急性心肌梗塞患者外周血T淋巴细胞表达CD25及其对刺激剂反应能力的变化
作者：张志方 王巍嵩 张春艳 吕 品 林文健
单位：中山医科大学基础医学院(广州510089)
关键词：心肌梗塞；T淋巴细胞亚群；抗原；CD25
急性心肌梗塞患者外周血T淋巴细胞表达CD25及其对刺激剂反应能力的变化 摘 要 目的：研究急性心肌梗塞患者外周血T淋巴细胞表达CD25及其对刺激剂反应能力的变化。方法：流式细胞仪技术。结果：急性心肌梗塞患者外周血淋巴细胞CD25+、CD+4和CD+4/CD+8比值明显低于对照组，CD+8高于对照组；CD+3 CD25+、CD+4 CD25+和CD+4 CD25+/ CD+8 CD25+显著降低。在培养前后，CD+3 CD25+表达均显著降低；在PDB刺激情况下，CD+3CD25+、CD+8CD25+表达均显著降低。结论：急性心肌梗塞患者存在细胞免疫功能紊乱，并存在对刺激剂PDB的反应能力降低。
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Changes of CD25 expression in T-lymphocyte subsets of peripheral blood and its competence responded to activating agents in patients with acute myocardial infarction
ZHANG Zhi-Fang1, WANG Wei-Song2, ZHANG Chun-Yan1,LU Pin2, LIN Wen-Jian1
1.School of Preclinical Medicine of SUMS,Guangzhou (510089)
2. Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of JNUMC, Guangzhou (510632)
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Abstract AIM:To observe changes of CD25 expression of T-lymphocyte subsets of peripheral blood and its competence responded to activating agents in patients with acute myocardial infarction. METHODS: Flow cytometric analysis. RESULTS: The percentages of CD+4 T-lymphocytes , CD25+ and the ratio of CD+4/CD+8 were significantly decreased in patients with acute myocardial infarction. The percentages of CD+3 CD25+、CD+4 CD25+ and the ratio of CD+4 CD25+/CD+8 CD25+ were also decreased significantly. The percentages of CD25 expression of T-lymphocytes were decreased after culture or using PDB (phorbol 12, 13-dibutyrate). The percentages of CD25 on CD+8 T-lymphocytes also decreased after using PDB. CONCLUSION: The disturbance of T-lymphocyte subsets and activated T-lymphocyte subsets were present in patients with acute myocardial infarction. There are lower competence of T-lymphocytes response to PDB in patients with acute myocardial infarction.
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MeSH Myocardial infarction； T-lymphocyte subsets；Antigens, CD25
实验表明，发生粥样硬化的冠状动脉内膜及斑块中有补体和免疫球蛋白沉积以及T细胞白细胞介素2受体(interleukin-2 receptor,IL-2R)表达，给予外源白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)引起人和分离的大鼠心血管功能抑制[1]。机体免疫功能紊乱可能参与急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)的发生，间接或直接引起梗塞面积扩大或并发症的发生[2,3]；为进一步研究AMI患者细胞免疫功能的变化，本研究利用双色免疫荧光标记流式细胞仪技术和体外淋巴细胞活化实验观察急性心肌梗塞患者外周血活性T淋巴细胞亚群和IL-2R阳性细胞(CD25+细胞)的变化及其对植物凝集素(phytohemagglutinin, PHA)、沸波醇酯(phorbol 12,13-dibutyrate, PDB)和PDB+ ionomycin(IONO)等刺激剂的反应变化。
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材料和方法
一、研究对象：
根据International Society and Federation of Cardiology / World Health Organization (ISFC/WHO)诊断标准，选择发病5 d内AMI病人15例，其中男性11例，女性4例,平均年龄(66.4±9.5)岁，所有患者均无免疫性疾病和近期感染。正常对照组12例，其中男性8例，女性4例，平均年龄(60.7±8.7)岁，全部来自健康体检者，并经体检和实验室检查确认无心脑血管及肝肾等疾病。
二、试剂：
小鼠抗人荧光标记单克隆抗体anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8、anti-CD25等均购自美国BDIS公司(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose)；
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PHA购自中国科学院上海生物化学研究所；RPMI-1640培养液、 PDB和IONO购自美国Sigma公司。
三、淋巴细胞体外活化：
取AMI患者及正常人外周血5 mL，肝素抗凝。分4组进行全血体外培养。简述如下：(1)抗凝血按1∶1用完全RPMI-1640培养液稀释，在5% CO2、37℃的条件下培养72 h。(2)抗凝血按1∶1用完全RPMI-1640培养液稀释后，分别加入刺激剂PHA (20 μg/mL)、PDB (1×10-7mol/L)和PDB(1×10-7 mol/L)+IONO(2×10-7 mol/L), 在5% CO2、37℃的条件下培养72 h。
四、淋巴细胞荧光抗体标记：
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新鲜的全血30 μL与抗体10 μL混合，室温孵育30 min。红细胞裂解液(0.155 mol/L NH4Cl, 0.01 mol/L KHCO3, 0.1 mol/L EDTA, pH 7.4)裂解红细胞，离心获取有核细胞，用PBS洗涤两次后，加入anti-IgG异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)10 μL, 室温孵育30 min,PBS洗涤。第2次荧光标记方法同上，第2次标记荧光单抗为anti-IgG藻红蛋白(phycoerythrin, PE)。PBS洗涤后用1%多聚甲醛固定10 min后，用流式细胞仪分析。
五、流式细胞仪数据获取和分析：
全部数据用流式细胞仪(美国BD公司)和软件LYSYS Ⅱ进行双色荧光参数获取和分析。简述如下：在前散射和侧散射的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞作FITC和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ(FL1)为FITC，滤过片为(530(10)nm带通，荧光Ⅱ(FL2)为PE，滤光片为(575±10)nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据Isotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阴性、双阳性和单阳性区。
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六、统计处理：
实验数据以x±s表示，用GB-Stat数据统计软件分析实验结果，两组均数比较使用Student t检验。
结果
(一) AMI患者外周血T细胞亚群和CD25表达水平的变化：由表1可看出，AMI患者外周血CD+3无明显改变，CD+4和CD25+显著低于对照组(均P<0.05)，CD+8显著高于对照组(P<0.01)，CD+4/CD+8比值明显降低(P<0.01)。表明AMI患者细胞免疫功能可能受到抑制。
表1 急性心肌梗塞患者外周血T细胞亚群和CD25表达水平的改变
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Tab 1 Changes in peripheral blood T-cell subsets and expressions of CD25 on T-cell in acute myocardial infarction(AMI)(x±s)
Group
n
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
CD25+(%)
CD+4/CD+8
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Control
12
62.8±12.0
40.8±9.4
23.9±10.7
22.4±6.8
1.7±0.6
AMI
15
68.4±8.0
29.1±13.2*
46.6±19.4* *
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14.6±3.4*
0.7±0.3* *
*P<0.05, **P<0.01, vs control
(二) AMI患者T细胞及其亚群表达CD25百分率的变化：见表2结果，CD+3CD25+和CD+4 CD25+显著低于对照组(均P<0.05)，CD+8 CD25+未见明显改变，CD+4 CD25+/CD+8 CD25+显著低于对照组(P<0.05)。说明AMI患者T淋巴细胞及其亚群表达CD25减少。 表2 急性心肌梗塞患者T细胞及其亚群表达CD25百分率的变化
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Tab 2 Changes of CD25 expression on T-lymphocyte and its subsets in patients with acute myocardial infarction(x±s)
Group
n
CD3+CD25+(%)
CD4+CD25+(%)
CD8+CD25+(%)
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CD4+CD25+/CD8+CD25+
Control
12
13.5±3.0
8.3±2.5
6.5±5.8
1.5±0.3
AMI
15
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10.3±4.0
6.1±4.1±*
5.8±5.3
1.1±0.2*
*P<0.05, vs control
(三) PHA、PDB和PDB+IONO对AMI患者T淋巴细胞表达CD+3CD25+百分率的影响：见表3结果，AMI患者外周血淋巴细胞在培养前后表达CD+3CD25+均显著低于对照组(P<0.05和P<0.01)；在PDB刺激情况下，AMI组表达CD+3CD25+显著低于对照组(P<0.01)，显著低于PDB+IONO组(P<0.05)。说明AMI患者淋巴细胞表达CD25的能力较低，对刺激剂PDB的反应能力也显著降低，且可能与细胞内钙离子浓度降低有关。 表3 PHA、PDB和PDB+IONO对急性心肌梗塞患者淋巴细胞表达CD+3CD25+百分率的影响
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Tab 3 Effects of PHA, PDB and PDB+IONO on CD+3CD25+% expression on T-lymphocyte in patients with acute myocardial infarction(%,x±s)
n
BC
AC
PHA
PDB
PDB+IONO
Control
12
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13.4±3.0
17.0±8.6
27.7±17.3
46.4±17.4
56.1±18.8
AMI
15
10.3±4.0*
8.8±3.5* *
26.2±10.5
21.1±14.1*#
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56.5±20.8
BC: before culture; AC: after culture; **P<0.05, *P<0.01, vs control； # P<0.05, vs PDB+IONO group
(四) PHA、PDB和PDB+IONO对AMI患者T淋巴细胞表达CD+8CD25+百分率的影响：见表4结果，在PDB刺激情况下，AMI组表达CD+8CD25+%显著低于对照组(P<0.01)，也显著低于PDB+IONO组(P<0.05)。说明AMI患者淋巴细胞CD8亚群对刺激剂PDB的反应能力也显著降低，也可能与细胞内钙离子浓度降低有关。 表4 PHA、PDB和PDB+IONO对急性心肌梗塞患者淋巴细胞表达CD+8CD25+百分率的影响
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Tab 4 Effects of PHA, PDB and PDB+IONO on CD+8CD25+ expression on T-lymphocyte in patients with acute myocardial infarction(%,x±s)
Group
n
BC
AC
PHA
PDB
PDB+IONO
Control
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12
6.5±5.8
9.8±8.5
15.5±8.1
29.9±20.3
29.4±21.1
AMI
15
5.8±5.3
4.5±1.1
12.0±7.9
16.0±7.3*#
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43.0±20.4
BC: before culture; AC: after culture；**P<0.05, vs control； # P<0.05,vs PDB+IONO group 讨论
AMI患者免疫学指标出现异常已经为多数实验所证实，但AMI患者免疫学功能异常在AMI发病和恢复过程中的作用仍未明了。T淋巴细胞是免疫系统的重要组成之一。T淋巴细胞亚群中发挥免疫调节作用的主要是辅助性T细胞(helper T lymphocytes, TH)和抑制性T细胞(suppressor T lymphocytes, TS)，临床上一般通过检测CD+4/CD+8细胞比值的改变来反映TH/TS细胞比值的改变，从而判断疾病的免疫异常特征。我们的实验结果表明，AMI患者CD+3虽然低于对照组，但无显著性差异；CD+8显著升高，CD+4和CD+4/CD+8比值显著降低；并且CPK值与CD+4/CD+8比值呈负相关性[4]。说明AMI患者免疫功能出现异常，且这种免疫功能异常与AMI发病过程有关。此结果与有关报道相符合[5,6]：AMI患者CD+4/CD+8明显降低;AMI发病4 d内死亡并伴有室性心律失常的患者，其CD+4和CD+4/CD+8比值降低较存活者和无室性心律失常者更明显，长时间CD+4/CD+8比值降低是病人预后不良的指标之一。
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CD25就是IL-2R，存在于活化的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞等的细胞膜上。T淋巴细胞合成和分泌的生长和分化刺激因子IL-2通过与IL-2R结合才能发挥作用。IL-2R的表达是T淋巴细胞激活的重要标志，且淋巴细胞CD25表达与其本身的DNA合成呈平行关系[7,8]。本实验结果表明，AMI患者CD25+细胞显著降低。刘成玉[6]和Kuroki[9]等报道，AMI患者mIL-2R显著降低，也间接支持我们实验中CD25+细胞显著低于正常的结果。但由于CD25也存在于其它细胞上，加上CD+4细胞和CD+8细胞也不是功能一致的细胞群，因此，单一抗原(CD抗原)检测出的T淋巴细胞亚群并不能准确的反映出机体的细胞免疫功能状态。为此，本文采用双色荧光标记技术研究了T淋巴细胞亚群表达CD25的变化。实验结果显示，AMI患者CD+3 CD25+、CD+4 CD25+、CD+8 CD25+和CD+4 CD25+/ CD+8 CD25+均低于正常，其中CD+3 CD25+、CD+4 CD25+和CD+4 CD25+/ CD+8 CD25+均为显著降低。说明不仅T淋巴细胞及其亚群和CD25+细胞低于正常，而且T淋巴细胞及其亚群表达CD25+ 均也低于正常。进一步证实AMI患者活性T淋巴细胞功能异常。
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PHA、PDB和IONO都是T细胞活化刺激剂，分别作用于T细胞活化时信号转导的不同部位。PHA活化T细胞的作用是通过与T细胞表面的TCR肽链的结合而实现。PHA通过使CD3分子的磷酸化而激活磷酯酶Cγ(PLCγ)，PLCγ能使三磷酸肌醇分解产生IP3和DG，由DG激活PKC，从而导致CD25的表达。PDB是DG的类似物，由于能自由透过细胞膜，这样就能绕过细胞膜受体直接激活PKC。IONO则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高；因此，即使细胞膜或内质网本身存在缺陷不能使细胞内的游离钙浓度升高，IONO也能模拟Ca2+依赖的生物学事件。然而IONO单用并不能激活T淋巴细胞，只有PDB+IONO联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法之一[10]。本研究发现，AMI患者CD+3表达CD25在培养前后均显著低于正常对照组，并且对PDB的反应能力降低；CD+8表达CD25正常，但对PDB的反应能力也降低；在PDB+IONO刺激下，CD+3细胞和CD+8细胞表达CD25与对照组相比无显著差异。说明CD+3细胞和CD+8细胞对PDB的反应下降，且这种现象与细胞内钙离子浓度下降有关。详细机制有待于进一步研究。
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我们的实验结果表明，AMI患者T淋巴细胞亚群及其表达CD25异常，活性T淋巴细胞可能处于失衡状态，这种变化与T淋巴细胞本身的细胞免疫功能改变和免疫调节功能改变有关，这种变化可能是影响病情程度和预后的重要原因之一。检测AMI患者T淋巴细胞及其亚群的变化将有助于监测病情和判断预后，积极改善AMI患者的细胞免疫功能，有助于缓解病情。
参考文献
1 Sobotka PA, McMannis J, Fisher RI, et al. Effects of interleukin-2 on cardiac function in the isolated rat heart. J Clin Invest, 1990， 86:845.
2 Kaufman HS, Kvitash VI. Immunologic abnormalities associated with acute ischemic heart disease. Ann Allergy, 1989,63:287.
, http://www.100md.com
3 Blum A, Sclarovxky S, Rehavia E, et al . Levels of T-lymphocytes subpopulations, interleukin-1β, and soluble interleukin-2 receptor in acute myocardial infarction. Am Heart J, 1994,127:1226.
4 王巍嵩，张志方，吕 品，等.急性心肌梗塞患者外周血T淋巴细胞亚群及其表达IL-2R的变化. 中国现代医学杂志，1999，9(5)：24.
5 Syrjala H, Surcel HM, Ilonen J. Low CD+4/CD+8 lymphocyte ratio in acute myocardial infarction. Clin Exp Immunol, 1991,83:326.
, 百拇医药
6 刘成玉，曲彦，谭润鸾.急性心肌梗塞病人血清sIL-2R水平、mIL-2R和T淋巴细胞亚群的变化.高血压杂志，1997，5(1):30.
7 Sharon M, Klausner RD, Cullen BR, et al. Novel interleukin-2 receptor subunit detected by cross-linking under high-affinity conditions. Science , 1986, 234:859.
8 Stuber G, Vanky F, Pocsik E, et al. Expression of interleukin-2 receptor on blood lymphocytes stimulated with allogenic lymphocytes or autologous tumor cells. Cancer Immunol Immunother, 1990, 31:76.
, 百拇医药
9 Kuroki S, Miyahara K, Umenatsu U. Immunological aspects in patients with acute myocardial infarction. Jpn Circ J, 1993,57:37.
10 Lucas JJ, Szepesi A, Modiano JF, et al. Regulation of synthesis and activity of the PLSTIRE protein [cyclin-dependent kinase 6(cdk6)], a major cyclin D-associated cdk4 homologue in normal human T lymphocytes. J Immunol, 1995,154:6275.
(1999年3月18日收稿，1999年6月2日修回), 百拇医药
单位：中山医科大学基础医学院(广州510089)
关键词：心肌梗塞；T淋巴细胞亚群；抗原；CD25
急性心肌梗塞患者外周血T淋巴细胞表达CD25及其对刺激剂反应能力的变化 摘 要 目的：研究急性心肌梗塞患者外周血T淋巴细胞表达CD25及其对刺激剂反应能力的变化。方法：流式细胞仪技术。结果：急性心肌梗塞患者外周血淋巴细胞CD25+、CD+4和CD+4/CD+8比值明显低于对照组，CD+8高于对照组；CD+3 CD25+、CD+4 CD25+和CD+4 CD25+/ CD+8 CD25+显著降低。在培养前后，CD+3 CD25+表达均显著降低；在PDB刺激情况下，CD+3CD25+、CD+8CD25+表达均显著降低。结论：急性心肌梗塞患者存在细胞免疫功能紊乱，并存在对刺激剂PDB的反应能力降低。
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Changes of CD25 expression in T-lymphocyte subsets of peripheral blood and its competence responded to activating agents in patients with acute myocardial infarction
ZHANG Zhi-Fang1, WANG Wei-Song2, ZHANG Chun-Yan1,LU Pin2, LIN Wen-Jian1
1.School of Preclinical Medicine of SUMS,Guangzhou (510089)
2. Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of JNUMC, Guangzhou (510632)
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Abstract AIM:To observe changes of CD25 expression of T-lymphocyte subsets of peripheral blood and its competence responded to activating agents in patients with acute myocardial infarction. METHODS: Flow cytometric analysis. RESULTS: The percentages of CD+4 T-lymphocytes , CD25+ and the ratio of CD+4/CD+8 were significantly decreased in patients with acute myocardial infarction. The percentages of CD+3 CD25+、CD+4 CD25+ and the ratio of CD+4 CD25+/CD+8 CD25+ were also decreased significantly. The percentages of CD25 expression of T-lymphocytes were decreased after culture or using PDB (phorbol 12, 13-dibutyrate). The percentages of CD25 on CD+8 T-lymphocytes also decreased after using PDB. CONCLUSION: The disturbance of T-lymphocyte subsets and activated T-lymphocyte subsets were present in patients with acute myocardial infarction. There are lower competence of T-lymphocytes response to PDB in patients with acute myocardial infarction.
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MeSH Myocardial infarction； T-lymphocyte subsets；Antigens, CD25
实验表明，发生粥样硬化的冠状动脉内膜及斑块中有补体和免疫球蛋白沉积以及T细胞白细胞介素2受体(interleukin-2 receptor,IL-2R)表达，给予外源白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)引起人和分离的大鼠心血管功能抑制[1]。机体免疫功能紊乱可能参与急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)的发生，间接或直接引起梗塞面积扩大或并发症的发生[2,3]；为进一步研究AMI患者细胞免疫功能的变化，本研究利用双色免疫荧光标记流式细胞仪技术和体外淋巴细胞活化实验观察急性心肌梗塞患者外周血活性T淋巴细胞亚群和IL-2R阳性细胞(CD25+细胞)的变化及其对植物凝集素(phytohemagglutinin, PHA)、沸波醇酯(phorbol 12,13-dibutyrate, PDB)和PDB+ ionomycin(IONO)等刺激剂的反应变化。
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材料和方法
一、研究对象：
根据International Society and Federation of Cardiology / World Health Organization (ISFC/WHO)诊断标准，选择发病5 d内AMI病人15例，其中男性11例，女性4例,平均年龄(66.4±9.5)岁，所有患者均无免疫性疾病和近期感染。正常对照组12例，其中男性8例，女性4例，平均年龄(60.7±8.7)岁，全部来自健康体检者，并经体检和实验室检查确认无心脑血管及肝肾等疾病。
二、试剂：
小鼠抗人荧光标记单克隆抗体anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8、anti-CD25等均购自美国BDIS公司(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose)；
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PHA购自中国科学院上海生物化学研究所；RPMI-1640培养液、 PDB和IONO购自美国Sigma公司。
三、淋巴细胞体外活化：
取AMI患者及正常人外周血5 mL，肝素抗凝。分4组进行全血体外培养。简述如下：(1)抗凝血按1∶1用完全RPMI-1640培养液稀释，在5% CO2、37℃的条件下培养72 h。(2)抗凝血按1∶1用完全RPMI-1640培养液稀释后，分别加入刺激剂PHA (20 μg/mL)、PDB (1×10-7mol/L)和PDB(1×10-7 mol/L)+IONO(2×10-7 mol/L), 在5% CO2、37℃的条件下培养72 h。
四、淋巴细胞荧光抗体标记：
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新鲜的全血30 μL与抗体10 μL混合，室温孵育30 min。红细胞裂解液(0.155 mol/L NH4Cl, 0.01 mol/L KHCO3, 0.1 mol/L EDTA, pH 7.4)裂解红细胞，离心获取有核细胞，用PBS洗涤两次后，加入anti-IgG异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)10 μL, 室温孵育30 min,PBS洗涤。第2次荧光标记方法同上，第2次标记荧光单抗为anti-IgG藻红蛋白(phycoerythrin, PE)。PBS洗涤后用1%多聚甲醛固定10 min后，用流式细胞仪分析。
五、流式细胞仪数据获取和分析：
全部数据用流式细胞仪(美国BD公司)和软件LYSYS Ⅱ进行双色荧光参数获取和分析。简述如下：在前散射和侧散射的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞作FITC和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ(FL1)为FITC，滤过片为(530(10)nm带通，荧光Ⅱ(FL2)为PE，滤光片为(575±10)nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据Isotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阴性、双阳性和单阳性区。
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六、统计处理：
实验数据以x±s表示，用GB-Stat数据统计软件分析实验结果，两组均数比较使用Student t检验。
结果
(一) AMI患者外周血T细胞亚群和CD25表达水平的变化：由表1可看出，AMI患者外周血CD+3无明显改变，CD+4和CD25+显著低于对照组(均P<0.05)，CD+8显著高于对照组(P<0.01)，CD+4/CD+8比值明显降低(P<0.01)。表明AMI患者细胞免疫功能可能受到抑制。
表1 急性心肌梗塞患者外周血T细胞亚群和CD25表达水平的改变
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Tab 1 Changes in peripheral blood T-cell subsets and expressions of CD25 on T-cell in acute myocardial infarction(AMI)(x±s)
Group
n
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
CD25+(%)
CD+4/CD+8
, 百拇医药
Control
12
62.8±12.0
40.8±9.4
23.9±10.7
22.4±6.8
1.7±0.6
AMI
15
68.4±8.0
29.1±13.2*
46.6±19.4* *
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14.6±3.4*
0.7±0.3* *
*P<0.05, **P<0.01, vs control
(二) AMI患者T细胞及其亚群表达CD25百分率的变化：见表2结果，CD+3CD25+和CD+4 CD25+显著低于对照组(均P<0.05)，CD+8 CD25+未见明显改变，CD+4 CD25+/CD+8 CD25+显著低于对照组(P<0.05)。说明AMI患者T淋巴细胞及其亚群表达CD25减少。 表2 急性心肌梗塞患者T细胞及其亚群表达CD25百分率的变化
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Tab 2 Changes of CD25 expression on T-lymphocyte and its subsets in patients with acute myocardial infarction(x±s)
Group
n
CD3+CD25+(%)
CD4+CD25+(%)
CD8+CD25+(%)
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CD4+CD25+/CD8+CD25+
Control
12
13.5±3.0
8.3±2.5
6.5±5.8
1.5±0.3
AMI
15
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10.3±4.0
6.1±4.1±*
5.8±5.3
1.1±0.2*
*P<0.05, vs control
(三) PHA、PDB和PDB+IONO对AMI患者T淋巴细胞表达CD+3CD25+百分率的影响：见表3结果，AMI患者外周血淋巴细胞在培养前后表达CD+3CD25+均显著低于对照组(P<0.05和P<0.01)；在PDB刺激情况下，AMI组表达CD+3CD25+显著低于对照组(P<0.01)，显著低于PDB+IONO组(P<0.05)。说明AMI患者淋巴细胞表达CD25的能力较低，对刺激剂PDB的反应能力也显著降低，且可能与细胞内钙离子浓度降低有关。 表3 PHA、PDB和PDB+IONO对急性心肌梗塞患者淋巴细胞表达CD+3CD25+百分率的影响
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Tab 3 Effects of PHA, PDB and PDB+IONO on CD+3CD25+% expression on T-lymphocyte in patients with acute myocardial infarction(%,x±s)
n
BC
AC
PHA
PDB
PDB+IONO
Control
12
, 百拇医药
13.4±3.0
17.0±8.6
27.7±17.3
46.4±17.4
56.1±18.8
AMI
15
10.3±4.0*
8.8±3.5* *
26.2±10.5
21.1±14.1*#
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56.5±20.8
BC: before culture; AC: after culture; **P<0.05, *P<0.01, vs control； # P<0.05, vs PDB+IONO group
(四) PHA、PDB和PDB+IONO对AMI患者T淋巴细胞表达CD+8CD25+百分率的影响：见表4结果，在PDB刺激情况下，AMI组表达CD+8CD25+%显著低于对照组(P<0.01)，也显著低于PDB+IONO组(P<0.05)。说明AMI患者淋巴细胞CD8亚群对刺激剂PDB的反应能力也显著降低，也可能与细胞内钙离子浓度降低有关。 表4 PHA、PDB和PDB+IONO对急性心肌梗塞患者淋巴细胞表达CD+8CD25+百分率的影响
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Tab 4 Effects of PHA, PDB and PDB+IONO on CD+8CD25+ expression on T-lymphocyte in patients with acute myocardial infarction(%,x±s)
Group
n
BC
AC
PHA
PDB
PDB+IONO
Control
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12
6.5±5.8
9.8±8.5
15.5±8.1
29.9±20.3
29.4±21.1
AMI
15
5.8±5.3
4.5±1.1
12.0±7.9
16.0±7.3*#
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43.0±20.4
BC: before culture; AC: after culture；**P<0.05, vs control； # P<0.05,vs PDB+IONO group 讨论
AMI患者免疫学指标出现异常已经为多数实验所证实，但AMI患者免疫学功能异常在AMI发病和恢复过程中的作用仍未明了。T淋巴细胞是免疫系统的重要组成之一。T淋巴细胞亚群中发挥免疫调节作用的主要是辅助性T细胞(helper T lymphocytes, TH)和抑制性T细胞(suppressor T lymphocytes, TS)，临床上一般通过检测CD+4/CD+8细胞比值的改变来反映TH/TS细胞比值的改变，从而判断疾病的免疫异常特征。我们的实验结果表明，AMI患者CD+3虽然低于对照组，但无显著性差异；CD+8显著升高，CD+4和CD+4/CD+8比值显著降低；并且CPK值与CD+4/CD+8比值呈负相关性[4]。说明AMI患者免疫功能出现异常，且这种免疫功能异常与AMI发病过程有关。此结果与有关报道相符合[5,6]：AMI患者CD+4/CD+8明显降低;AMI发病4 d内死亡并伴有室性心律失常的患者，其CD+4和CD+4/CD+8比值降低较存活者和无室性心律失常者更明显，长时间CD+4/CD+8比值降低是病人预后不良的指标之一。
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CD25就是IL-2R，存在于活化的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞等的细胞膜上。T淋巴细胞合成和分泌的生长和分化刺激因子IL-2通过与IL-2R结合才能发挥作用。IL-2R的表达是T淋巴细胞激活的重要标志，且淋巴细胞CD25表达与其本身的DNA合成呈平行关系[7,8]。本实验结果表明，AMI患者CD25+细胞显著降低。刘成玉[6]和Kuroki[9]等报道，AMI患者mIL-2R显著降低，也间接支持我们实验中CD25+细胞显著低于正常的结果。但由于CD25也存在于其它细胞上，加上CD+4细胞和CD+8细胞也不是功能一致的细胞群，因此，单一抗原(CD抗原)检测出的T淋巴细胞亚群并不能准确的反映出机体的细胞免疫功能状态。为此，本文采用双色荧光标记技术研究了T淋巴细胞亚群表达CD25的变化。实验结果显示，AMI患者CD+3 CD25+、CD+4 CD25+、CD+8 CD25+和CD+4 CD25+/ CD+8 CD25+均低于正常，其中CD+3 CD25+、CD+4 CD25+和CD+4 CD25+/ CD+8 CD25+均为显著降低。说明不仅T淋巴细胞及其亚群和CD25+细胞低于正常，而且T淋巴细胞及其亚群表达CD25+ 均也低于正常。进一步证实AMI患者活性T淋巴细胞功能异常。
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PHA、PDB和IONO都是T细胞活化刺激剂，分别作用于T细胞活化时信号转导的不同部位。PHA活化T细胞的作用是通过与T细胞表面的TCR肽链的结合而实现。PHA通过使CD3分子的磷酸化而激活磷酯酶Cγ(PLCγ)，PLCγ能使三磷酸肌醇分解产生IP3和DG，由DG激活PKC，从而导致CD25的表达。PDB是DG的类似物，由于能自由透过细胞膜，这样就能绕过细胞膜受体直接激活PKC。IONO则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高；因此，即使细胞膜或内质网本身存在缺陷不能使细胞内的游离钙浓度升高，IONO也能模拟Ca2+依赖的生物学事件。然而IONO单用并不能激活T淋巴细胞，只有PDB+IONO联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法之一[10]。本研究发现，AMI患者CD+3表达CD25在培养前后均显著低于正常对照组，并且对PDB的反应能力降低；CD+8表达CD25正常，但对PDB的反应能力也降低；在PDB+IONO刺激下，CD+3细胞和CD+8细胞表达CD25与对照组相比无显著差异。说明CD+3细胞和CD+8细胞对PDB的反应下降，且这种现象与细胞内钙离子浓度下降有关。详细机制有待于进一步研究。
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我们的实验结果表明，AMI患者T淋巴细胞亚群及其表达CD25异常，活性T淋巴细胞可能处于失衡状态，这种变化与T淋巴细胞本身的细胞免疫功能改变和免疫调节功能改变有关，这种变化可能是影响病情程度和预后的重要原因之一。检测AMI患者T淋巴细胞及其亚群的变化将有助于监测病情和判断预后，积极改善AMI患者的细胞免疫功能，有助于缓解病情。
参考文献
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4 王巍嵩，张志方，吕 品，等.急性心肌梗塞患者外周血T淋巴细胞亚群及其表达IL-2R的变化. 中国现代医学杂志，1999，9(5)：24.
5 Syrjala H, Surcel HM, Ilonen J. Low CD+4/CD+8 lymphocyte ratio in acute myocardial infarction. Clin Exp Immunol, 1991,83:326.
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6 刘成玉，曲彦，谭润鸾.急性心肌梗塞病人血清sIL-2R水平、mIL-2R和T淋巴细胞亚群的变化.高血压杂志，1997，5(1):30.
7 Sharon M, Klausner RD, Cullen BR, et al. Novel interleukin-2 receptor subunit detected by cross-linking under high-affinity conditions. Science , 1986, 234:859.
8 Stuber G, Vanky F, Pocsik E, et al. Expression of interleukin-2 receptor on blood lymphocytes stimulated with allogenic lymphocytes or autologous tumor cells. Cancer Immunol Immunother, 1990, 31:76.
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9 Kuroki S, Miyahara K, Umenatsu U. Immunological aspects in patients with acute myocardial infarction. Jpn Circ J, 1993,57:37.
10 Lucas JJ, Szepesi A, Modiano JF, et al. Regulation of synthesis and activity of the PLSTIRE protein [cyclin-dependent kinase 6(cdk6)], a major cyclin D-associated cdk4 homologue in normal human T lymphocytes. J Immunol, 1995,154:6275.
(1999年3月18日收稿，1999年6月2日修回), 百拇医药