人类心脏发育相关基因的初步筛选*
作者：刘兰英 顾 军 汤 建 马涧泉
单位：中山医科大学分子医学研究中心(广州 510089)Δ北京医科大学基础心血管研究所
关键词：RNA；信使；脱氧核糖核苷类；杂交；心脏
中国病理生理杂志990905 摘 要 目的：从人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库，通过差减杂交，筛选心脏发育相关基因。方法：①用23周和27周的人胚胎心脏组织构建2个cDNA文库，分别命名为LibF和LibS，用成人心脏组织构建了1个cDNA文库，命名为LibA。②探针的合成、纯化和比放射活性测定。③差减杂交和特异性探针的富集。④菌落原位杂交。⑤差减阳性克隆的斑点杂交。结果：①所构建的人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库的容量LibF为1×109 ,LibS为3.7×108,LibA为2×108, 重组子的片段大小为0.9～4.6 kb。②经差减杂交和原位杂交，获得有差异克隆48个。结论: 构建高质量的人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库为筛选心脏发育相关基因奠定可靠的基础，并初步说明随着发育过程的推移，整体基因的表达有逐步减少的趋势。
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Preliminary screening of human cardiac development associated genes
LIU Lan-Ying1, GU Jun1, MA Jian-Quan1,TANG Jian2
1. The Research Center of Molecular Base Medicine,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510089)；
2.Cardiovascular Institute,Beijing University of Medical Sciences
Abstract AIM: Cardiac development associated genes were screened with subtractive hybridization between two human fetal heart (HFH)cDNA libraries and a human adult heart(HAH)cDNA library. METHODS:(1) Construct HFH cDNA libraries LibF、LibS and HAH cDNA library LibA ,using total RNA as start material which was extracted from 23 and 27 weeks fetal heart and adult heart ,respectively. (2) Synthesizing cDNA probe using total RNA extracted from fetal heart,purifying by sephadex G-50 columns ,and determining the yield of cDNA . (3) Subtractive hybridization. (4) In situ hybridization of colonies.(5)Differential DNA dot hybridization of subtractive cDNA clones. RESULTS: The capacity of LibF,LibS and LibA were 1×109,3.7×108 and 2×108,respectively,the inserts were approximately 0.9～4.6 kb. (2) 48 positive clones were harvested by subtractive hybridization and in situ hybridization.CONCLUSIONS: Construction of high quality cDNA libraries ensure successfully for screening and identifying cardiac development associated genes. Along development process ,the quantity of gene expression tends to declining.
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MeSH mRNA, messenger; Deoxyribonucleosides;Hybridization; Heart
心脏是脊椎动物发育过程中首先形成的器官之一，心脏的发育经过原始心管的形成和复杂的形态变化，最后形成4腔结构的心脏[1]。对心脏发育相关基因的研究在80年代以前几乎处于空白状态，90年代初，藉助于果蝇P转位子的发现，利用改造的P转位子进行果蝇心脏发育相关基因的研究，从此揭开了心脏发育相关基因的帷幕[2]。目前，果蝇心脏发育相关基因的研究，取得了突破性的进展。与果蝇相比，研究脊椎动物心脏发育相关基因的工作尚处于起始阶段，其主要原因首先是脊椎动物心脏发生早期模型难以建立，其次是脊椎动物心脏发育相关基因的研究远比果蝇复杂和困难。近年来，不少研究者们用鼠、非洲爪蟾、狗、鸡等胚胎作动物模型，探讨脊椎动物心脏发育相关基因。Tanaka 等用鼠胚作模型，筛选出脊椎动物心脏发育相关基因Csx/Nkx2.5。Csx/Nkx2.5是一个进化过程中非常保守的同源盒基因，与果蝇的tinman基因相类似，在早期心脏发育过程中起重要作用，敲除Csx/Nkx2.5基因，鼠胚胎在10.5d由于心脏缺失而死亡[3]。人的心脏发育相关基因的研究，目前也陆续可见报道。Klewer 等[4]用人胚作模型，筛选出α1、α2-Ⅵ型胶原蛋白基因，此基因位于21号染色体，在房室心内膜垫发育成瓣膜小叶和膜间隙的形态发生中起重要作用。该基因突变或缺失，可引起心脏房室瓣膜异常发育，21号三倍体的婴儿就是如此。本研究用人胎儿和成人心脏cDNA文库，通过差减杂交，筛选心脏发育相关基因，为了解先天性心脏病的发生机制以及遗传筛查、咨询与干预性治疗提供基础。
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材料与方法
一、 RNA提取：
分别取23周、27周胎儿及成人心脏组织0.5 g+5 mL
具体过程参照TRIZOL Reagent(Gibco BRL)说明书。
二、 mRNA的分离和cDNA文库的构建：
主要流程图：mRNA的分离→第一链的合成→第二链的合成→cDNA与连接子连接→ cDNA分级分离→cDNA克隆和效率计算→cDNA文库的扩增和鉴定。
(一)mRNA的分离和纯化:采用Oligo(dT) Cellulose Column(Gibco BRL)，操作步骤参照说明书。
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(二)人胎儿心脏和成人心脏cDNA文库的构建：采用SUPERSCRIPTTM cDNA 合成和克隆试剂盒(Gibco BRL)。
1. cDNA第一链的合成: Poly(A)mRNA 5 μg, Not1 primer-adapter 2 μL(0.5 μg/μL), SUPERSCRIPTll RT5 μL (200 U/μL), 1 μL[α-32P]dCTP(3.7×104 Bq/μL)等反应体积20 μL ,37℃水浴1 h.
2. cDNA第二链的合成: 在第一链的反应液中加入E.coli DNA 连接酶(10U/μL) 1 μL, E.coli DNA 聚合酶1 (10 U/μL) 4 μL, E.coli RNase H2U/μL) 1 μL等反应体积150 μL, 16℃水浴2 h，完毕后再加T4DNA 聚合酶(5 U/μL) 2 μL，16 ℃ 5 min,接着用酚/氯/异戊醇抽提，真空干燥，酒精沉淀，DEPC处理的水溶解。
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3. Sal1 adapter的连接：sal1 adapters(1 μg/μL) 10 μL，T4DNA 连接酶5 μL等反应总体积50 μL, 16℃水浴16 h，酚/氯/异戊醇抽提，酒精沉淀，真空干燥，DEPC处理的水溶解。
4. 用分级分离柱分离cDNA，操作步骤参照cDNA size fractionation columns(Gibco BRL)说明书, 选择反应效率高的8至12号管,总体积小于550 μL,去除小于500 bp的片段。
5. 载体与cDNA的连接: pSPORT1(50 ng/μL) 1 μL, cDNA 10 ng, T4DNA连接酶(1U/μL) 1 μL, 总体积20 μL,置室温3 h。
6. cDNA分子的克隆和库容量计算:取上述连接好的cDNA 5 μL，放入100 μL max efficiency DH5α感受态细胞中(Gibco BRL)，37℃ 150 r/min振摇1 h，然后从中取出10 μL，按1∶50倍稀释铺LB平板(含有100 μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜，计算转化子的克隆数。
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7. cDNA文库的扩增和鉴定：将上述文库所有菌落分别合并，每个取10 μL 于30 mL 含有氨苄的LB液体中，37℃ 220 r/min振摇12 h，然后用甘油保种，储藏于-80℃。取5 μL划含有氨苄的LB平板，每个cDNA文库分别挑出10个单菌落进行扩增，碱裂解法提取重组子DNA，用EcoR1和BamH1酶切，1%琼脂糖凝胶鉴定其片段大小。
三、cDNA文库的削减杂交(subtractive hybridization)：
主要流程图：
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cDNA文库的削减杂交主要流程图
(一)探针的合成、纯化和比放射活性测定：从23周和27周胎心中提取总RNA，采用SUPERSCRIPT 第一链合成试剂盒(Gibco BRL)合成cDNA探针，[α-32P]-dCTP标记，Sephadex G-50层析柱(Gibco BRL)纯化，操作步骤参照Kit说明书,用三氯乙酸(TCA)沉淀法测其探针的比放射。
(二)特异性探针的富集： 将成人cDNA文库中所有集落合并，大量扩增，用Qiagen 质粒纯化试剂盒(Qiagen)提取质粒，该质粒经NaOH变性后转移到Bio dyNEB尼龙膜上，室温下自然干燥30 min,再置80℃烘箱干烤2h。将结合了单链重组质粒DNA的尼龙膜与cDNA探针以10：1的比例进行杂交，操作过程综合Swaroop等,Rodriguez等,Rubenstein等的方法[5～7]。杂交后富集的特异性探针，用于下列的集落原位杂交。
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(三)菌落原位杂交：1. 将LibF和LibS分别接种于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h,将菌落分别影印到尼龙膜上，再置入另一含有氨苄青霉素的LB平板上，然后将主平板和影印膜平板继续培养到2 mm左右的菌落出现。主平板用parafilm膜封严，影印膜进行溶菌。
2. 溶菌：将尼龙膜放在含有下列溶液的滤纸上进行溶菌，10%SDS(3 min)→0.5 mol/L NaOH(7 min)→1 mol/L Tris-cl pH 7.4(2 min)→0.5 mol/L Tris-cl pH 7.4, 1 mol/L NaCl(4 min)→2×SSC(4 min), 自然干燥30 min,再置80℃烘箱干烤2 h。
3.尼龙膜的杂交与预杂交：预杂交液含有甲酰胺(Sigma)，水溶性聚蔗糖(Gibco BRL)，聚乙烯吡咯酮(Sigma)，预杂交于42℃杂交3 h，杂交时加入上述富集的特异性探针于42℃杂交16 h。
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4. 杂交后的尼龙膜的洗涤和放射自显影: 参照彭秀玲等[8]和Sambrook等[9]的方法。
5. 将杂交获得的可疑菌落进行点种，再经上述印膜→溶菌→干烤→预杂交→杂交→洗膜→自显影等进行第二轮杂交。
(四)差减阳性克隆的斑点杂交：
将差减出来的阳性克隆再扩增，用QIAprep Miniprep 质粒纯化试剂盒 (Qiagen)分别提取重组质粒DNA，然后用EcoR1和BamH1酶切，将酶切片段回收和纯化，在DNA聚合酶 1 Klenow大片段作用下，用[α-32P]dATP(3.7×104Bq/μL)标记酶切片段DNA的3’端，用作杂交探针。将此探针与胎儿心脏组织中提取的RNA进行斑点杂交，操作步骤参照卢圣栋[10]的方法。
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结果
(一)RNA的提取和mRNA的分离：所提取的RNA经紫外分光光度计测定OD260/OD280=1.87(图1A), mRNA的浓度为2.96 μg/μL。
Fig 1A Analysis of total RNA(1.0%agrose gel denatured by formaldehyde electrophoresis)
Lane 1：5 μg RNA from 23 weeks fetal heart; Lane 2：4 μg RNA from adult heart; Lane 3：6 μg RNA from 27 weeks fetal heart
图1A 总RNA经1.0%变性琼脂糖凝胶电泳分析
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(二)cDNA文库的容量和鉴定：用23周、27周及成人心脏组织中提取的RNA分别构建了3个cDNA文库LibF、LibS、LibA。取转化后的产物10 μL，按1：50倍稀释铺LB平板，用菌落数来计算cDNA文库的容量，LibF为1×109,LibS为3.7×108,LibA为2×108。分别合并各库所有阳性转化子，扩增，提取其质粒，用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析其插入片段的大小范围(图1B)。从不同的文库中各随机挑选单菌落10个，扩增→提取重组质粒DNA→酶切，凝胶电泳分析显示：重组子的片段大小为0.9～4.6 kb(图2 A)。
Fig 1B Recombinants of cDNA libraries—LibF，LibS and LibA(0.8%agrose gel electrophoresis analysis)
Lanes 1,2：LibF recombinants(8 μg); Lanes 4,5：LibS recombinants(8 μg); Lane 7：LibA recombinants(8 μg); Lane 9：λDNA/EcoR1+BamH1.
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图 1B cDNA文库LibF，LibS和LibA重组质粒DNA(0.8%琼脂糖凝胶电泳分析)
Fig 2A Identification of recombinant plasmids by restriction analysis(1.0% agrose gel electrophoresis analysis)
Lanes 1,2,3：5 μg each of recombinant plasmids digested with EcoR1 and BamH1 in LibF; Lanes 4,5：5 μg each of recombinant plasmids digested with EcoR1 and BamH1 in LibS; Lane 6：5 μg recombinant plasmid pcDNA3 digested with EcoR1 and BamH1 (3.8kb); Lanes 7,8：5 μg each of recombinant plasmids digested with EcoR1 and BamH1 in LibA ;M—λDNA/EcoR1+BamH1.
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图2A 重组质粒经限制性酶切鉴定(1.0%琼脂糖凝胶电泳分析)
(三)通过差减杂交富集特异性的cDNA探针: 从23周和27周胎儿心脏组织中提取总RNA，经逆转录合成单链[32P]标记的cDNA探针，比放射性为1.6×108 counts.min-1/μg DNA,总量约1600 ng。合成效率为33%，LibA重组质粒DNA-尼龙膜与探针以10∶1的比例进行杂交，去除探针中与LibA-DNA共有的序列。经两轮杂交后，90%以上的探针已被除去，剩余未杂交上的放射性代表特异性的cDNA探针。
(四)菌落原位杂交: 用富集特异性的cDNA探针与LibF-集落DNA-尼龙膜或 LibS-集落DNA-尼龙膜进行杂交，筛选出胎儿发育期间所特有而成人阶段不表达的基因。我们对12 000个菌落进行筛选，获得48个阳性克隆(图3)，用部分克隆进行了限制性酶切分析，显示cDNA片段大小为1.2～3.2 kb(图2B)。测序工作正在进行。
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Fig 2B Restriction analysis of subtractive cDNA clones(1.0% agrose gel electrophoresis analysis)
M:λDNA/EcoR1+BamH1; Lane 1,2,3:Each positive clone digested with EcoR1 and BamH1; Lane 4:A positive clone digested with EcoR1
图2B 差减阳性克隆酶切分析(1.0%琼脂糖凝胶电泳)
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Fig 3 Analysis of in situ hybridization of the enriched positive colonies
All of the first screening positive colonies were dotted on a 120 mm-dish. Then colonies were transferred to duplicate sets of nylon membrane and hybridized with the enrichment of [32 P]-labeled specific cDNA probes (1.6×108 counts.min-1/μg) prepared as described above.The arrows indicate the secondary screening positive colonies
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图3 富集阳性克隆的菌落原位杂交分析
(五)差减阳性克隆的斑点杂交: 为了解与心脏发育相关基因的表达情况，我们将该特异性阳性克隆的酶切片段进行回收和纯化，用[32P]标记成特异性DNA探针，与上述3个不同心脏组织提取的RNA进行杂交，结果显示：探针只与23周和27周心脏的RNA出现杂交信号，与成人心脏的RNA不出现杂交信号(图4)，确认了这些克隆是有意义的。
Fig 4 Differential DNA-dot hybridization of subtractive cDNA clones
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10 μg each of total tissue RNAs prepared from fetal heart and adult heart, which were denatured by formaldehyde,applied to nylon membrane using a dot apparatus(Biorad). Dot 1: human adult heart RNA; dot 2: human fetal heart RNA;[32 P]-labeled human β-actin gene probe(positive control); W2, W13, W19:[32?P]-labeled DNA probe(2×106 counts.min-1/mL)prepared from the fragment of subtractive cDNA clone digested with EcoR1 and BamH1,respectively
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图4 差减阳性克隆的斑点杂交
讨论
本文以人胎儿心脏和成人心脏的mRNA为模板,构建了3个cDNA文库，代表组织和细胞的特异性，便于差异基因的筛选，可直接反映出胎儿和成人基因表达的情况。本库的库容量为2×108～1×109，足以包含低丰度表达的mRNA 。大量的研究表明，RNA的结构及其稳定性与蛋白质翻译的调控是密切相关的。因此在筛选心脏发育相关基因的研究中，构建cDNA文库要比基因组文库可能获得更大的信息量。
我们构建的cDNA文库是以pSPORT1为构建载体(4109bp)，该质粒含有M13/pUC上下游引物和SP6 、T7 Promoter引物，既利于测序，又利于扩增和做其它检测。用胎儿心脏cDNA文库与成人心脏cDNA文库进行差减杂交或两个不同月份的胎儿文库之间进行差减杂交，可获得心脏发育相关基因，且能进一步了解胎儿发育过程中，基因表达的水平和状况。斑点杂交的结果表明：该特异性基因在胎儿发育期间表达旺盛，而到了成人阶段就不表达了。此外，我们在实验中还发现，用相同重量的心肌组织(0.2 g)，在完全同等的条件下提取的RNA量，胎心(29 μg)比成人心(13.8 μg)高1倍以上(通过OD值计算，重复多次)，且胎儿的月份越小，所提取的RNA量越多。这初步说明随着胎儿不断的发育，基因的表达可能逐渐减少，到了成人阶段很可能有1半以上的基因不表达。在人的心脏发育过程中，究竟哪些基因需要表达？哪些基因不需要表达？基因的上调、下调及转录因子是如何起作用的？这些将是我们了解和医治先天性心脏病所必须解决的问题。我们构建的胎儿心cDNA文库和成人心cDNA文库，为获得不同发育阶段、特异表达的基因和完整编码蛋白质的目的基因提供了条件。
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* 国家攀登计划和博士点资助基金
参考文献
1 Durocher D,Nemer M.Combinatorial interactions regulating cardiac transcription.Dev Genet,1998,22(3)250.
2 Bodmer R,Jan LY,Jan YN, et al. A new homebox containing gene,msh2,is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila.Development,1990,110(3):661.
3 Tanaka M,Kasahara H,Bartunkova S, et al.Vertebrate homologs of tinman and bagpipe:roles of the homeobox genes in cardiovascular development.Dev Genet,1998,22(3):239.
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4 Klewer SE,Krob SL,Kolker SJ, et al.Expression of type Ⅵ collagen in the developing mouse heart.Dev Dyn,1998,211(3):248.
5 Swaroop A,Xu JZ,Agarwal N, et al. A simple and efficient cDNA library subtraction procedure: isolation of human retina-specific cDNA clones.Nucl Acids Res,1991,19(8):1954..
6 Rodriguez IR,Chader GJ. A novel method for the isolation of tissue-specific genes.Nucl Acids Res,1992,20(13):3528.
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7 Rubenstein JLR, Brice AEJ,Ciaranello RD, et al.Subtractive hybridization system using single- stranded phagemids with directional inserts.Nucl Acids Res,1990,18(16):4833.
8 彭秀玲，袁汉英.菌落原位杂交.彭秀玲，袁汉英，谢 毅，等主编. 基因工程实验技术.第2版.湖南：湖南科学出版社，1997.149～156.
9 Sambrook J,Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 372.
10 胡晓年，李德春，方福德.核酸分子杂交.卢圣栋,主编. 现代分子生物学实验技术. 第1版.北京：高等教育出版社，1993.198～210.
(1999年3月19日收稿，1999年6月10日修回), 百拇医药
单位：中山医科大学分子医学研究中心(广州 510089)Δ北京医科大学基础心血管研究所
关键词：RNA；信使；脱氧核糖核苷类；杂交；心脏
中国病理生理杂志990905 摘 要 目的：从人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库，通过差减杂交，筛选心脏发育相关基因。方法：①用23周和27周的人胚胎心脏组织构建2个cDNA文库，分别命名为LibF和LibS，用成人心脏组织构建了1个cDNA文库，命名为LibA。②探针的合成、纯化和比放射活性测定。③差减杂交和特异性探针的富集。④菌落原位杂交。⑤差减阳性克隆的斑点杂交。结果：①所构建的人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库的容量LibF为1×109 ,LibS为3.7×108,LibA为2×108, 重组子的片段大小为0.9～4.6 kb。②经差减杂交和原位杂交，获得有差异克隆48个。结论: 构建高质量的人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库为筛选心脏发育相关基因奠定可靠的基础，并初步说明随着发育过程的推移，整体基因的表达有逐步减少的趋势。
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Preliminary screening of human cardiac development associated genes
LIU Lan-Ying1, GU Jun1, MA Jian-Quan1,TANG Jian2
1. The Research Center of Molecular Base Medicine,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510089)；
2.Cardiovascular Institute,Beijing University of Medical Sciences
Abstract AIM: Cardiac development associated genes were screened with subtractive hybridization between two human fetal heart (HFH)cDNA libraries and a human adult heart(HAH)cDNA library. METHODS:(1) Construct HFH cDNA libraries LibF、LibS and HAH cDNA library LibA ,using total RNA as start material which was extracted from 23 and 27 weeks fetal heart and adult heart ,respectively. (2) Synthesizing cDNA probe using total RNA extracted from fetal heart,purifying by sephadex G-50 columns ,and determining the yield of cDNA . (3) Subtractive hybridization. (4) In situ hybridization of colonies.(5)Differential DNA dot hybridization of subtractive cDNA clones. RESULTS: The capacity of LibF,LibS and LibA were 1×109,3.7×108 and 2×108,respectively,the inserts were approximately 0.9～4.6 kb. (2) 48 positive clones were harvested by subtractive hybridization and in situ hybridization.CONCLUSIONS: Construction of high quality cDNA libraries ensure successfully for screening and identifying cardiac development associated genes. Along development process ,the quantity of gene expression tends to declining.
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MeSH mRNA, messenger; Deoxyribonucleosides;Hybridization; Heart
心脏是脊椎动物发育过程中首先形成的器官之一，心脏的发育经过原始心管的形成和复杂的形态变化，最后形成4腔结构的心脏[1]。对心脏发育相关基因的研究在80年代以前几乎处于空白状态，90年代初，藉助于果蝇P转位子的发现，利用改造的P转位子进行果蝇心脏发育相关基因的研究，从此揭开了心脏发育相关基因的帷幕[2]。目前，果蝇心脏发育相关基因的研究，取得了突破性的进展。与果蝇相比，研究脊椎动物心脏发育相关基因的工作尚处于起始阶段，其主要原因首先是脊椎动物心脏发生早期模型难以建立，其次是脊椎动物心脏发育相关基因的研究远比果蝇复杂和困难。近年来，不少研究者们用鼠、非洲爪蟾、狗、鸡等胚胎作动物模型，探讨脊椎动物心脏发育相关基因。Tanaka 等用鼠胚作模型，筛选出脊椎动物心脏发育相关基因Csx/Nkx2.5。Csx/Nkx2.5是一个进化过程中非常保守的同源盒基因，与果蝇的tinman基因相类似，在早期心脏发育过程中起重要作用，敲除Csx/Nkx2.5基因，鼠胚胎在10.5d由于心脏缺失而死亡[3]。人的心脏发育相关基因的研究，目前也陆续可见报道。Klewer 等[4]用人胚作模型，筛选出α1、α2-Ⅵ型胶原蛋白基因，此基因位于21号染色体，在房室心内膜垫发育成瓣膜小叶和膜间隙的形态发生中起重要作用。该基因突变或缺失，可引起心脏房室瓣膜异常发育，21号三倍体的婴儿就是如此。本研究用人胎儿和成人心脏cDNA文库，通过差减杂交，筛选心脏发育相关基因，为了解先天性心脏病的发生机制以及遗传筛查、咨询与干预性治疗提供基础。
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材料与方法
一、 RNA提取：
分别取23周、27周胎儿及成人心脏组织0.5 g+5 mL
具体过程参照TRIZOL Reagent(Gibco BRL)说明书。二、 mRNA的分离和cDNA文库的构建：
主要流程图：mRNA的分离→第一链的合成→第二链的合成→cDNA与连接子连接→ cDNA分级分离→cDNA克隆和效率计算→cDNA文库的扩增和鉴定。
(一)mRNA的分离和纯化:采用Oligo(dT) Cellulose Column(Gibco BRL)，操作步骤参照说明书。
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(二)人胎儿心脏和成人心脏cDNA文库的构建：采用SUPERSCRIPTTM cDNA 合成和克隆试剂盒(Gibco BRL)。
1. cDNA第一链的合成: Poly(A)mRNA 5 μg, Not1 primer-adapter 2 μL(0.5 μg/μL), SUPERSCRIPTll RT5 μL (200 U/μL), 1 μL[α-32P]dCTP(3.7×104 Bq/μL)等反应体积20 μL ,37℃水浴1 h.
2. cDNA第二链的合成: 在第一链的反应液中加入E.coli DNA 连接酶(10U/μL) 1 μL, E.coli DNA 聚合酶1 (10 U/μL) 4 μL, E.coli RNase H2U/μL) 1 μL等反应体积150 μL, 16℃水浴2 h，完毕后再加T4DNA 聚合酶(5 U/μL) 2 μL，16 ℃ 5 min,接着用酚/氯/异戊醇抽提，真空干燥，酒精沉淀，DEPC处理的水溶解。
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3. Sal1 adapter的连接：sal1 adapters(1 μg/μL) 10 μL，T4DNA 连接酶5 μL等反应总体积50 μL, 16℃水浴16 h，酚/氯/异戊醇抽提，酒精沉淀，真空干燥，DEPC处理的水溶解。
4. 用分级分离柱分离cDNA，操作步骤参照cDNA size fractionation columns(Gibco BRL)说明书, 选择反应效率高的8至12号管,总体积小于550 μL,去除小于500 bp的片段。
5. 载体与cDNA的连接: pSPORT1(50 ng/μL) 1 μL, cDNA 10 ng, T4DNA连接酶(1U/μL) 1 μL, 总体积20 μL,置室温3 h。
6. cDNA分子的克隆和库容量计算:取上述连接好的cDNA 5 μL，放入100 μL max efficiency DH5α感受态细胞中(Gibco BRL)，37℃ 150 r/min振摇1 h，然后从中取出10 μL，按1∶50倍稀释铺LB平板(含有100 μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜，计算转化子的克隆数。
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7. cDNA文库的扩增和鉴定：将上述文库所有菌落分别合并，每个取10 μL 于30 mL 含有氨苄的LB液体中，37℃ 220 r/min振摇12 h，然后用甘油保种，储藏于-80℃。取5 μL划含有氨苄的LB平板，每个cDNA文库分别挑出10个单菌落进行扩增，碱裂解法提取重组子DNA，用EcoR1和BamH1酶切，1%琼脂糖凝胶鉴定其片段大小。
三、cDNA文库的削减杂交(subtractive hybridization)：
主要流程图：
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cDNA文库的削减杂交主要流程图
(一)探针的合成、纯化和比放射活性测定：从23周和27周胎心中提取总RNA，采用SUPERSCRIPT 第一链合成试剂盒(Gibco BRL)合成cDNA探针，[α-32P]-dCTP标记，Sephadex G-50层析柱(Gibco BRL)纯化，操作步骤参照Kit说明书,用三氯乙酸(TCA)沉淀法测其探针的比放射。
(二)特异性探针的富集： 将成人cDNA文库中所有集落合并，大量扩增，用Qiagen 质粒纯化试剂盒(Qiagen)提取质粒，该质粒经NaOH变性后转移到Bio dyNEB尼龙膜上，室温下自然干燥30 min,再置80℃烘箱干烤2h。将结合了单链重组质粒DNA的尼龙膜与cDNA探针以10：1的比例进行杂交，操作过程综合Swaroop等,Rodriguez等,Rubenstein等的方法[5～7]。杂交后富集的特异性探针，用于下列的集落原位杂交。
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(三)菌落原位杂交：1. 将LibF和LibS分别接种于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h,将菌落分别影印到尼龙膜上，再置入另一含有氨苄青霉素的LB平板上，然后将主平板和影印膜平板继续培养到2 mm左右的菌落出现。主平板用parafilm膜封严，影印膜进行溶菌。
2. 溶菌：将尼龙膜放在含有下列溶液的滤纸上进行溶菌，10%SDS(3 min)→0.5 mol/L NaOH(7 min)→1 mol/L Tris-cl pH 7.4(2 min)→0.5 mol/L Tris-cl pH 7.4, 1 mol/L NaCl(4 min)→2×SSC(4 min), 自然干燥30 min,再置80℃烘箱干烤2 h。
3.尼龙膜的杂交与预杂交：预杂交液含有甲酰胺(Sigma)，水溶性聚蔗糖(Gibco BRL)，聚乙烯吡咯酮(Sigma)，预杂交于42℃杂交3 h，杂交时加入上述富集的特异性探针于42℃杂交16 h。
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4. 杂交后的尼龙膜的洗涤和放射自显影: 参照彭秀玲等[8]和Sambrook等[9]的方法。
5. 将杂交获得的可疑菌落进行点种，再经上述印膜→溶菌→干烤→预杂交→杂交→洗膜→自显影等进行第二轮杂交。
(四)差减阳性克隆的斑点杂交：
将差减出来的阳性克隆再扩增，用QIAprep Miniprep 质粒纯化试剂盒 (Qiagen)分别提取重组质粒DNA，然后用EcoR1和BamH1酶切，将酶切片段回收和纯化，在DNA聚合酶 1 Klenow大片段作用下，用[α-32P]dATP(3.7×104Bq/μL)标记酶切片段DNA的3’端，用作杂交探针。将此探针与胎儿心脏组织中提取的RNA进行斑点杂交，操作步骤参照卢圣栋[10]的方法。
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结果
(一)RNA的提取和mRNA的分离：所提取的RNA经紫外分光光度计测定OD260/OD280=1.87(图1A), mRNA的浓度为2.96 μg/μL。
Fig 1A Analysis of total RNA(1.0%agrose gel denatured by formaldehyde electrophoresis)
Lane 1：5 μg RNA from 23 weeks fetal heart; Lane 2：4 μg RNA from adult heart; Lane 3：6 μg RNA from 27 weeks fetal heart
图1A 总RNA经1.0%变性琼脂糖凝胶电泳分析
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(二)cDNA文库的容量和鉴定：用23周、27周及成人心脏组织中提取的RNA分别构建了3个cDNA文库LibF、LibS、LibA。取转化后的产物10 μL，按1：50倍稀释铺LB平板，用菌落数来计算cDNA文库的容量，LibF为1×109,LibS为3.7×108,LibA为2×108。分别合并各库所有阳性转化子，扩增，提取其质粒，用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析其插入片段的大小范围(图1B)。从不同的文库中各随机挑选单菌落10个，扩增→提取重组质粒DNA→酶切，凝胶电泳分析显示：重组子的片段大小为0.9～4.6 kb(图2 A)。
Fig 1B Recombinants of cDNA libraries—LibF，LibS and LibA(0.8%agrose gel electrophoresis analysis)
Lanes 1,2：LibF recombinants(8 μg); Lanes 4,5：LibS recombinants(8 μg); Lane 7：LibA recombinants(8 μg); Lane 9：λDNA/EcoR1+BamH1.
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图 1B cDNA文库LibF，LibS和LibA重组质粒DNA(0.8%琼脂糖凝胶电泳分析)
Fig 2A Identification of recombinant plasmids by restriction analysis(1.0% agrose gel electrophoresis analysis)
Lanes 1,2,3：5 μg each of recombinant plasmids digested with EcoR1 and BamH1 in LibF; Lanes 4,5：5 μg each of recombinant plasmids digested with EcoR1 and BamH1 in LibS; Lane 6：5 μg recombinant plasmid pcDNA3 digested with EcoR1 and BamH1 (3.8kb); Lanes 7,8：5 μg each of recombinant plasmids digested with EcoR1 and BamH1 in LibA ;M—λDNA/EcoR1+BamH1.
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图2A 重组质粒经限制性酶切鉴定(1.0%琼脂糖凝胶电泳分析)
(三)通过差减杂交富集特异性的cDNA探针: 从23周和27周胎儿心脏组织中提取总RNA，经逆转录合成单链[32P]标记的cDNA探针，比放射性为1.6×108 counts.min-1/μg DNA,总量约1600 ng。合成效率为33%，LibA重组质粒DNA-尼龙膜与探针以10∶1的比例进行杂交，去除探针中与LibA-DNA共有的序列。经两轮杂交后，90%以上的探针已被除去，剩余未杂交上的放射性代表特异性的cDNA探针。
(四)菌落原位杂交: 用富集特异性的cDNA探针与LibF-集落DNA-尼龙膜或 LibS-集落DNA-尼龙膜进行杂交，筛选出胎儿发育期间所特有而成人阶段不表达的基因。我们对12 000个菌落进行筛选，获得48个阳性克隆(图3)，用部分克隆进行了限制性酶切分析，显示cDNA片段大小为1.2～3.2 kb(图2B)。测序工作正在进行。
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Fig 2B Restriction analysis of subtractive cDNA clones(1.0% agrose gel electrophoresis analysis)
M:λDNA/EcoR1+BamH1; Lane 1,2,3:Each positive clone digested with EcoR1 and BamH1; Lane 4:A positive clone digested with EcoR1
图2B 差减阳性克隆酶切分析(1.0%琼脂糖凝胶电泳)
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Fig 3 Analysis of in situ hybridization of the enriched positive colonies
All of the first screening positive colonies were dotted on a 120 mm-dish. Then colonies were transferred to duplicate sets of nylon membrane and hybridized with the enrichment of [32 P]-labeled specific cDNA probes (1.6×108 counts.min-1/μg) prepared as described above.The arrows indicate the secondary screening positive colonies
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图3 富集阳性克隆的菌落原位杂交分析
(五)差减阳性克隆的斑点杂交: 为了解与心脏发育相关基因的表达情况，我们将该特异性阳性克隆的酶切片段进行回收和纯化，用[32P]标记成特异性DNA探针，与上述3个不同心脏组织提取的RNA进行杂交，结果显示：探针只与23周和27周心脏的RNA出现杂交信号，与成人心脏的RNA不出现杂交信号(图4)，确认了这些克隆是有意义的。
Fig 4 Differential DNA-dot hybridization of subtractive cDNA clones
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10 μg each of total tissue RNAs prepared from fetal heart and adult heart, which were denatured by formaldehyde,applied to nylon membrane using a dot apparatus(Biorad). Dot 1: human adult heart RNA; dot 2: human fetal heart RNA;[32 P]-labeled human β-actin gene probe(positive control); W2, W13, W19:[32?P]-labeled DNA probe(2×106 counts.min-1/mL)prepared from the fragment of subtractive cDNA clone digested with EcoR1 and BamH1,respectively
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图4 差减阳性克隆的斑点杂交
讨论
本文以人胎儿心脏和成人心脏的mRNA为模板,构建了3个cDNA文库，代表组织和细胞的特异性，便于差异基因的筛选，可直接反映出胎儿和成人基因表达的情况。本库的库容量为2×108～1×109，足以包含低丰度表达的mRNA 。大量的研究表明，RNA的结构及其稳定性与蛋白质翻译的调控是密切相关的。因此在筛选心脏发育相关基因的研究中，构建cDNA文库要比基因组文库可能获得更大的信息量。
我们构建的cDNA文库是以pSPORT1为构建载体(4109bp)，该质粒含有M13/pUC上下游引物和SP6 、T7 Promoter引物，既利于测序，又利于扩增和做其它检测。用胎儿心脏cDNA文库与成人心脏cDNA文库进行差减杂交或两个不同月份的胎儿文库之间进行差减杂交，可获得心脏发育相关基因，且能进一步了解胎儿发育过程中，基因表达的水平和状况。斑点杂交的结果表明：该特异性基因在胎儿发育期间表达旺盛，而到了成人阶段就不表达了。此外，我们在实验中还发现，用相同重量的心肌组织(0.2 g)，在完全同等的条件下提取的RNA量，胎心(29 μg)比成人心(13.8 μg)高1倍以上(通过OD值计算，重复多次)，且胎儿的月份越小，所提取的RNA量越多。这初步说明随着胎儿不断的发育，基因的表达可能逐渐减少，到了成人阶段很可能有1半以上的基因不表达。在人的心脏发育过程中，究竟哪些基因需要表达？哪些基因不需要表达？基因的上调、下调及转录因子是如何起作用的？这些将是我们了解和医治先天性心脏病所必须解决的问题。我们构建的胎儿心cDNA文库和成人心cDNA文库，为获得不同发育阶段、特异表达的基因和完整编码蛋白质的目的基因提供了条件。
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* 国家攀登计划和博士点资助基金
参考文献
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2 Bodmer R,Jan LY,Jan YN, et al. A new homebox containing gene,msh2,is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila.Development,1990,110(3):661.
3 Tanaka M,Kasahara H,Bartunkova S, et al.Vertebrate homologs of tinman and bagpipe:roles of the homeobox genes in cardiovascular development.Dev Genet,1998,22(3):239.
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4 Klewer SE,Krob SL,Kolker SJ, et al.Expression of type Ⅵ collagen in the developing mouse heart.Dev Dyn,1998,211(3):248.
5 Swaroop A,Xu JZ,Agarwal N, et al. A simple and efficient cDNA library subtraction procedure: isolation of human retina-specific cDNA clones.Nucl Acids Res,1991,19(8):1954..
6 Rodriguez IR,Chader GJ. A novel method for the isolation of tissue-specific genes.Nucl Acids Res,1992,20(13):3528.
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7 Rubenstein JLR, Brice AEJ,Ciaranello RD, et al.Subtractive hybridization system using single- stranded phagemids with directional inserts.Nucl Acids Res,1990,18(16):4833.
8 彭秀玲，袁汉英.菌落原位杂交.彭秀玲，袁汉英，谢 毅，等主编. 基因工程实验技术.第2版.湖南：湖南科学出版社，1997.149～156.
9 Sambrook J,Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 372.
10 胡晓年，李德春，方福德.核酸分子杂交.卢圣栋,主编. 现代分子生物学实验技术. 第1版.北京：高等教育出版社，1993.198～210.
(1999年3月19日收稿，1999年6月10日修回), 百拇医药