肝前性门脉高压大鼠胰岛功能的变化
作者：李善高 王天才 梁扩寰 龚少华 唐望先 杜荔菁
单位：同济医科大学肝病研究所(武汉 430030)
关键词：高血压；门静脉；胰岛；高胰岛素血症；高血糖症
中国病理生理杂志990912 摘 要 目的：探讨肝前性门脉高压大鼠胰岛α、β细胞功能及其与循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平变化的关系。方法：采用部分结扎门静脉的方法复制肝前性门脉高压，假手术及正常鼠的胰岛进行分离和纯化，并对其体外生物学活性进行检测。结果：肝前性门脉高压组大鼠循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平明显高于正常组大鼠(P<0.01)。肝前性门脉高压组大鼠分离纯化的胰岛经体外培养48 h或在含糖基质中孵育2 h后释放胰岛素量明显低于正常，而胰高血糖素明显高于正常(P<0.01)。结论：胰岛α细胞分泌功能增加可能有助于解释高胰高血糖素血症的发生；门脉高压时，循环血液中胰岛素水平增加，但β细胞功能低于正常。
, 百拇医药
Changes of the pancreatic islets function in prehepaticportal hypertensive rats
LI Shan-Gao, WANG Tian-Cai, LIANG Kuo-Huan, GONG Shao-Hua,TANG Wang-Xian, DU Li-Jin
Institute of Liver Disease Tong Ji Hospital Tong Ji Medical University (Wuhan 430030)
Abstract AIM:To find out changes of the pancreatic islets function in prehepatic portal hypertensive rats. METHODS：Portal hypertension was induced by partial portal vein ligation. Pancreatic islets from protal hypertensive, sham and normal rats were isolated by nonenzymatic mechanic methods. Insulin and glucagon secretion were measured in vitro in isolated islets.RESULTS：Portal hypertensive rats exhibited hyperinsulinism and hyperglucagonism compared with control rats (P<0.01). Isolated islets from partial portal vein ligated rats showed impaired insulin secretion after culture for 48 hours or incubation in the presence of glucose for 2 hours, on the contrary, glucagon secretion increased significantly.CONCLUSION：Hyperglucagonism in portal hypertensive rats is promoted by an enhanced a pha-cell secretion, the level of serum insulin is high, however, function of beta-cell secretion is low.
, http://www.100md.com
MeSH Hypertension , portal; Islets of Langerhans; Hyperinsulinism; Hyperglycemia
研究表明，门脉高压患者的循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平增加[1]。但这种变化与胰岛α、β细胞功能之间的关系尚不清楚。本研究旨在探讨门脉高压时胰岛α、β细胞功能变化与循环血液中胰岛素和胰高血糖素水平的关系。
材料与方法
(一) 实验动物及分组：雄性SD大鼠30只，体重170～250 g，由同济医科大学实验动物中心提供。随机分成3组：(1)肝前性门脉高压组(n=11)，采用部分结扎门静脉方法制成肝前性门脉高压模型，方法是在乙醚麻醉下正中切口进腹，游离门静脉主干，将7号钝头的针置门静脉后在胃冠状静脉上方一同结扎，然后移除钝头针，形成门脉缩窄程度一致的肝前性门脉高压[2]；(2)假手术组(n=10)，手术分离门静脉后除不结扎门静脉外，其它操作同肝前性门脉高压组；(3)正常对照组(n=9)，与以上2个组在相同的条件下饲养，但不作任何处理，3个组动物均自由进食和饮水。
, http://www.100md.com
(二) 胰岛分离与纯化：于手术后15 d开始，取以上各组鼠，经乙醚麻醉后，用75%酒精消毒，打开腹腔，自下腔静脉取血3 mL，分离血清，置-20℃冰箱待测胰岛素及胰高血糖素。迅速摘取胰腺，置4℃ Hanks液中漂洗，并用眼科镊将胰腺实质轻轻撕碎，剔出大血管和导管，随即用眼科剪反复剪切，直到胰腺组织体积小于0.25 mm×0.25 mm×0.25 mm。然后将胰腺组织块置于不锈钢筛网(80目)研磨过滤，用4℃ Hanks液反复冲洗，收集沉淀物并纯化。参照胡远峰等[3]方法，即将沉淀物与20% Ficoll 溶液充分混匀，然后依次加入23%、20%、10% Ficoll各2 mL，以形成浓度梯度，以3 000 r/min离心10 min。离心后收集Ficoll溶液第1～2和2～3层间的胰岛，用4℃ Hanks溶液反复洗脱数次，置于RPMI 1640培养液(无血清)中，定容镜下计数，然后进行胰岛生物学活性检测。
(三) 生物学活性检测：(1)胰岛素及胰高血糖素释放置：将纯化胰岛置RPMI 1640培养液中，在37℃、 95% O2、 5%CO2培养48 h，测定培养液中胰岛素及胰高血糖素含量。胰岛素测定采用华西糖尿病科技开发研究所提供的胰岛素放免测试盒；胰高血糖素测定采用北京北方免疫化学试剂研究所提供的胰高血糖素放免测试盒。②胰岛素及胰高血糖素释放试验：将纯化胰岛分别置含低糖(3.30 mmol/L)、低糖(3.30 mmol/L)加精氨酸(10 mmol/L)及高糖(16.65 mmol/L)的无血清培养基质中，在37℃、 95%O2、 5%CO2培养箱中孵育2 h，测定培养液中胰岛素及胰高血糖素含量。
, 百拇医药
(四) 统计处理：数据均用x±s表示，采用2个样本均数之间差异的t检验检验其差异的显著性。
结果
到手术后2周，正常对照组及假手术组动物均存活，门脉高压组存活9只。
(一) 循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平(表1)：
表1 循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平
Tab 1 Plasma insulin and glucagon level(x±s) Group
n
Insulin(mU/L)
Glucagon (ng/L)
, 百拇医药
Portal hypertension
9
62.94±11.17△
266.49±32.06△
Sham
10
11.47±4.12
61.17±9.21
Control
9
11.66±3.56
, http://www.100md.com
66.89±8.71
△P<0.01, vs control
门脉高压组大鼠循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平明显高于正常及假手术组(P<0.01)。表2 胰岛素和胰高血糖素48 h释放量
Tab 2 The secretion levels of insulin and glucagon of
isolated pancreatic islets for 48 h (x±s) Group
n
Insulin
(μU/islet)
Glucagon
, 百拇医药
(pg/islet)
Portal hypertension
9
23.8±3.3△
641.4±28.9△
Sham
10
44.1±4.4
318.7±22.1
Control
9
, 百拇医药 43.9±3.4
319.6±21.3
△P<0.01, vs control
(二) 胰岛素及胰高血糖素释放量(见表2)：
从表2可见，门脉高压组大鼠分离纯化的胰岛经体外培养48 h后，胰岛素释放量明显低于假手术组及正常组；胰高血糖素释放量明显高于假手术及正常组(P<0.01)。
(三) 胰岛素及胰高血糖素释放试验(见表3)：表3 胰岛经不同浓度糖及精氨酸刺激2 h后释放胰岛素及胰高血糖素的量
Tab 3 Insulin (μU/islet) and glucagon (pg/islet) secretion in response to glucose with various concentrations and
, 百拇医药
arginine of isolated pancreatic islets for 2 h(x±s) Group
n
Low glucose
High glucose
Lowglucose+arginine
Insulin
Glucagon
Insulin
Glucagon
Insulin
Glucagon
, 百拇医药
Portal Hyertension
9
25.28±2.37
253.74±17.32△
132.94±13.50△
185.55±31.35△
76.35±11.84△
699.50±21.58△
Sham
10
, 百拇医药
24.9±13.17
161.33±12.91
190.99±22.01
87.93±13.36
51.95±8.73
300.42±14.01
Control
9
25.37±2.48
159.14±13.28
192.12±21.99
, 百拇医药
88.74±14.33
52.5±59.16
301.98±13.96
△P<0.01, vs control
门脉高压组大鼠分离纯化后的胰岛在含低糖基质中孵育2 h释放胰岛素量与正常对照组及假手术组相比，无显著差异(P>0.05)；而胰高血糖素释放量明显高于正常及假手术组(P<0.01)。当预先在含低糖基质中加入精氨酸，则胰岛素和胰高血糖素释放量均较单纯在含低糖基质中增加(P<0.01)。在含高糖基质中，门脉高压组大鼠分离纯化后的胰岛释放胰岛素明显低于正常及假手术组，而胰高血糖素释放量明显高于正常及假手术组(P<0.01)。
讨论
本研究表明：肝前性门脉高压大鼠，虽然其循环血液中出现高胰岛素血症，但β细胞经体外培养48 h及在含高糖基质中孵育2 h后释放胰岛素量均明显低于正常。提示β细胞分泌胰岛素量减少，与Bosch等[4]的结论一致。精氨酸作为一种代谢促泌素，它能促使β细胞膜去极化，引起胰岛素释放量增加[5]，对精氨酸反应正常，说明β细胞膜及离子通道保存完好。胰岛素分泌减少的原因尚不清，可能与以下几个因素有关：(1)β细胞对糖代谢有特异性缺陷，因能量产生不足，使胰岛素产生及分泌减少；(2)门脉高压时，常伴有高氨血症，高氨血症能够降低β细胞内NADPH，及使pH值增加，后二者都能使胰岛素产生和分泌减少[6]。
, http://www.100md.com
与β细胞相反，肝前性门脉高压组大鼠分离纯化后的胰岛经体外培养48 h及在含低糖基质中孵育2 h后释放胰高血糖素量均明显高于正常及假手术组(P<0.01)，提示α细胞分泌胰高血糖素增加。高糖基质并不能使胰高血糖素的异常释放纠正。引起胰高血糖素分泌增加的机制尚不清楚，Marchesine等[7]认为，高氨血症可使胰高血糖素释放增加，胰高血糖素释放量增加可能与血氨增加有关，但确切机制尚需进一步研究。
参 考 文 献
1 Holdsworth CD, Nyel, King E. The effect of porta-caval anastomasis on oral carbohydrate tolerance and on plasma insulin levels. Gut, 1972, 13:58.
2 焦 哲，吴志勇，陈治平，等.肝前性和肝内性门脉高压鼠内脏血流动力学的变化.肝胆胰外科杂志，1995， 7：1.
, http://www.100md.com
3 胡远峰，张 洪，徐静娟，等.大鼠胰腺的胰岛分离与纯化.中华器官移植杂志，1990， 11：51.
4 Bosch J, Gomis K, Kravetz D, et al. Role of spontaneous portal-systemic shunting in hyperinsulinism of cirrhosis. Am J Physiol, 1984, 2:G206.
5 Malaisse WJ, Blachier F, Mourtada A, et al. Stimulus-secretion coupling of arginine-induced insulin release, metabolism of L-arginine and L-ornithine in pancreatic islets. Biochem Biophy Acta, 1989, 1018:133.
, http://www.100md.com
6 Sener A, Hutton JC, Kawazus, et al. The stimulus-secretion coupling of glucose-induced insulin release, metabolism and function effects of NH4+- in rats. J Clin Invest, 1978, 62:868.
7 Marchesini G, Zoli M, Pondi C, et al. Ammonia-induced changes in pancreatic hormous and plasma amino acids in patients with liver cirrhosis. Dig Dis Sci, 1982, 27:406.
(1998年3月4日收稿，1998年11月11日修回), 百拇医药
单位：同济医科大学肝病研究所(武汉 430030)
关键词：高血压；门静脉；胰岛；高胰岛素血症；高血糖症
中国病理生理杂志990912 摘 要 目的：探讨肝前性门脉高压大鼠胰岛α、β细胞功能及其与循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平变化的关系。方法：采用部分结扎门静脉的方法复制肝前性门脉高压，假手术及正常鼠的胰岛进行分离和纯化，并对其体外生物学活性进行检测。结果：肝前性门脉高压组大鼠循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平明显高于正常组大鼠(P<0.01)。肝前性门脉高压组大鼠分离纯化的胰岛经体外培养48 h或在含糖基质中孵育2 h后释放胰岛素量明显低于正常，而胰高血糖素明显高于正常(P<0.01)。结论：胰岛α细胞分泌功能增加可能有助于解释高胰高血糖素血症的发生；门脉高压时，循环血液中胰岛素水平增加，但β细胞功能低于正常。
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Changes of the pancreatic islets function in prehepaticportal hypertensive rats
LI Shan-Gao, WANG Tian-Cai, LIANG Kuo-Huan, GONG Shao-Hua,TANG Wang-Xian, DU Li-Jin
Institute of Liver Disease Tong Ji Hospital Tong Ji Medical University (Wuhan 430030)
Abstract AIM:To find out changes of the pancreatic islets function in prehepatic portal hypertensive rats. METHODS：Portal hypertension was induced by partial portal vein ligation. Pancreatic islets from protal hypertensive, sham and normal rats were isolated by nonenzymatic mechanic methods. Insulin and glucagon secretion were measured in vitro in isolated islets.RESULTS：Portal hypertensive rats exhibited hyperinsulinism and hyperglucagonism compared with control rats (P<0.01). Isolated islets from partial portal vein ligated rats showed impaired insulin secretion after culture for 48 hours or incubation in the presence of glucose for 2 hours, on the contrary, glucagon secretion increased significantly.CONCLUSION：Hyperglucagonism in portal hypertensive rats is promoted by an enhanced a pha-cell secretion, the level of serum insulin is high, however, function of beta-cell secretion is low.
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MeSH Hypertension , portal; Islets of Langerhans; Hyperinsulinism; Hyperglycemia
研究表明，门脉高压患者的循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平增加[1]。但这种变化与胰岛α、β细胞功能之间的关系尚不清楚。本研究旨在探讨门脉高压时胰岛α、β细胞功能变化与循环血液中胰岛素和胰高血糖素水平的关系。
材料与方法
(一) 实验动物及分组：雄性SD大鼠30只，体重170～250 g，由同济医科大学实验动物中心提供。随机分成3组：(1)肝前性门脉高压组(n=11)，采用部分结扎门静脉方法制成肝前性门脉高压模型，方法是在乙醚麻醉下正中切口进腹，游离门静脉主干，将7号钝头的针置门静脉后在胃冠状静脉上方一同结扎，然后移除钝头针，形成门脉缩窄程度一致的肝前性门脉高压[2]；(2)假手术组(n=10)，手术分离门静脉后除不结扎门静脉外，其它操作同肝前性门脉高压组；(3)正常对照组(n=9)，与以上2个组在相同的条件下饲养，但不作任何处理，3个组动物均自由进食和饮水。
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(二) 胰岛分离与纯化：于手术后15 d开始，取以上各组鼠，经乙醚麻醉后，用75%酒精消毒，打开腹腔，自下腔静脉取血3 mL，分离血清，置-20℃冰箱待测胰岛素及胰高血糖素。迅速摘取胰腺，置4℃ Hanks液中漂洗，并用眼科镊将胰腺实质轻轻撕碎，剔出大血管和导管，随即用眼科剪反复剪切，直到胰腺组织体积小于0.25 mm×0.25 mm×0.25 mm。然后将胰腺组织块置于不锈钢筛网(80目)研磨过滤，用4℃ Hanks液反复冲洗，收集沉淀物并纯化。参照胡远峰等[3]方法，即将沉淀物与20% Ficoll 溶液充分混匀，然后依次加入23%、20%、10% Ficoll各2 mL，以形成浓度梯度，以3 000 r/min离心10 min。离心后收集Ficoll溶液第1～2和2～3层间的胰岛，用4℃ Hanks溶液反复洗脱数次，置于RPMI 1640培养液(无血清)中，定容镜下计数，然后进行胰岛生物学活性检测。
(三) 生物学活性检测：(1)胰岛素及胰高血糖素释放置：将纯化胰岛置RPMI 1640培养液中，在37℃、 95% O2、 5%CO2培养48 h，测定培养液中胰岛素及胰高血糖素含量。胰岛素测定采用华西糖尿病科技开发研究所提供的胰岛素放免测试盒；胰高血糖素测定采用北京北方免疫化学试剂研究所提供的胰高血糖素放免测试盒。②胰岛素及胰高血糖素释放试验：将纯化胰岛分别置含低糖(3.30 mmol/L)、低糖(3.30 mmol/L)加精氨酸(10 mmol/L)及高糖(16.65 mmol/L)的无血清培养基质中，在37℃、 95%O2、 5%CO2培养箱中孵育2 h，测定培养液中胰岛素及胰高血糖素含量。
, 百拇医药
(四) 统计处理：数据均用x±s表示，采用2个样本均数之间差异的t检验检验其差异的显著性。
结果
到手术后2周，正常对照组及假手术组动物均存活，门脉高压组存活9只。
(一) 循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平(表1)：
表1 循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平
Tab 1 Plasma insulin and glucagon level(x±s) Group
n
Insulin(mU/L)
Glucagon (ng/L)
, 百拇医药
Portal hypertension
9
62.94±11.17△
266.49±32.06△
Sham
10
11.47±4.12
61.17±9.21
Control
9
11.66±3.56
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66.89±8.71
△P<0.01, vs control
门脉高压组大鼠循环血液中胰岛素及胰高血糖素水平明显高于正常及假手术组(P<0.01)。表2 胰岛素和胰高血糖素48 h释放量
Tab 2 The secretion levels of insulin and glucagon of
isolated pancreatic islets for 48 h (x±s) Group
n
Insulin
(μU/islet)
Glucagon
, 百拇医药
(pg/islet)
Portal hypertension
9
23.8±3.3△
641.4±28.9△
Sham
10
44.1±4.4
318.7±22.1
Control
9
, 百拇医药 43.9±3.4
319.6±21.3
△P<0.01, vs control
(二) 胰岛素及胰高血糖素释放量(见表2)：
从表2可见，门脉高压组大鼠分离纯化的胰岛经体外培养48 h后，胰岛素释放量明显低于假手术组及正常组；胰高血糖素释放量明显高于假手术及正常组(P<0.01)。
(三) 胰岛素及胰高血糖素释放试验(见表3)：表3 胰岛经不同浓度糖及精氨酸刺激2 h后释放胰岛素及胰高血糖素的量
Tab 3 Insulin (μU/islet) and glucagon (pg/islet) secretion in response to glucose with various concentrations and
, 百拇医药
arginine of isolated pancreatic islets for 2 h(x±s) Group
n
Low glucose
High glucose
Lowglucose+arginine
Insulin
Glucagon
Insulin
Glucagon
Insulin
Glucagon
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Portal Hyertension
9
25.28±2.37
253.74±17.32△
132.94±13.50△
185.55±31.35△
76.35±11.84△
699.50±21.58△
Sham
10
, 百拇医药
24.9±13.17
161.33±12.91
190.99±22.01
87.93±13.36
51.95±8.73
300.42±14.01
Control
9
25.37±2.48
159.14±13.28
192.12±21.99
, 百拇医药
88.74±14.33
52.5±59.16
301.98±13.96
△P<0.01, vs control
门脉高压组大鼠分离纯化后的胰岛在含低糖基质中孵育2 h释放胰岛素量与正常对照组及假手术组相比，无显著差异(P>0.05)；而胰高血糖素释放量明显高于正常及假手术组(P<0.01)。当预先在含低糖基质中加入精氨酸，则胰岛素和胰高血糖素释放量均较单纯在含低糖基质中增加(P<0.01)。在含高糖基质中，门脉高压组大鼠分离纯化后的胰岛释放胰岛素明显低于正常及假手术组，而胰高血糖素释放量明显高于正常及假手术组(P<0.01)。
讨论
本研究表明：肝前性门脉高压大鼠，虽然其循环血液中出现高胰岛素血症，但β细胞经体外培养48 h及在含高糖基质中孵育2 h后释放胰岛素量均明显低于正常。提示β细胞分泌胰岛素量减少，与Bosch等[4]的结论一致。精氨酸作为一种代谢促泌素，它能促使β细胞膜去极化，引起胰岛素释放量增加[5]，对精氨酸反应正常，说明β细胞膜及离子通道保存完好。胰岛素分泌减少的原因尚不清，可能与以下几个因素有关：(1)β细胞对糖代谢有特异性缺陷，因能量产生不足，使胰岛素产生及分泌减少；(2)门脉高压时，常伴有高氨血症，高氨血症能够降低β细胞内NADPH，及使pH值增加，后二者都能使胰岛素产生和分泌减少[6]。
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与β细胞相反，肝前性门脉高压组大鼠分离纯化后的胰岛经体外培养48 h及在含低糖基质中孵育2 h后释放胰高血糖素量均明显高于正常及假手术组(P<0.01)，提示α细胞分泌胰高血糖素增加。高糖基质并不能使胰高血糖素的异常释放纠正。引起胰高血糖素分泌增加的机制尚不清楚，Marchesine等[7]认为，高氨血症可使胰高血糖素释放增加，胰高血糖素释放量增加可能与血氨增加有关，但确切机制尚需进一步研究。
参 考 文 献
1 Holdsworth CD, Nyel, King E. The effect of porta-caval anastomasis on oral carbohydrate tolerance and on plasma insulin levels. Gut, 1972, 13:58.
2 焦 哲，吴志勇，陈治平，等.肝前性和肝内性门脉高压鼠内脏血流动力学的变化.肝胆胰外科杂志，1995， 7：1.
, http://www.100md.com
3 胡远峰，张 洪，徐静娟，等.大鼠胰腺的胰岛分离与纯化.中华器官移植杂志，1990， 11：51.
4 Bosch J, Gomis K, Kravetz D, et al. Role of spontaneous portal-systemic shunting in hyperinsulinism of cirrhosis. Am J Physiol, 1984, 2:G206.
5 Malaisse WJ, Blachier F, Mourtada A, et al. Stimulus-secretion coupling of arginine-induced insulin release, metabolism of L-arginine and L-ornithine in pancreatic islets. Biochem Biophy Acta, 1989, 1018:133.
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6 Sener A, Hutton JC, Kawazus, et al. The stimulus-secretion coupling of glucose-induced insulin release, metabolism and function effects of NH4+- in rats. J Clin Invest, 1978, 62:868.
7 Marchesini G, Zoli M, Pondi C, et al. Ammonia-induced changes in pancreatic hormous and plasma amino acids in patients with liver cirrhosis. Dig Dis Sci, 1982, 27:406.
(1998年3月4日收稿，1998年11月11日修回), 百拇医药