
二、裸小鼠
胸腺缺陷裸小鼠(BALB/c)由中国医学科学院动物研究所提供。雌性，6～8周龄。在空气层流架中带盖鼠笼内饲养。饮用水、专用饲料及其他动物接触物品均经灭菌处理。
三、细胞系
HR-20耐药细胞采由白血病细胞株HL-60经高三尖杉酯碱诱导而成。表达mdr1基因，由北京师范大学生物系提供。细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃，5%CO2的孵育箱中传代培养。
四、反义DNA与lipofectin(脂质体的一种)结合方法
取lipofectin原液50 μl加入RPMI-1640 200 μl中，反义DNA稀释于RPMI-1640 200 μl中，二者混合后，室温作用15分钟，直接注射于裸小鼠腹腔。
, 百拇医药
五、裸小鼠异种移植瘤动物模型的建立
取指数生长期HR-20细胞1×107/0.2 ml，直接接种于裸小鼠肋部皮下，于第7天即可见皮下肿瘤生长。共建模型动物44只，成瘤43只，成瘤率98%。每天测量肿瘤最长径(L)和与其垂直径长(D)，按下式计算肿瘤体积(V)：V=(π)/(6)LD2[5]。于接种细胞后第14天，肿瘤体积平均为406±151 mm3，即开始用药。此时为实验观测的第1天，持续观测肿瘤生长情况至第11天结束。
六、实验分组
实验组包括O1组：反义DNA局部注射，柔红霉素(DNR)和鬼臼乙叉甙(VP-16)联合化疗。O2组：反义DNA腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。OL组：将反义DNA结合脂质体Lipofectin一并腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。
, 百拇医药
对照组包括C1组：等量生理盐水腹腔注射。C2组：DNR和VP-16联合化疗。S1组：正义
DNA局部注射，DNR和VP-16联合化疗。S2组：正义DNA腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。L组：Lipofectin腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。
以上各组的DNA用量为30 μg/d，第1～3天；Lipofectin用量为50 μl/d，第1～3天；DNR用量为每天150 μg/m2(第2天)；每天VP-16用量为40 μg/m2，第2～4天。
七、统计学处理
采用秩和检验(mann-whitney)和随机区组的秩和检验(friedman)。数据操作在计算机上完成。
, 百拇医药
结 果
一、用药方式及药物本身对肿瘤生长的影响
1.DNA用药方式的影响作用：局部注射与腹腔注射DNA对肿瘤生长的作用无明显区别，而以lipofectin为载体组与单纯DNA腹腔注射组相比，后期肿瘤生长明显减慢(图1)，并于第6天，其差异具有显著意义(u=2.09,P?.05)。
2.单纯化疗的影响作用：对照组C2在应用DNR和VP-16后，肿瘤生长有所减慢，但与不用任何治疗的C1组相比，在整个观察期内，二者的差异均无显著意义。
3.脂质体对肿瘤的影响：单纯采 用lipofectin腹腔注射后(L组)，肿瘤生长状况与其他对照组之间无明显差异。
, 百拇医药
二、实验组与对照组间肿瘤生长状况的比较
1.肿瘤生长速度的比较：如附表所示，随时间的延长各组肿瘤体积逐渐增大。5个对照组肿瘤在整个观测期内呈持续增大状态，每隔2天，其肿瘤体积的增大具有显著意义，如对照组C1，其第4天的肿瘤体积明显大于第1天(q=4.559,P〈0.01)。以此类推，第11天的肿瘤体积明显大于第8天(q=4.549,P〈0.01)。实验组O1、O2和OL肿瘤生长较为缓慢，前两组直到第9～11天，其差异才具有显著意义(q=5.472,P〈0.01;q=5.056,P〈0.01)。而OL组的肿瘤生长变化趋势与上述二者不同，于第8天时，肿瘤体积增大具有显著意义(q=4.975,P〈0.05)，但以后则表现为生长基本停滞的状态，统计学分析，肿瘤体积的变化又失去显著意义。
附表 各组肿瘤体积的动态变化(
±s,mm3)
, http://www.100md.com
组别
例数
观测时间(d)
1
2
3
4
5
6
O1
7
539±174
561±166
, 百拇医药
662±183
772±220
889± 57
961±331
O2
5
476±138
567±189
737±260
679±331
794±311
849±333
, 百拇医药
OL
4
357±44
464±165
522±145
667±89
745±106
680± 74
C1
5
325±108
477±235
, 百拇医药
753±208
1 146±385
2 023±883
2 604±1 017
C2
7
268±164
404±222
641±306
954±255
1 177±351
1 459±300
, http://www.100md.com
S1
5
383±96
517±88
800±169
1 142±589
1 668±1 109
2 045±1 104
S2
5
484±92
594±170
, 百拇医药
716±264
1 047±212
1 407±548
2 369±1 007
L
5
403±115
561±113
859±355
1 423±887
2 010±1 020
2 707±1 344
, 百拇医药
组别
例数
观测时间(d)
7
8
9
10
11
O1
7
1 090±537
1 371±760
1 638±866
, http://www.100md.com
1 467±627
1 416±610
O2
5
1 374±694
1 366±708
1 687±653
1 700±677
1 787±660
OL
4
7 447± 85
, 百拇医药
830±113
809±111
772± 14
772± 14
C1
5
3 030±1 201
4 245±2 507
5 962±4 447
6 747±5 198
8 083±522
C2
, 百拇医药
7
2 128±585
2 737±738
3 584±985
4 587±1 626
5 809±2 376
S1
5
2 818±1 614
3 413±2 311
4 106±3 113
4 801±3 051
, http://www.100md.com
5 652±3 926
S2
5
3 033±1 131
3 557±1 546
3 756±1 779
4 341±1 870
5 030±2 073
L
5
2 992±1 339
3 983±2 768
, 百拇医药
4 986±3 068
4 683±2 638
7 271±3 664
2.肿瘤生长速率的比较：为更客观的比较实验组和对照组之间肿瘤生长速度的变化趋势，分析了各组肿瘤生长速率R[R=(Vd+1-Vd)/Vd，V代表肿瘤体积，d表示天数]，结果显示，实
验组O1与对照组S1相比，第6天开始，O1组肿瘤体积的生长速率明显低于S1组的生长速率(u=2.044,P〈0.05)。同样，O2和OL组均于第5～6天开始，肿瘤生长速率明显低于各自相应对照组S2和L
, 百拇医药
组的R(u=2.339,P〈0.05;u=2.449,P〈0.05)(图1，2)。
图1 实验组间肿瘤生长的比较
图2 对照组间肿瘤生长的比较
讨 论
近年来反义基因逆转MDR的研究，Corrias等[6]已有报道，但尚缺乏体内实验结果。Ueda等[7]的实验结果确立了mdr1基因表达调控区的序列，因此为MDR的反义基因疗法奠定了理论基础。体外合成mdr1基因调控区的反义DNA，互补结合细胞内mdr1基因，从而达到阻滞mdr1基因的转录和表达的目的。这种作用机制已在体外细胞的研究中得到初步证实。在成功的建立了肿瘤耐药动物模型之后，首先采用mdr1反义DNA降低肿瘤耐药基因的表达，随之给予联合化疗，观察肿瘤体积的变化。结果表明，此段mdr1基因反义寡核苷酸在体内具有耐药逆转作用。为了减少反义DNA的降解，加强其在体内作用，实验中除采用硫甙修饰反义寡核苷酸外，同时还设立了以脂质体Lipofectin为载体的实验组。实验结果也初步显示了脂质体的载体作用。
, 百拇医药
本研究结果初步证实了反义DNA体内逆转耐药作用。但正常情况下体内其他组织细胞也有不同程度的mdr1基因表达。应用mdr1反义DNA是否影响其他脏器的功能，对此，我们将作进一步观察。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39400161) 参考文献
1Cornwell MM, Pastan I, Gottesman MM. Certain calcium channel blockers bind
specifically to multidrug-resistant human KB carcinoma membrane vesicles and inhibit
drug binding to p-glycoprotein. J Biol Chem, 1987,262:2166-2170.
, 百拇医药
2Pearce HL, Safa AR, Bach NJ, et al. Essential features of the p-glycoprotein
pharmacophore as defined by a series of reserpine analogs that modulate multidrug
resistance. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86:5128-5132.
3Yakubov LA, Deeva EA, Zarytova VF, et al. Mechanism of Oligonucleotide uptake
by cells: involvement of specific receptors? Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86:6454-6458.
, 百拇医药
4Calabretta B, Sims RB, Valtieri M, et al. Normal and leukemic hematopoietic cells
manifest differential sensitivity to inhibitory effects of c-myb antisense oligodeoxynucleutides:
an in vitro study relevant to bone marrow purging. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:2351-2355.
5Clutterbuck RD, Hills CA, Hoey P, et al. Studies on the development of human acute
myeloid leukemia xenografts in immune-deprived mice: Comparison with cells in short-term
, 百拇医药
culture. Leuk Res, 1985,9:1511-1518.
6Corrias MV, Tonini GP. An oligmer complementary to the 5′end region of MDR 1 gene
decreases resistance to doxorubicin of human adenocarcinoma-resistant cells. Anticancer Res, 1992,12:1431-1438.
7Ueda K, Pastan I, Gottesman MM. Isolation and sequence of the promoter region of the human
multidrug-resistance (p-glycoprotein) gene. J Biol chem, 1987,262:17432-17436.
(收稿：1997-04-05 修回：1997-08-06), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：抗药性；多药；；；白血病；实验性；；寡核苷酸类；反义
论著 Reversal of multidrug resistance with mdr1 antisense oligodeoxynucleotides in vivo
Li Huifang, Sun Guixiang, Lu Weiwei, et al
【摘要】 目的 为研究多药耐药(multidrng resistance MDR)基因mdr1反义寡核苷酸体内逆转肿瘤耐药的作用。方法 采用白血病耐药细胞株细胞移植于胸腺缺陷裸小鼠(BALB/C)皮下，建立肿瘤耐药模型，局部或腹腔注射mdr1反义DNA，或以脂质体Lipofectin为载体，腹腔注射mdr1反义DNA，经柔红霉素(DNR)和鬼臼乙叉甙(VP-16)联合化疗。结果 实验组肿瘤生长速度明显低于对照组，从用药后的第5～6天开始，实验组肿瘤体积的增长速率也明显低于相应的对照组，以脂质体为载体的实验组，肿瘤生长出现了暂停的趋势。结论 mdr1反义寡核苷酸在动物体内具有耐药逆转的作用，脂质体能增强这些作用。
, 百拇医药
Reversal of multidrug resistance with mdr1 antisense oligodeoxynucleotides in vivo Li
Huifang, Sun Guixiang, Lu Weiwei, et al. Department of Pediatrics, The First Hospital of Beijing
Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To study the reversal of the multidrug resistance (MDR) in vivo by
MDR gene mdr1 antisense oligodeoxynucleotides. Methods The authors established a model
, 百拇医药
of nude mice which was transplanted with the leukemia resistant cell line HR-20. The mdr1 antisense
oligodeoxynucleotides were injected locally or intraperitoneally or injected with lipofectin. Results
After treatment by daunorubincin (DNR) and VP-16 the growth rate of the tumor in the experimental
groups significantly slowed down compared with that of controls. After 5 or 6 days of treatment, the
, 百拇医药
speed of growth of tumor′s size also slowed down compared with that of controls. The growth of
the tumor tended to suspend temporarily with lipofectin as a vector. Conclusion The results of this study
suggested that mdr1 antisense oligodeoxynucleotides, promoted by lipofectin, played a role in reversal of MDR.
【Key words】 Drug resistance, multiple Leukemia, experimental Oligonucleotides, untisense
, 百拇医药
多药耐药(MDR)的逆转研究始于本世纪80年代初。此后虽然许多体外研究显示，钙离子通道阻滞剂等药物有明显MDR逆转作用[1，2]，但体内研究结果仍不理想。近年来反义基因疗法，已在多个研究领域中取得初步成果[3，4]。以往我们已采用mdr1反义寡核苷酸(DNA)进行体外逆转肿瘤细胞株细胞的耐药特性的研究，在此基础上，现在又建立了裸小鼠肿瘤耐药模型，初步探讨了mdr1反义基因片段在体内对肿瘤耐药的逆转作用。
材料和方法
一、主要试剂
反义及正义DNA：人工合成并用硫甙修饰的20bp，互补于mdr1基因转录起始部位(美国Cybersyn公司)；脂质体采用Lipofectin(美国Sigma公司)。
, 百拇医药
二、裸小鼠
胸腺缺陷裸小鼠(BALB/c)由中国医学科学院动物研究所提供。雌性，6～8周龄。在空气层流架中带盖鼠笼内饲养。饮用水、专用饲料及其他动物接触物品均经灭菌处理。
三、细胞系
HR-20耐药细胞采由白血病细胞株HL-60经高三尖杉酯碱诱导而成。表达mdr1基因，由北京师范大学生物系提供。细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃，5%CO2的孵育箱中传代培养。
四、反义DNA与lipofectin(脂质体的一种)结合方法
取lipofectin原液50 μl加入RPMI-1640 200 μl中，反义DNA稀释于RPMI-1640 200 μl中，二者混合后，室温作用15分钟，直接注射于裸小鼠腹腔。
, 百拇医药
五、裸小鼠异种移植瘤动物模型的建立
取指数生长期HR-20细胞1×107/0.2 ml，直接接种于裸小鼠肋部皮下，于第7天即可见皮下肿瘤生长。共建模型动物44只，成瘤43只，成瘤率98%。每天测量肿瘤最长径(L)和与其垂直径长(D)，按下式计算肿瘤体积(V)：V=(π)/(6)LD2[5]。于接种细胞后第14天，肿瘤体积平均为406±151 mm3，即开始用药。此时为实验观测的第1天，持续观测肿瘤生长情况至第11天结束。
六、实验分组
实验组包括O1组：反义DNA局部注射，柔红霉素(DNR)和鬼臼乙叉甙(VP-16)联合化疗。O2组：反义DNA腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。OL组：将反义DNA结合脂质体Lipofectin一并腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。
, 百拇医药
对照组包括C1组：等量生理盐水腹腔注射。C2组：DNR和VP-16联合化疗。S1组：正义
DNA局部注射，DNR和VP-16联合化疗。S2组：正义DNA腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。L组：Lipofectin腹腔注射，DNR和VP-16联合化疗。
以上各组的DNA用量为30 μg/d，第1～3天；Lipofectin用量为50 μl/d，第1～3天；DNR用量为每天150 μg/m2(第2天)；每天VP-16用量为40 μg/m2，第2～4天。
七、统计学处理
采用秩和检验(mann-whitney)和随机区组的秩和检验(friedman)。数据操作在计算机上完成。
, 百拇医药
结 果
一、用药方式及药物本身对肿瘤生长的影响
1.DNA用药方式的影响作用：局部注射与腹腔注射DNA对肿瘤生长的作用无明显区别，而以lipofectin为载体组与单纯DNA腹腔注射组相比，后期肿瘤生长明显减慢(图1)，并于第6天，其差异具有显著意义(u=2.09,P?.05)。
2.单纯化疗的影响作用：对照组C2在应用DNR和VP-16后，肿瘤生长有所减慢，但与不用任何治疗的C1组相比，在整个观察期内，二者的差异均无显著意义。
3.脂质体对肿瘤的影响：单纯采 用lipofectin腹腔注射后(L组)，肿瘤生长状况与其他对照组之间无明显差异。
, 百拇医药
二、实验组与对照组间肿瘤生长状况的比较
1.肿瘤生长速度的比较：如附表所示，随时间的延长各组肿瘤体积逐渐增大。5个对照组肿瘤在整个观测期内呈持续增大状态，每隔2天，其肿瘤体积的增大具有显著意义，如对照组C1，其第4天的肿瘤体积明显大于第1天(q=4.559,P〈0.01)。以此类推，第11天的肿瘤体积明显大于第8天(q=4.549,P〈0.01)。实验组O1、O2和OL肿瘤生长较为缓慢，前两组直到第9～11天，其差异才具有显著意义(q=5.472,P〈0.01;q=5.056,P〈0.01)。而OL组的肿瘤生长变化趋势与上述二者不同，于第8天时，肿瘤体积增大具有显著意义(q=4.975,P〈0.05)，但以后则表现为生长基本停滞的状态，统计学分析，肿瘤体积的变化又失去显著意义。
附表 各组肿瘤体积的动态变化(
±s,mm3), http://www.100md.com
组别
例数
观测时间(d)
1
2
3
4
5
6
O1
7
539±174
561±166
, 百拇医药
662±183
772±220
889± 57
961±331
O2
5
476±138
567±189
737±260
679±331
794±311
849±333
, 百拇医药
OL
4
357±44
464±165
522±145
667±89
745±106
680± 74
C1
5
325±108
477±235
, 百拇医药
753±208
1 146±385
2 023±883
2 604±1 017
C2
7
268±164
404±222
641±306
954±255
1 177±351
1 459±300
, http://www.100md.com
S1
5
383±96
517±88
800±169
1 142±589
1 668±1 109
2 045±1 104
S2
5
484±92
594±170
, 百拇医药
716±264
1 047±212
1 407±548
2 369±1 007
L
5
403±115
561±113
859±355
1 423±887
2 010±1 020
2 707±1 344
, 百拇医药
组别
例数
观测时间(d)
7
8
9
10
11
O1
7
1 090±537
1 371±760
1 638±866
, http://www.100md.com
1 467±627
1 416±610
O2
5
1 374±694
1 366±708
1 687±653
1 700±677
1 787±660
OL
4
7 447± 85
, 百拇医药
830±113
809±111
772± 14
772± 14
C1
5
3 030±1 201
4 245±2 507
5 962±4 447
6 747±5 198
8 083±522
C2
, 百拇医药
7
2 128±585
2 737±738
3 584±985
4 587±1 626
5 809±2 376
S1
5
2 818±1 614
3 413±2 311
4 106±3 113
4 801±3 051
, http://www.100md.com
5 652±3 926
S2
5
3 033±1 131
3 557±1 546
3 756±1 779
4 341±1 870
5 030±2 073
L
5
2 992±1 339
3 983±2 768
, 百拇医药
4 986±3 068
4 683±2 638
7 271±3 664
2.肿瘤生长速率的比较：为更客观的比较实验组和对照组之间肿瘤生长速度的变化趋势，分析了各组肿瘤生长速率R[R=(Vd+1-Vd)/Vd，V代表肿瘤体积，d表示天数]，结果显示，实
验组O1与对照组S1相比，第6天开始，O1组肿瘤体积的生长速率明显低于S1组的生长速率(u=2.044,P〈0.05)。同样，O2和OL组均于第5～6天开始，肿瘤生长速率明显低于各自相应对照组S2和L
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组的R(u=2.339,P〈0.05;u=2.449,P〈0.05)(图1，2)。
图1 实验组间肿瘤生长的比较
图2 对照组间肿瘤生长的比较
讨 论
近年来反义基因逆转MDR的研究，Corrias等[6]已有报道，但尚缺乏体内实验结果。Ueda等[7]的实验结果确立了mdr1基因表达调控区的序列，因此为MDR的反义基因疗法奠定了理论基础。体外合成mdr1基因调控区的反义DNA，互补结合细胞内mdr1基因，从而达到阻滞mdr1基因的转录和表达的目的。这种作用机制已在体外细胞的研究中得到初步证实。在成功的建立了肿瘤耐药动物模型之后，首先采用mdr1反义DNA降低肿瘤耐药基因的表达，随之给予联合化疗，观察肿瘤体积的变化。结果表明，此段mdr1基因反义寡核苷酸在体内具有耐药逆转作用。为了减少反义DNA的降解，加强其在体内作用，实验中除采用硫甙修饰反义寡核苷酸外，同时还设立了以脂质体Lipofectin为载体的实验组。实验结果也初步显示了脂质体的载体作用。
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本研究结果初步证实了反义DNA体内逆转耐药作用。但正常情况下体内其他组织细胞也有不同程度的mdr1基因表达。应用mdr1反义DNA是否影响其他脏器的功能，对此，我们将作进一步观察。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39400161) 参考文献
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(收稿：1997-04-05 修回：1997-08-06), http://www.100md.com