眼镜蛇毒因子对油酸型肺损伤大鼠外周血白细胞数目和功能的影响
作者：叶春玲 曹艳英 熊爱华 钟 玲
单位：暨南大学医学院药理学教研组(广州 510632)
关键词：眼镜蛇毒液类；油酸类；补体；白细胞
眼镜蛇毒因子对油酸型肺损伤大鼠外周 血白细胞数目和功能的影响 摘 要 目的：观察眼镜蛇毒因子(CVF)对油酸型肺损伤大鼠外周血白细胞数目和功能的影响。方法：实验前24 h CVF 1 mg.kg-1 ip使补体耗竭。油酸0.1 mL.kg-1iv致大鼠油酸型肺损伤病理模型。采用亚硝酸法测定白细胞SOD活力；白细胞吞噬功能测定则采用吞噬金葡菌法，粘附功能测定则采用玻璃血球计数板法。结果：CVF耗竭体内补体，能显著对抗油酸引起的白细胞吞噬和粘附功能的升高及超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，使白细胞的吞噬率从(52±6)%下降至(30±5)%，粘附率从(93±11)%下降至(82±10)%；减少氧自由基的产生，白细胞SOD活性下降明显受到抑制。但对油酸引起的白细胞数目增加无明显影响。结论：CVF减轻油酸型肺损伤的作用机制可能与补体耗竭后引起的白细胞功能抑制有关。
, 百拇医药
Effect of cobra venom factor on the number and action of leukocytes
in rats with pulmonary injury induced by oleic acid
YE Chun-Ling,CAO Yan-Ying,XIONG Ai-Hua,ZHONG Ling
Department of Pharmacology,Medical College of Jinan University,Guangzhou (510632)
Abstract AIM:The effect of cobra venom factor (CVF) on the number and action of leukocytes in rats with pulmonary injury induced by oleic acid was investigated.METHODS：Oleic acid (0.1 mL.kg-1 iv ) was given to rats to induce pulmonary injuries which served as a pathological model of respiratory distress syndrome. CVF 1.0 mg.kg-1ip,given to rats 24 h prior to oleic acid injection to deplete blood complement.The method of nitrite reaction was used for the superoxide dismutase (SOD)activity determination of leukocytes;and the method of phagocytose staphylococcus aureus for the phagocytic function;the blood cell counting plate for the adhesion function of leukocytes.RESULTS：CVF showed prominent effects against the action and SOD activity changes of leukocytes induced by oleic acid:decrease in leukocyte bacteriophagic percentage (from 52%±6%to 30%±5%),the leukocyte adherence percentage (from 93%±11% to 82%±10%);attenuate in production of oxygen free radicals,fall of SOD activity was significant prevented.However, there were no significant effect on the leukocytosis induced by oleic acid.CONCLUSION：Complement may be involved in the mediation of leukocyte action,and the protection mechanism that CVF could attenuate the pulmonary injuries may be related to the depression of leukocyte function caused by the complement depletion.
, 百拇医药
MeSH Cobra venoms; Oleic acids; Complement; Leukocytes
眼镜蛇毒因子(cobra venom factor,CVF),又称抗补体因子，是来源于眼镜蛇毒性质稳定的抗补体蛋白，能通过耗竭补体C3、C5而发挥抗补体作用[1]。我们曾发现，用CVF耗竭体内补体，可显著减轻大鼠油酸型肺损伤程度[2]。由于白细胞在油酸型肺损伤起着重要作用[3]，CVF的保护作用是否与补体耗竭后引起的白细胞功能改变有关?为此，本实验通过对外周血白细胞数目及其吞噬和粘附功能以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性的测定，进一步探讨CVF对抗油酸型肺损伤的机制。
材料与方法
(一) 材料：Sprague-Dawley雄性大鼠，体重180～220 g，由中山医科大学实验动物中心提供。CVF，本实验室从中华眼镜蛇毒(Naja naja atra)中提取[4]；油酸，分析纯，广州新港化工厂；SOD测定盒，南京建成生物研究所提供。
, 百拇医药
(二) 实验方法：将大鼠随机分为3组，即空白对照组，油酸组和CVF+油酸组。实验前24 h CVF 1 mg.kg-1ip使补体耗竭(<2.5%)。3%戊巴比妥钠40 mg.kg-1ip麻醉，分离颈总动脉。油酸0.1 mL.kg-1iv,于不同时间取血及处死大鼠。按临床常规检验方法进行白细胞计数和分类.按Grier等[5]方法测定血清补体水平。
(三)白细胞功能的测定：采用密度梯度离心法将白细胞从全血中分离，台盼蓝染色活力大于98%，然后用亚硝酸法[6]测定白细胞SOD活性。白细胞吞噬功能测定则采用吞噬金葡菌法[7]，粘附功能测定则采用玻璃血球计数板法[8]。
, 百拇医药
(四) 统计处理：实验数据以
±s表示，用t检验分析不同实验组间的差异显著性。
结 果
(一) 对外周血白细胞数目和分类的影响：结果见表1，油酸组5 min时外周血白细胞计数暂时少于空白对照组，然后持续显著高于对照组；分类检查发现多形核白细胞(polymorphonuclearleukocytes,PMN)和淋巴细胞时相变化与外周血白细胞计数的变化一致，也是先暂低后持续高于对照组，但以PMN更为明显。CVF耗竭补体对油酸引起的外周血白细胞计数及分类的时相改变无明显影响。
(二) 对白细胞SOD活性，吞噬和粘附功能的影响：结果见表2，油酸组从5 min开始持续表现为PMN-SOD活性低于空白对照组，噬菌率和粘附率高于对照组。CVF耗竭补体可使PMN的噬菌率和粘附率低于油酸组(0 min)；且使油酸引起的PMN-SOD活性以及吞噬和粘附功能变化较油酸组出现晚，30 min时SOD活性才开始低于对照组，噬菌率高于对照组；60 min时粘附率才高于对照组；且降低或升高的程度均显著低于油酸组。
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表1 CVF耗竭补体对油酸型肺损伤大鼠外周血白细胞数目和分类的影响
Tab 1 Effect of complement depletion by CVF on the count and classification of leukocytes in peripheral blood of the rats following oleic acid(OA) injection (±s,n=10)
0
5
30
60
, http://www.100md.com
120
240 (min)
White blood cell(×109.L-1)
Control
15±4
14±4
15±4
15±4
14±3
15±5
OA
, http://www.100md.com
15±4
10±3*
27±7**
27±12**
22±7**
22±7**
CVF+OA
16±5
10±2*
21±6**
28±10**
, 百拇医药
27±10**
27±10**
PMN(×109.L-1)
Control
3.0±0.9
2.8±1.2
2.8±1.2
3.0±0.8
3.0±0.7
3.0±1.0
, 百拇医药
OA
3.0±0.9
2.0±0.7*
5.3±1.5**
6.4±2.1**
8.2±2.8**
14.1±6.4**
CVF+OA
3.2±1.2
2.2±0.7*
, http://www.100md.com 5.8±1.6**
5.2±1.3**
7.9±1.7**
14.0±7.2**
Lymphocytes(×109*L-1)
Control
11±4
11±3
11±3
11±4
, http://www.100md.com 11±4
11±5
OA
11±3
8±3*
16±6*
21±11**
18±5**
12±8
CVF+OA
12±4
8±3*
, 百拇医药
15±7*
21±9**
19±5**
12±7
CVF 1.0 mg*kg-1ip,24 h before OA 0.1 mL.kg-1iv.*P<0.05,**P<0.01,vs control group 表2 CVF耗竭补体对油酸型肺损伤大鼠外周血白细胞超氧化物歧化酶、吞噬和粘附功能的影响
Tab 2 Effect of complement depletion by CVF on leukocyte SOD activity,bacteriophagic and adherence percentage in the rats following oleic acid injection(±s，n=10)
, 百拇医药
0
5
30
60
120
240 (min)
SOD activity (μmol.min-1.g-1)
Control
2.2±0.3
2.3±0.2
, 百拇医药
2.2±0.1
2.2±0.2
2.1±0.2
2.2±0.3
OA
2.2±0.2
1.4±0.3**
1.2±0.1**
1.2±0.2**
1.1±0.1**
1.1±0.2**
CVF+OA
, 百拇医药
2.2±0.1
2.2±0.1#
1.7±0.2#*
1.6±0.3#*
1.7±0.2#*
2.0±0.2##
Bacteriophagic percentage(%)
Control
20.1±5.5
21.4±4.8
19.8±5.6
, http://www.100md.com
20.4±5.4
21.1±6.0
21.4±5.1
OA
21.4±5.4
38.7±6.9**
39.0±6.0**
42.8±5.5**
37.4±6.1**
40.7±6.7**
CVF+OA
14.1±4.3#*
, http://www.100md.com
15.2±3.2##*
28.3±5.7#*
26.8±4.9##*
27.0±5.9#*
29.9±6.8#*
Adherence percentage(%)
Control
72.2±9.5
70.6±8.4
72.4±9.3
74.1±10.4
, 百拇医药
72.3±9.4
73.3±8,7
OA
73.4±9.3
84.1±10.6*
86.8±9.8*
90.4±11.0*
88.3*±10.5*
92.9±11.4*
CVF+OA
60.1±7.5#*
61.3±8.0##*
, 百拇医药
75.7±8.8#
80.2±9.8#*
79.3±8.6#*
82.4±9.7#*
CVF 1.0 mg.kg-1 ip, 24 h before OA 0.1 mL.kg-1 iv; *P<0.05，**P<0.01，vs control group;#P<0.05,##P<0.01,vs OA group
(三) 血清补体水平：油酸组血清补体水平从5 min开始迅速下降为给药前的(70±10)%，30，60，120和240 min则维持在约47%的水平上。CVF+油酸组大鼠体内补体基本被耗竭，在整个实验观察的240 min内均低于2.5%。 讨 论
, 百拇医药
本实验发现，注射油酸后大鼠血清补体水平显著下降，提示在油酸型肺损伤的发生过程中有补体的激活和消耗。与其同时，外周血白细胞计数先短暂下降随后显著升高；白细胞吞噬和粘附功能增强；表明多形核白细胞被激活。活化的白细胞易粘附至微血管壁，并游出血管外，浸润至炎性肺组织[2]。这些结果可能与补体激活产生的活性片段C3a,C5a有关[3]。C3a和C5a可激活、趋化白细胞向肺毛细血管床转移，大量的白细胞聚集在肺组织，使外周血白细胞数目急剧减少；随后，由于骨髓白细胞大量释放，使外周血白细胞数显著升高。此结果与其它文献报道一致[9]。此外，激活的白细胞通过“呼吸爆发”释放大量氧自由基等，最终导致肺组织损伤[10]。本实验也发现白细胞SOD活性显著下降，可能反映了白细胞产生的氧自由基大量增加。
预先用CVF 1 mg.kg-1ip耗竭补体，本实验发现能显著降低白细胞的吞噬和粘附功能，提示补体可能参与白细胞功能的调节，耗竭补体则能抑制白细胞功能。此外，CVF在显著减轻油酸型肺损伤的同时，能对抗油酸引起的白细胞功能升高，其吞噬和粘附功能以及SOD活性的变化均较油酸组出现晚且程度较轻。提示CVF对油酸型肺损伤的保护作用可能与补体耗竭后引起的白细胞功能抑制有关。不过，CVF耗竭补体并不能对抗油酸引起的白细胞数目的增加，这可能除补体活性片段C3a，C5a等外，其它炎性物质也可能引起白细胞数目的增加。
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* 国务院侨办重点学科科研基金资助(No.93-95-7)
* 广东省自然科学基金项目(No. 974026)
参考文献
1 Gowda DC,Petrella EC,Raj TT,et al.Immunoreactivity and function of oligosaccharides in cobra venom factor.J Immunol,1994,152:2977.
2 叶春玲，黄守坚，孙家钧，等.眼镜蛇毒因子对大鼠油酸型肺损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1997，11：50.
3 Till GO,Friedl HP,Ward PA.Lung injury and complement activation:role of neutrophils and xanthine oxidase.Free Radic Biol Med, 1991,10:379.
, http://www.100md.com
4 叶春玲，黄守坚，孙家钧，等.一种从蛇毒中分离提纯抗补体因子的简便方法.中国药理学通报，1997，13：85.
5 Grier AH,Vogel CW.The oligosaccharide chains of cobra venom factors are required for complement activation.Mol Immunol,1989,26:563
6 Oyanagui Y.Reevaluation of assay methosds and establishment of kit for superoxide dismutase activity.Anal Biochem,1984,142:290.
7 唐汝愚，姚丹帆，何凤慈，等.消炎痛和苯丙酸衍生物对小白鼠腹腔白细胞数目、巨噬细胞吞噬功能及细胞内cAMP含量的影响.第三军医大学学报，1985，7：13.
, http://www.100md.com
8 Halliday WJ,Maluish A,Isbister WH. Detection of anti-tumour cell mediated immunity and serum blocking factors in cancer patients by the leukocyte adherence inhibition test.Br J Cancer,1974,29:31.
9 张建龙，王建中，郭 炯.白细胞和血小板在实验性肺损伤中的动态变化和作用.中国病理生理杂志，1989，5：46.
10 赵 洪，孙秉庸，郭胜祥，等.白细胞及其释放的氧自由基在活化补体导致急性肺损伤中的作用.中国病理生理杂志，1990，6：95.
(1998年3月2日收稿，1998年11月23日修回), http://www.100md.com
单位：暨南大学医学院药理学教研组(广州 510632)
关键词：眼镜蛇毒液类；油酸类；补体；白细胞
眼镜蛇毒因子对油酸型肺损伤大鼠外周 血白细胞数目和功能的影响 摘 要 目的：观察眼镜蛇毒因子(CVF)对油酸型肺损伤大鼠外周血白细胞数目和功能的影响。方法：实验前24 h CVF 1 mg.kg-1 ip使补体耗竭。油酸0.1 mL.kg-1iv致大鼠油酸型肺损伤病理模型。采用亚硝酸法测定白细胞SOD活力；白细胞吞噬功能测定则采用吞噬金葡菌法，粘附功能测定则采用玻璃血球计数板法。结果：CVF耗竭体内补体，能显著对抗油酸引起的白细胞吞噬和粘附功能的升高及超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，使白细胞的吞噬率从(52±6)%下降至(30±5)%，粘附率从(93±11)%下降至(82±10)%；减少氧自由基的产生，白细胞SOD活性下降明显受到抑制。但对油酸引起的白细胞数目增加无明显影响。结论：CVF减轻油酸型肺损伤的作用机制可能与补体耗竭后引起的白细胞功能抑制有关。
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Effect of cobra venom factor on the number and action of leukocytes
in rats with pulmonary injury induced by oleic acid
YE Chun-Ling,CAO Yan-Ying,XIONG Ai-Hua,ZHONG Ling
Department of Pharmacology,Medical College of Jinan University,Guangzhou (510632)
Abstract AIM:The effect of cobra venom factor (CVF) on the number and action of leukocytes in rats with pulmonary injury induced by oleic acid was investigated.METHODS：Oleic acid (0.1 mL.kg-1 iv ) was given to rats to induce pulmonary injuries which served as a pathological model of respiratory distress syndrome. CVF 1.0 mg.kg-1ip,given to rats 24 h prior to oleic acid injection to deplete blood complement.The method of nitrite reaction was used for the superoxide dismutase (SOD)activity determination of leukocytes;and the method of phagocytose staphylococcus aureus for the phagocytic function;the blood cell counting plate for the adhesion function of leukocytes.RESULTS：CVF showed prominent effects against the action and SOD activity changes of leukocytes induced by oleic acid:decrease in leukocyte bacteriophagic percentage (from 52%±6%to 30%±5%),the leukocyte adherence percentage (from 93%±11% to 82%±10%);attenuate in production of oxygen free radicals,fall of SOD activity was significant prevented.However, there were no significant effect on the leukocytosis induced by oleic acid.CONCLUSION：Complement may be involved in the mediation of leukocyte action,and the protection mechanism that CVF could attenuate the pulmonary injuries may be related to the depression of leukocyte function caused by the complement depletion.
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MeSH Cobra venoms; Oleic acids; Complement; Leukocytes
眼镜蛇毒因子(cobra venom factor,CVF),又称抗补体因子，是来源于眼镜蛇毒性质稳定的抗补体蛋白，能通过耗竭补体C3、C5而发挥抗补体作用[1]。我们曾发现，用CVF耗竭体内补体，可显著减轻大鼠油酸型肺损伤程度[2]。由于白细胞在油酸型肺损伤起着重要作用[3]，CVF的保护作用是否与补体耗竭后引起的白细胞功能改变有关?为此，本实验通过对外周血白细胞数目及其吞噬和粘附功能以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性的测定，进一步探讨CVF对抗油酸型肺损伤的机制。
材料与方法
(一) 材料：Sprague-Dawley雄性大鼠，体重180～220 g，由中山医科大学实验动物中心提供。CVF，本实验室从中华眼镜蛇毒(Naja naja atra)中提取[4]；油酸，分析纯，广州新港化工厂；SOD测定盒，南京建成生物研究所提供。
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(二) 实验方法：将大鼠随机分为3组，即空白对照组，油酸组和CVF+油酸组。实验前24 h CVF 1 mg.kg-1ip使补体耗竭(<2.5%)。3%戊巴比妥钠40 mg.kg-1ip麻醉，分离颈总动脉。油酸0.1 mL.kg-1iv,于不同时间取血及处死大鼠。按临床常规检验方法进行白细胞计数和分类.按Grier等[5]方法测定血清补体水平。
(三)白细胞功能的测定：采用密度梯度离心法将白细胞从全血中分离，台盼蓝染色活力大于98%，然后用亚硝酸法[6]测定白细胞SOD活性。白细胞吞噬功能测定则采用吞噬金葡菌法[7]，粘附功能测定则采用玻璃血球计数板法[8]。
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(四) 统计处理：实验数据以
±s表示，用t检验分析不同实验组间的差异显著性。结 果
(一) 对外周血白细胞数目和分类的影响：结果见表1，油酸组5 min时外周血白细胞计数暂时少于空白对照组，然后持续显著高于对照组；分类检查发现多形核白细胞(polymorphonuclearleukocytes,PMN)和淋巴细胞时相变化与外周血白细胞计数的变化一致，也是先暂低后持续高于对照组，但以PMN更为明显。CVF耗竭补体对油酸引起的外周血白细胞计数及分类的时相改变无明显影响。
(二) 对白细胞SOD活性，吞噬和粘附功能的影响：结果见表2，油酸组从5 min开始持续表现为PMN-SOD活性低于空白对照组，噬菌率和粘附率高于对照组。CVF耗竭补体可使PMN的噬菌率和粘附率低于油酸组(0 min)；且使油酸引起的PMN-SOD活性以及吞噬和粘附功能变化较油酸组出现晚，30 min时SOD活性才开始低于对照组，噬菌率高于对照组；60 min时粘附率才高于对照组；且降低或升高的程度均显著低于油酸组。
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表1 CVF耗竭补体对油酸型肺损伤大鼠外周血白细胞数目和分类的影响
Tab 1 Effect of complement depletion by CVF on the count and classification of leukocytes in peripheral blood of the rats following oleic acid(OA) injection (
±s,n=10)0
5
30
60
, http://www.100md.com
120
240 (min)
White blood cell(×109.L-1)
Control
15±4
14±4
15±4
15±4
14±3
15±5
OA
, http://www.100md.com
15±4
10±3*
27±7**
27±12**
22±7**
22±7**
CVF+OA
16±5
10±2*
21±6**
28±10**
, 百拇医药
27±10**
27±10**
PMN(×109.L-1)
Control
3.0±0.9
2.8±1.2
2.8±1.2
3.0±0.8
3.0±0.7
3.0±1.0
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OA
3.0±0.9
2.0±0.7*
5.3±1.5**
6.4±2.1**
8.2±2.8**
14.1±6.4**
CVF+OA
3.2±1.2
2.2±0.7*
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5.2±1.3**
7.9±1.7**
14.0±7.2**
Lymphocytes(×109*L-1)
Control
11±4
11±3
11±3
11±4
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11±5
OA
11±3
8±3*
16±6*
21±11**
18±5**
12±8
CVF+OA
12±4
8±3*
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15±7*
21±9**
19±5**
12±7
CVF 1.0 mg*kg-1ip,24 h before OA 0.1 mL.kg-1iv.*P<0.05,**P<0.01,vs control group 表2 CVF耗竭补体对油酸型肺损伤大鼠外周血白细胞超氧化物歧化酶、吞噬和粘附功能的影响
Tab 2 Effect of complement depletion by CVF on leukocyte SOD activity,bacteriophagic and adherence percentage in the rats following oleic acid injection(
±s，n=10), 百拇医药
0
5
30
60
120
240 (min)
SOD activity (μmol.min-1.g-1)
Control
2.2±0.3
2.3±0.2
, 百拇医药
2.2±0.1
2.2±0.2
2.1±0.2
2.2±0.3
OA
2.2±0.2
1.4±0.3**
1.2±0.1**
1.2±0.2**
1.1±0.1**
1.1±0.2**
CVF+OA
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2.2±0.1
2.2±0.1#
1.7±0.2#*
1.6±0.3#*
1.7±0.2#*
2.0±0.2##
Bacteriophagic percentage(%)
Control
20.1±5.5
21.4±4.8
19.8±5.6
, http://www.100md.com
20.4±5.4
21.1±6.0
21.4±5.1
OA
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14.1±4.3#*
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15.2±3.2##*
28.3±5.7#*
26.8±4.9##*
27.0±5.9#*
29.9±6.8#*
Adherence percentage(%)
Control
72.2±9.5
70.6±8.4
72.4±9.3
74.1±10.4
, 百拇医药
72.3±9.4
73.3±8,7
OA
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84.1±10.6*
86.8±9.8*
90.4±11.0*
88.3*±10.5*
92.9±11.4*
CVF+OA
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61.3±8.0##*
, 百拇医药
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79.3±8.6#*
82.4±9.7#*
CVF 1.0 mg.kg-1 ip, 24 h before OA 0.1 mL.kg-1 iv; *P<0.05，**P<0.01，vs control group;#P<0.05,##P<0.01,vs OA group
(三) 血清补体水平：油酸组血清补体水平从5 min开始迅速下降为给药前的(70±10)%，30，60，120和240 min则维持在约47%的水平上。CVF+油酸组大鼠体内补体基本被耗竭，在整个实验观察的240 min内均低于2.5%。 讨 论
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本实验发现，注射油酸后大鼠血清补体水平显著下降，提示在油酸型肺损伤的发生过程中有补体的激活和消耗。与其同时，外周血白细胞计数先短暂下降随后显著升高；白细胞吞噬和粘附功能增强；表明多形核白细胞被激活。活化的白细胞易粘附至微血管壁，并游出血管外，浸润至炎性肺组织[2]。这些结果可能与补体激活产生的活性片段C3a,C5a有关[3]。C3a和C5a可激活、趋化白细胞向肺毛细血管床转移，大量的白细胞聚集在肺组织，使外周血白细胞数目急剧减少；随后，由于骨髓白细胞大量释放，使外周血白细胞数显著升高。此结果与其它文献报道一致[9]。此外，激活的白细胞通过“呼吸爆发”释放大量氧自由基等，最终导致肺组织损伤[10]。本实验也发现白细胞SOD活性显著下降，可能反映了白细胞产生的氧自由基大量增加。
预先用CVF 1 mg.kg-1ip耗竭补体，本实验发现能显著降低白细胞的吞噬和粘附功能，提示补体可能参与白细胞功能的调节，耗竭补体则能抑制白细胞功能。此外，CVF在显著减轻油酸型肺损伤的同时，能对抗油酸引起的白细胞功能升高，其吞噬和粘附功能以及SOD活性的变化均较油酸组出现晚且程度较轻。提示CVF对油酸型肺损伤的保护作用可能与补体耗竭后引起的白细胞功能抑制有关。不过，CVF耗竭补体并不能对抗油酸引起的白细胞数目的增加，这可能除补体活性片段C3a，C5a等外，其它炎性物质也可能引起白细胞数目的增加。
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* 国务院侨办重点学科科研基金资助(No.93-95-7)
* 广东省自然科学基金项目(No. 974026)
参考文献
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10 赵 洪，孙秉庸，郭胜祥，等.白细胞及其释放的氧自由基在活化补体导致急性肺损伤中的作用.中国病理生理杂志，1990，6：95.
(1998年3月2日收稿，1998年11月23日修回), http://www.100md.com