活性氧对豚鼠心室肌细胞不同钾通道离子电流的影响
作者：徐长庆 李玉荣 孙可青 杨宝峰 单宏丽 娄延平 傅国辉
单位：徐长庆 单宏丽 娄延平 傅国辉：哈尔滨医科大学 病理生理教研室；李玉荣：生理教研室；杨宝峰：药理教研室 哈尔滨 150086；孙可青：黑龙江省医院
关键词：过氧化氢；豚鼠；心肌；离子通道；心律失常
中国病理生理杂志990902 摘 要 目的：揭示氧自由基导致跨膜电位变化的离子电流基础。方法：采用全细胞膜片钳技术，观察了H2O2(lmmol/L)对豚鼠单个心室肌细胞不同钾通道的影响。结果：H2O2使豚鼠心肌细胞静息电位(RP)降低，动作电位时程(APD)显著缩短的同时，明显抑制超极化时的内向整流钾电流(IK1)，致(IK1)正常呈N字型I-V曲线几乎变成一条斜线；增强延迟整流钾电流(IK)的快组分(IKr)和慢组分(IKs)，尤其IKr增加更显著，并使电流电压曲线向右上偏移。结论：氧自由基对心室肌细胞的IK1和IK的不同影响，是其所致跨膜电位变化和心律失常的可能离子机制。
Effect of H2O2 on different potassium channel ionic currents
of ventricular myocytes of guinea pig
XU Chang-Qing, LI Yu-Rong, SUN Ke-Qing, YANG Bao-Feng,SAN Hong-Li, LOU Yan-Ping, FU Guo-Hui
Department of Pathophysiology, Physiology, Pharmacology, Harbin Medical University, Harbin (150086)
Abstract AIM: To reveal ionic current basis of the change of transmembrane potential induced by oxygen free radical. METHOD：The whole cell recording patch clamp technique was used to investigate the effect of H2O2 (1 mmol/L) on different potassium channel ionic currents of ventricular myocytes of guinea pig. RESULTS：It was found that H2O2 reduced rest potential (RP) and shortened action potential duration (APD) significantly, inhibited the inward rectifier K current (IK1) markedly. H2O2 changed the current-voltage (I-V) relation to IK1 from a N shape to a /shape and enhanced the rapid component (IKr) and the slow component (IKs) of the delayed outward retifier K current (IK), especially IKr, and made IK I-V curve shift to up-right. CONCLUSION：Different effects of oxygen free radical on IK1 and IK of ventricular myocytes is a possible ionic mechanism for the change of transmembrane potential and arrhythmia induced by oxygen free redical.
MeSH Hydrogen peroxide; Guinea pigs; Myocardium; Ion channels; Arrhythmia
氧自由基参与了细胞内钙超载和再灌注心律失常的发生[1]，其确切机制尚有待深入研究。H2O2作为外源性羟自由基的生成系统，广泛用于氧自由基对单个心肌细胞电生理活动影响的探讨。无论常规微电极和膜片钳技术之间，还是采用同种方法的不同实验室之间，得出的结论不尽相同，有的甚至截然相反[2～4]。为了进一步明确有关问题，我们观察了H2O2对豚鼠心室肌细胞不同钾通道离子电流的影响，并分析了其与动作电位的关系。
材料与方法
(一) 单个心室肌细胞的分离：实验用豚鼠，由本校动物中心提供，体重(312±23) g,雌雄不拘。分离方法及条件与先前报道基本相同[5]。即将豚鼠击头致昏后，迅速开胸取心，主动脉插管，使用Langendorff灌流装置，经冠状动脉首先灌注正常台氏液(mmol/L:NaCl 116,NaH2PO4 1.4，KCl 5.4，NaHCO3 15,MgSO4 1,CaCl2 1.8和glucose 15)冲出积血，接着灌注无钙台氏液4～5 min使心脏停跳，最后用含有Ⅰ型胶原酶(0.250～0.375 g/L)的低钙台氏液(150μmol/L)反复消化40～60 min,灌流速度为7～8 mL/min。所有的液体均用95%O2+5%CO2饱和，温度为(37±0.5) ℃。在不同时间间隔分别于心尖部位连续剪取心肌组织。将消化好的心室肌进行吹打，振荡，加含白蛋白(0.5 mg/mL) KB溶液保存备用。
用该法分离心肌细胞，由于细胞取自不同的消化时间，总有一个或几个时段的细胞消化分离“恰到好处”，故每次都能获得60%～80%的横纹清晰、质膜完整、呈杆状的耐钙心室肌细胞，且容易封接。
(二) 膜电流和膜电位的记录：将分离的单个豚鼠心室肌细胞放入倒置显微镜(OLYMPUSIMT-2)载物台上的灌流槽中，灌流液体为改进的台氏液(NaCl 136,NaH2PO4 1.2,KCl 5.4,MgSO4 1.2,CaCl2 1.8,glucose 15和HEPES 5 mmol/L,pH用NaOH调至7.3)，灌流速度为1.0～1.5 mL/min。上述操作在室温下(25±1) ℃进行。使用膜片钳放大器(AxoPATCH200A)、数模转换系统(DigiData 1200)和pCLAMP 6.02微机程序，全细胞式记录方法，用电流钳检测单细胞跨膜电位，同时用电压钳检测内向整流钾电流(inward rectifier potassium current,IK1)和延迟整流钾电流(delayed outward potassium current,IK)，动态采样、储存和分析[5]。IK1和IK为电压依赖性钾电流，其刺激程序见后面图1和图3。
用两步拉制器(NARISHIGE)将硬质玻璃毛细管(内径小于 4μm)拉制成微管电极，其尖端直径约2～4 μm，电阻为3.3～6.2 MΩ，内含细胞内液成分：K-aspartate 125; KCl 20; EGTA 10; HEPES 5; MgCl2 10； ATP-Na 5 mmol/L; pH用KOH调至7.2。
(三)药物和试剂：胶原酶、维拉帕米、天门冬氨酸钾、HEPES、白蛋白等由Sigma Co. 生产。余为分析纯。
(四)实验分组：实验分为正常对照组(加药前)、H2O2(1 mmol/L)实验组和冲洗后恢复组。所有观察指标均在同一细胞内完成，系处理前后对照。在各种处置作用8～12 min采集实验数据。
(五)资料分析：数据以x±s表示，用配对t检验进行均数差异显著性测定。
结果
一、H2O2对豚鼠心室肌细胞跨膜电位的影响：
本实验采用的H2O2(1 mmol/L)，引起豚鼠心室肌细胞静息电位(rest potential, RP)明显降低(P<0.05)，动作电位时程(action potential duration, APD)显著缩短(P<0.01)，但对动作电位幅度(action potential amplitude, APA)和超射(overshoot, OS)均无明显影响(见表1)。
表1 H2O2(1 mmol/L)对豚鼠单个心室肌细胞跨膜电位的影响
Tab 1 Effect of H2O2 (1 mmol/L) on the transmembrane potential in guinea pig ventricular myocytes (x±s, n=8)
RP(mV)
APA(mV)
OS(mV)
APD50(ms)
APD90(ms)
Control
-73.0±9.8
112.0±16.0
38.9±7.0
409.0±233.4
515.0±234.0
H2O2
-65.3±11.3*
107.9±15.2
42.7±6.2
169.5±176.0**
238.4±210.3
*P<0.05, **P<0.01, vs control
二、H2O2(1 mmol/L)对豚鼠心室肌细胞内向整流钾电流(IK1)的影响：
H2O2(1 mmol/L)明显抑制IK1，尤其在超极化时更是如此。例如，指令电位为-120 mV和-110 mV时，IK1由对照组的(-2133.5±570.4) pA和(-1671.3±469.0) pA分别降低到(-567.0±218.0) mV和(-490.0±169.0) mV(n=8, P<0.01)。图1为其中1次的实验记录。
Fig 1 Effect of H2O2(1 mmol/L) on the inward rectifier K current (IK1) in guinea pig ventricular myocytes
图1 H2O2(1 mmol/L) 对豚鼠单个心室肌细胞IK1的影响
Fig 2 Effect of H2O2 (1 mmol/L) on the current-voltage (I-V) relation for IK1 in guinea pig ventricular myocytes
图2 H2O2(1 mmol/L)对豚鼠单个心室肌细胞IK1的电流-电压曲线关系的影响
在本实验条件下，正常对照组的IK1的I-V曲线呈N字型，与电压轴线有3个交点，H2O2明显抑制超极化时的内向电流，取消了-10至+20 mV间的内向电流，并使+20 mV以上的外向电流有所增强，致I-V曲线几乎变化一条斜线(图2)。
三、H2O2(1 mmol/L)对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK)的影响：
H2O2(1 mmol/L)可使IK增强，其中其快组分(IKr)增加显著，而慢组分(IKs)增加不甚显著。例如，在指令电位为40 mV时，IKr由(290.8±277.2) pA增强至(630.3±130.6) pA (n=6,P<0.05),IKs由(826.2±215.8) pA增加至(1089.8±473.8) pA (n=6,P>0.05)。图3为其中1次的实验记录。
在本实验条件下，正常对照组的IKr具有内向整流特点，其I-V曲线呈V字型，与电压轴线有两个交点(-10 mV,+20 mV)，H2O2明显抑制IKr的内向电流，增强外向电流，使I-V曲线向右上移位(图4)。正常IKs均为外向电流，I-V曲线呈/型，H2O2增强这种外向电流，使I-V曲线向右上移位(图5)。
Fig 3 Effect of H2O2(1 mmol/L) on the delayed rectifier K current (IK) in guinea pig ventricular myocytes
图3 H2O2(1 mmol/L) 对豚鼠单个心室肌细胞IK的影响
Fig 4 Effect of H2O2 (1 mmol/L) on the current-voltage (I-V) relation for IKr in guinea pig ventricular myocytes
图4 H2O2(1 mmol/L)对豚鼠单个心室肌细胞IKr的电流-电压曲线关系的影响
Fig 5 Effect of H2O2 (1 mmol/L) on the current-voltage (I-V) relation for IKs in guinea pig ventricular myocytes
图5 H2O2(1 mmol/L)对豚鼠单个心室肌细胞IKs的电流-电压曲线关系的影响
讨论
本实验发现H2O2在使豚鼠心肌细胞RP降低和APD显著缩短的同时，明显抑制IK1和增强IK。
Satoh等采用全细胞电压钳方法，观察到H2O2(100 μmol/L)可抑制豚鼠心室肌细胞ICa和增强IK[4]。Haruaki Nakaya等观察到异丙基苯过氧化氢(cumene hydroperoxide)显著抑制豚鼠心室肌细胞IK1[6]。这些与我们观察到的情况相一致。
我们在早年发表的论文中，提出了APD10(复极达10%所需时间)相当于复极1期(快速复极早期)，APD50-10(复极达50%所需时间与复极达10%所需时间之差)相当于复极2期(平台期，缓慢复极期)，APD90-50(复极达90%所需时间与复极达50%所需时间之差)相当于复极3期(快速复极晚期)的看法[7]。近来，通过将膜片钳技术测得的药物抑制L型钙电流和缩短动作电位时程效应的资料进行相关性分析，进一步证实上述观点的正确[8]。
IK1主要负责维持心肌细胞的RP和动作电位(AP)3期快速复极化过程，IK则参与整个复极过程，和ICa一起共同维持AP的平台期[9，10]。IK1的抑制，必然导致RP降低和AP复极3期的延长。本实验中，H2O2引起的豚鼠心室肌细胞RP的降低(由-73.0±9.8 mV降至-65.3±11.3 mV)，APD90-50(复极3期)占整个APD的比例平均由18.9%增加到26.3%，显然与H2O2显著抑制IK1有关。H2O2引起的IK增强及ICa的抑制(资料另文报道)，共同导致APD的显著缩短。IK1减少应导致APD延长，IK增大则可导致APD缩短。APD究竟如何，取决于两者作用大小。本实验结果，进一步说明IK是控制APD长短的主要钾通道离子电流。
氧自由基与缺血时心功能障碍、缺血后心肌“顿挫”和再灌注损伤(包括再灌注性心律失常)有关，得到许多临床观察和动物实验的证实[1～4]。H2O2属于活性氧，它在体内可转变成细胞毒性极强的OH。人们可利用H2O2作为外源性自由基生成系统，观察自由基对机体的影响。H2O2引起RP降低，使RP和阈电位距离变小，可使心肌兴奋性增强；对背景钾电流IK1的抑制，可导致心肌自律性增强；使APD缩短，必然使有效不应期也相应缩短。这些均可成为氧自由基引起心律失常的电生理机制。
氧自由基对心肌细胞离子电流影响，各家报道不一。例如，内向整流钾电流(IK1)减小或不受影响，L-型ICa增大、减小或很少受影响等[2]。我们认为，这种混乱而矛盾的结果的产生，除与种属的差异、实验方法的不同有关以外，恐怕亦与动物的个体差异有关。
为什么H2O2对不同的钾通道作用不一致，抑制IK1却增强IK，有待于进一步深入研究。
* 国家自然科学基金资助(No 39570305)
参考文献
1 Goldhaber JI. Free radicals enhance Na+/Ca2+ exchange in ventricular myocytes. Am J Physiol, 1996, 271(3 Pt 2):H823.
2 Peggy L, Barrington. Interactions of H2O2, EGTA and patch pipette recording methods in feline ventricular myocytes. J Mol Cell Cardial, 1994, 26:557.
3 Elisabetta Cerbai, Giuseppe Ambrosio, Francesco, et al.Cellular electrophysiological basis for oxygen radical-induced arrhythmias. A patch-clamp study in guinea pig ventricular myocytes. Circulation, 1991, 84(4):1773.
4 Satoh H, Matsui K. Electrical and mechanical modulations by oxygen-derived free-radical generating systems in guinea-pig heart muscles. J Pharm Pharmacol, 1997, 49(5):505.
5 徐长庆，王孝铭，范劲松，等.丹参酮II-A对豚鼠单个心室细胞跨膜电位及L-型钙电流的影响.中国病理生理杂志，1997，13(1)：43.
6 Haruaki Nakaya, Youji Takeda, Noritsugu tohse, et al. Mechanism of the membrane depolarization induced by oxidative stress in guinea pig ventricular cells. J Mol Cell Cardiol, 1992, 24:523.
7 徐长庆，李哲泓，王孝铭，等.丹参对豚鼠乳头肌动作电位的影响.哈尔滨医科大学学报，1991， 25(6)：409.
8 徐长庆，娄延平，杨宝峰，等.丹参酮II-A抑制豚鼠单个心肌细胞L型钙电流和缩短动作电位时程效应的相关性分析.中国药理学通报，1998，14(5)：428.
9 Carmeliet E. K+ channels and control of ventricular repolarization in the heart. Fundam Clin Pharmacol, 1993, 7(1):19.
10 Surawicz B. Role of potassium channels in cycle length dependent regulation of action potential duration in mammalian cardiac Purkinje and ventricular muscle fibres. Cardiovasc Res, 1992, 26(11):1021.
(1998年12月25日收稿，1999年4月20日修回)