哮喘模型豚鼠支气管肺泡灌洗液中lyso-PAF的生物测定法
作者：林振桃 赵路宁 黄海鹭 钟南山 余清声
单位：林振桃 赵路宁 余清声：广州医学院蛇毒研究所；黄海鹭 钟南山 广州呼吸疾病研究所(广州510182)
关键词：
哮喘模型豚鼠支气管肺泡灌洗液中lyso 血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)是一种作用强烈的致炎致敏介质，静脉注射或吸入PAF可引起强烈的支气管收缩。研究表明，吸入过敏原后，哮喘病人支气管肺泡灌洗液中PAF水平显著升高[1]。由于PAF半衰期只有30 s，极易脱酰基转变为无活性的Lyso-PAF，因此，直接测定PAF相当困难。本文参考Croft等人的方法[2]，从哮喘模型豚鼠BALF中提取Lyso-PAF，再使之乙酰化为PAF，利用后者能使血小板聚集来定量BALF中的PAF。
, 百拇医药 材料和方法
(一) L-α-phosphatidycholine，β-acetyl，γ-hexadecyl(PAF合成品)、二磷酸腺苷(ADP)及卵清蛋白均为Sigma公司产品; 其余均为国产分析纯或化学纯试剂。
(二) Hepes-台氏缓冲液NaCl 0.137 mol/L、 KCl 2.68 mmol/L、 NaHCO3 11.9 mmol/L、 NaH2PO4 0.416 mmol/L、 MgCl2.6H2O 1.0 mmol/L、 CaCl2 1.3 mmol/L、葡萄糖0.555 mol/L、 Hepes 5 mmol/L、牛血清蛋白0.25%(pH 7.5)。
(三) 豚鼠，雌、雄兼有，体重(180.5±25.2) g，由本院医学实验动物研究中心提供。
, 百拇医药
(四) 豚鼠支气管哮喘模型的建立：豚鼠30只，分为两组，哮喘组腹腔注射10%卵清蛋白1 mL/只，对照组腹腔注射等量的生理盐水，25℃条件下饲养2周后将豚鼠置于容积为4L的半密闭罩内，以50 kPa恒压喷出1%的卵清蛋白30s，喷雾停止后再让其在雾室中吸入30 s，以腹肌明显收缩为阳性。每天诱喘1次，分别在诱喘1、 3、 7次后取其支气管肺泡灌洗液。
(五) 支气管肺泡的灌洗分别在诱喘1、 3、 7次后，用25%乌拉坦(2.5g/kg，i p)麻醉豚鼠后，分离支气管，打开胸腔，暴露肺脏，插入气管插管，用5 mL生理盐水反复冲洗肺泡3次，灌洗液置4℃冰箱备用。
(六) BALF中Lyso-PAF的提取及乙酰化 bronchoalveolar lavage fluid(BALF)1 500 r/min离心5 min后取上清液，2 000 r/min再离心10 min，取上清液加入1.5 mL氯仿，充分混合后静置5 min，取氯仿相用氮气吹干，然后分别加入50 μL吡啶和醋酐，在室温下静置18 h，使Lyso-PAF转化为PAF，再用氮气吹干，加入Hepes-台氏液0.5 mL使之溶解备用。
, 百拇医药
(七) 血小板聚集参考汪钟的方法[3]，按Mustard法[4]制备浓缩血小板，用Tyrode缓冲液(无钙，含3.5 g/L白蛋白)洗涤3次，血小板数调至(300±30)×109/L，制成血小板悬液，洗涤的人血小板悬液用量为200 μL，诱聚剂用量为10 μL，在SH-93智能型血液凝聚仪上测定5 min内血小板最大聚集百分率。
结 果
一、PAF致血小板聚集的量-效关系：
不同剂量的标准品PAF可引起洗涤的人血小板不同程度的聚集，在剂量10-8～10-6 mol/L的范围内，量-效呈线性关系(r=0.928)，如图1。
, 百拇医药
Fig 1 Washed human platelet aggregation induced by platelet activating factor of different doses 图1 不同浓度的PAF诱导洗涤的人血小板聚集
表1 哮喘模型豚鼠BALF提取物所致人血小板聚集率的变化
Tab 1 Effect of platelet aggregation by extration of BALF from asthmatic guinea pig model (
±s，n=5)
Group
Platelet aggregation(%)
, 百拇医药
Challenge
Once
Three times
Seven times
Control
16.5±6.2
11.2±7.5
10.8±8.4
Asthmatic model
38.8±16.1*
52.8±18.3*
65.5±17.2*
, 百拇医药
*P<0.01，vs control
二、哮喘模型豚鼠BALF提取物对洗涤人血小板的诱聚作用：
哮喘组及对照组豚鼠分别用1%卵清蛋白攻击1次、 3次和7次后在麻醉条件下取BALF，参照Croft法提取BALF中的Lyso-PAF并使之乙酰化为PAF，以其为诱导剂诱导血小板聚集。结果见表1。
三、哮喘模型豚鼠BALF提取物PAF特性的鉴定：
⑴薄层层析 用硅胶G板展开法显示，BALF提取物的Rf值为0.26，与标准品PAF完全一致，在Rf值为0.26处刮下组分经重新萃取后仍具有诱聚血小板活性，表明BALF提取物中确实含有PAF。
⑵ PLA2对BALF提取物诱聚血小板作用的影响 将标准品PAF和BALF提取物分别与PLA2在37℃温育30 min，再分别测定其诱聚血小板作用，结果显示两者诱聚血小板的作用均消失。
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⑶消炎痛及磷酸肌酸/磷酸肌酸激酶(CP/CPK)对BALF提取物诱聚血小板作用的影响 在洗涤的人血小板悬液中加入消炎痛或CP/CPK，使之终浓度分别为10-5 mol/L、 5.0 mol/L/4.0 mmol/L，37℃孵育2 min，再分别用ADP、标准品PAF及BALF提取物作诱聚剂，诱导血小板聚集。结果见表2。 表2 消炎痛及CP/CPK对哮喘模型豚鼠BALF提取物诱导人
血小板聚集作用的影响
Tab 2 Effect of indomethacin and CP/CPK on platelet aggregation induced
by extraction of BALF from asthmatic guinea pig model (±s，n=5)
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Group
Platelet aggregation(%)
APD(2μmoL/L)
PAF(10-7mol/L)
Extraction from BALF(20 μL)
Control
52.8±10.5
68.3±10.8
64.5±15.3
Indomethacin(10-5mol/L)
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28.5±13.2*
63.2±12.9#
58.6±13.1#
CP/CPK(5.0/4.0mol/L)
12.2±5.9*
60.8±15.3#
55.8±12.5#
*P<0.01，vs control; #P<0.01，vs ADP group
CP=creatine phosphate; CPK=creatine phosphokinase 讨 论
自从1972年Benveniste等首次报道了血小板活化因子(PAF)以来，人们认识到PAF除了具有激活血小板的作用外，尚具有强烈的增强血管通透性、促进嗜酸性细胞趋化、致平滑肌收缩及肾性降压等作用[5]。由于体内PAF含量极低(活性浓度只有10-7～10-7 mol/L)且半衰期只有30 s，其结构又与其它磷脂相近，难以分离，因此，体内PAF检测尚缺乏一种绝对定量的方法[6]。
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我们利用PAF能使血小板聚集且在一定范围内(10-8～10-6 mol/L)血小板聚集百分率(透光度的改变)与PAF剂量呈线性关系，通过先将BALF中的Lyso-PAF乙酰化为PAF，再测定其诱导血小板聚集率来定量PAF。
哮喘患者体内PAF水平升高已被有关研究所证明[1]，Stenton等报道反复发作伴有气道高反应的哮喘患者，吸入过敏原后，其体内Lyso-PAF水平显著高于哮喘初发者。我们的实验结果显示，哮喘模型豚鼠BALF中的Lyso-PAF含量(其乙酰化后致血小板聚集率)与其哮喘发作的次数呈正相关，考虑可能是哮喘反复发作，出现气道高反应性，释放的PAF量显著增加所致。
BALF提取物PAF特性鉴定结果表明，其与标准品PAF在硅胶G板展开时Rf值完全一致，用PLA2将其脱乙酰基后，其诱聚血小板的作用消失，但其致血小板聚集的作用不受消炎痛及CP/CPK的影响，表明BALF提取物致血小板聚集的成分为PAF。
, 百拇医药
生物鉴定法与PAF的其它测定方法比较，它不象质谱法那样需要昂贵的仪器及复杂的处理，也不象免疫法那样需要特异性抗体(通常不易制备)，而且生物测定法灵敏度高且操作简单易行，只要我们在实验中注意以下几个问题，它不失为测定BALF中PAF的一种好方法。
⑴插入气管插管之前豚鼠要先麻醉，插管动作要轻、快、切忌反复插管。
⑵灌洗时灌入的生理盐水是预热的(37℃)，灌洗后灌洗液立即置4℃保存。
⑶为避免BALF中可能存在的ADP对血小板聚集实验的干扰，可在BALF中加入Indomethacin抑制ADP诱导血小板聚集的作用或加入CP/CPK使BALF中的ADP转化为ATP。
⑷必要时应做鉴别实验，如把BALF中的Lyso-PAF乙酰化为PAF后做薄层层析，并与标准的PAF对照。
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参考文献
1 Stenton SC，Court EN，Kingston WP, et al. Platelet activating factor in bronchoalveolar lavage fluid from asthmatic subjects. Eur Respir J, 1990, 3(4):408.
2 Croft KD, Sturm MJ, Codde JP, et al. Dietary fish oils reduce plasma levels of platelet activating factor precursor (lyso-PAF) in rats. Life Sci, 1986, 38(20):1875.
3 汪 钟. 血小板聚集测定法.见徐叔云，卞如濂，陈 修，主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社.1991, 1121～1123.
, 百拇医药
4 Mustard JF, Perry DW, Ardlie NG ,et al . Preparation of suspensions of washed platelet from humans . Br J Haematol, 1972, 22:193.
5 陈松鹤，诸骏仁.血小板活化因子的病理作用和临床意义. 国外医学生理.病理科学与临床分册， 1989，9：129.
6 李惠萍，张瑞祥.血小板活化因子检测方法的研究进展.上海医学检验杂志， 1992，7：46.
(1998年9月8日收稿，1998年12月22日修回), 百拇医药
单位：林振桃 赵路宁 余清声：广州医学院蛇毒研究所；黄海鹭 钟南山 广州呼吸疾病研究所(广州510182)
关键词：
哮喘模型豚鼠支气管肺泡灌洗液中lyso 血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)是一种作用强烈的致炎致敏介质，静脉注射或吸入PAF可引起强烈的支气管收缩。研究表明，吸入过敏原后，哮喘病人支气管肺泡灌洗液中PAF水平显著升高[1]。由于PAF半衰期只有30 s，极易脱酰基转变为无活性的Lyso-PAF，因此，直接测定PAF相当困难。本文参考Croft等人的方法[2]，从哮喘模型豚鼠BALF中提取Lyso-PAF，再使之乙酰化为PAF，利用后者能使血小板聚集来定量BALF中的PAF。
, 百拇医药 材料和方法
(一) L-α-phosphatidycholine，β-acetyl，γ-hexadecyl(PAF合成品)、二磷酸腺苷(ADP)及卵清蛋白均为Sigma公司产品; 其余均为国产分析纯或化学纯试剂。
(二) Hepes-台氏缓冲液NaCl 0.137 mol/L、 KCl 2.68 mmol/L、 NaHCO3 11.9 mmol/L、 NaH2PO4 0.416 mmol/L、 MgCl2.6H2O 1.0 mmol/L、 CaCl2 1.3 mmol/L、葡萄糖0.555 mol/L、 Hepes 5 mmol/L、牛血清蛋白0.25%(pH 7.5)。
(三) 豚鼠，雌、雄兼有，体重(180.5±25.2) g，由本院医学实验动物研究中心提供。
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(四) 豚鼠支气管哮喘模型的建立：豚鼠30只，分为两组，哮喘组腹腔注射10%卵清蛋白1 mL/只，对照组腹腔注射等量的生理盐水，25℃条件下饲养2周后将豚鼠置于容积为4L的半密闭罩内，以50 kPa恒压喷出1%的卵清蛋白30s，喷雾停止后再让其在雾室中吸入30 s，以腹肌明显收缩为阳性。每天诱喘1次，分别在诱喘1、 3、 7次后取其支气管肺泡灌洗液。
(五) 支气管肺泡的灌洗分别在诱喘1、 3、 7次后，用25%乌拉坦(2.5g/kg，i p)麻醉豚鼠后，分离支气管，打开胸腔，暴露肺脏，插入气管插管，用5 mL生理盐水反复冲洗肺泡3次，灌洗液置4℃冰箱备用。
(六) BALF中Lyso-PAF的提取及乙酰化 bronchoalveolar lavage fluid(BALF)1 500 r/min离心5 min后取上清液，2 000 r/min再离心10 min，取上清液加入1.5 mL氯仿，充分混合后静置5 min，取氯仿相用氮气吹干，然后分别加入50 μL吡啶和醋酐，在室温下静置18 h，使Lyso-PAF转化为PAF，再用氮气吹干，加入Hepes-台氏液0.5 mL使之溶解备用。
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(七) 血小板聚集参考汪钟的方法[3]，按Mustard法[4]制备浓缩血小板，用Tyrode缓冲液(无钙，含3.5 g/L白蛋白)洗涤3次，血小板数调至(300±30)×109/L，制成血小板悬液，洗涤的人血小板悬液用量为200 μL，诱聚剂用量为10 μL，在SH-93智能型血液凝聚仪上测定5 min内血小板最大聚集百分率。
结 果
一、PAF致血小板聚集的量-效关系：
不同剂量的标准品PAF可引起洗涤的人血小板不同程度的聚集，在剂量10-8～10-6 mol/L的范围内，量-效呈线性关系(r=0.928)，如图1。
, 百拇医药
Fig 1 Washed human platelet aggregation induced by platelet activating factor of different doses 图1 不同浓度的PAF诱导洗涤的人血小板聚集
表1 哮喘模型豚鼠BALF提取物所致人血小板聚集率的变化
Tab 1 Effect of platelet aggregation by extration of BALF from asthmatic guinea pig model (
±s，n=5)Group
Platelet aggregation(%)
, 百拇医药
Challenge
Once
Three times
Seven times
Control
16.5±6.2
11.2±7.5
10.8±8.4
Asthmatic model
38.8±16.1*
52.8±18.3*
65.5±17.2*
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*P<0.01，vs control
二、哮喘模型豚鼠BALF提取物对洗涤人血小板的诱聚作用：
哮喘组及对照组豚鼠分别用1%卵清蛋白攻击1次、 3次和7次后在麻醉条件下取BALF，参照Croft法提取BALF中的Lyso-PAF并使之乙酰化为PAF，以其为诱导剂诱导血小板聚集。结果见表1。
三、哮喘模型豚鼠BALF提取物PAF特性的鉴定：
⑴薄层层析 用硅胶G板展开法显示，BALF提取物的Rf值为0.26，与标准品PAF完全一致，在Rf值为0.26处刮下组分经重新萃取后仍具有诱聚血小板活性，表明BALF提取物中确实含有PAF。
⑵ PLA2对BALF提取物诱聚血小板作用的影响 将标准品PAF和BALF提取物分别与PLA2在37℃温育30 min，再分别测定其诱聚血小板作用，结果显示两者诱聚血小板的作用均消失。
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⑶消炎痛及磷酸肌酸/磷酸肌酸激酶(CP/CPK)对BALF提取物诱聚血小板作用的影响 在洗涤的人血小板悬液中加入消炎痛或CP/CPK，使之终浓度分别为10-5 mol/L、 5.0 mol/L/4.0 mmol/L，37℃孵育2 min，再分别用ADP、标准品PAF及BALF提取物作诱聚剂，诱导血小板聚集。结果见表2。 表2 消炎痛及CP/CPK对哮喘模型豚鼠BALF提取物诱导人
血小板聚集作用的影响
Tab 2 Effect of indomethacin and CP/CPK on platelet aggregation induced
by extraction of BALF from asthmatic guinea pig model (
±s，n=5), http://www.100md.com
Group
Platelet aggregation(%)
APD(2μmoL/L)
PAF(10-7mol/L)
Extraction from BALF(20 μL)
Control
52.8±10.5
68.3±10.8
64.5±15.3
Indomethacin(10-5mol/L)
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28.5±13.2*
63.2±12.9#
58.6±13.1#
CP/CPK(5.0/4.0mol/L)
12.2±5.9*
60.8±15.3#
55.8±12.5#
*P<0.01，vs control; #P<0.01，vs ADP group
CP=creatine phosphate; CPK=creatine phosphokinase 讨 论
自从1972年Benveniste等首次报道了血小板活化因子(PAF)以来，人们认识到PAF除了具有激活血小板的作用外，尚具有强烈的增强血管通透性、促进嗜酸性细胞趋化、致平滑肌收缩及肾性降压等作用[5]。由于体内PAF含量极低(活性浓度只有10-7～10-7 mol/L)且半衰期只有30 s，其结构又与其它磷脂相近，难以分离，因此，体内PAF检测尚缺乏一种绝对定量的方法[6]。
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我们利用PAF能使血小板聚集且在一定范围内(10-8～10-6 mol/L)血小板聚集百分率(透光度的改变)与PAF剂量呈线性关系，通过先将BALF中的Lyso-PAF乙酰化为PAF，再测定其诱导血小板聚集率来定量PAF。
哮喘患者体内PAF水平升高已被有关研究所证明[1]，Stenton等报道反复发作伴有气道高反应的哮喘患者，吸入过敏原后，其体内Lyso-PAF水平显著高于哮喘初发者。我们的实验结果显示，哮喘模型豚鼠BALF中的Lyso-PAF含量(其乙酰化后致血小板聚集率)与其哮喘发作的次数呈正相关，考虑可能是哮喘反复发作，出现气道高反应性，释放的PAF量显著增加所致。
BALF提取物PAF特性鉴定结果表明，其与标准品PAF在硅胶G板展开时Rf值完全一致，用PLA2将其脱乙酰基后，其诱聚血小板的作用消失，但其致血小板聚集的作用不受消炎痛及CP/CPK的影响，表明BALF提取物致血小板聚集的成分为PAF。
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生物鉴定法与PAF的其它测定方法比较，它不象质谱法那样需要昂贵的仪器及复杂的处理，也不象免疫法那样需要特异性抗体(通常不易制备)，而且生物测定法灵敏度高且操作简单易行，只要我们在实验中注意以下几个问题，它不失为测定BALF中PAF的一种好方法。
⑴插入气管插管之前豚鼠要先麻醉，插管动作要轻、快、切忌反复插管。
⑵灌洗时灌入的生理盐水是预热的(37℃)，灌洗后灌洗液立即置4℃保存。
⑶为避免BALF中可能存在的ADP对血小板聚集实验的干扰，可在BALF中加入Indomethacin抑制ADP诱导血小板聚集的作用或加入CP/CPK使BALF中的ADP转化为ATP。
⑷必要时应做鉴别实验，如把BALF中的Lyso-PAF乙酰化为PAF后做薄层层析，并与标准的PAF对照。
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参考文献
1 Stenton SC，Court EN，Kingston WP, et al. Platelet activating factor in bronchoalveolar lavage fluid from asthmatic subjects. Eur Respir J, 1990, 3(4):408.
2 Croft KD, Sturm MJ, Codde JP, et al. Dietary fish oils reduce plasma levels of platelet activating factor precursor (lyso-PAF) in rats. Life Sci, 1986, 38(20):1875.
3 汪 钟. 血小板聚集测定法.见徐叔云，卞如濂，陈 修，主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社.1991, 1121～1123.
, 百拇医药
4 Mustard JF, Perry DW, Ardlie NG ,et al . Preparation of suspensions of washed platelet from humans . Br J Haematol, 1972, 22:193.
5 陈松鹤，诸骏仁.血小板活化因子的病理作用和临床意义. 国外医学生理.病理科学与临床分册， 1989，9：129.
6 李惠萍，张瑞祥.血小板活化因子检测方法的研究进展.上海医学检验杂志， 1992，7：46.
(1998年9月8日收稿，1998年12月22日修回), 百拇医药