骨关节炎的基因治疗现状和应用前景
作者：余家阔 于长隆 曲绵域
单位：余家阔 于长隆 曲绵域 (北京医科大学运动医学研究所(100083))
关键词：
骨关节炎的基因治疗现状和应用前景1 前言
显微手术，器官、组织的移植或置换手术，关节镜、组织镜等微创手术的发展，给运动创伤和运动骨科的发展带来了勃勃生机。自从基因治疗技术从当初的只用于治疗典型的遗传性基因缺陷病[1]，转向目前广泛用于治疗多种获得性疾病(如肿瘤、关节炎和骨与软组织损伤)以来[2～6]，对创伤领域获得性疾病的基因治疗，正成为全世界关注的热点，1996和1997年的有关文献猛增。
目前，对类风湿性关节炎(RA)的基因治疗，已于1996年进入临床I期应用阶段[3]。骨关节炎(OA)是比RA更常见的关节疾患。在最常见的三大老年病中，OA的患病率和患病人数在世界范围内均居于首位[7]。60—70岁的老年人的OA患病率约为60%，70岁以上的老年人的OA患病率约为70[50]。有资料表明，所有专项训练的运动员，其骨关节炎的发病率均比同龄普通人群高[53]。我所对多种项目运动员伤病的统计资料表明，膝关节是全身各关节中发生运动创伤最多的关节，其中又以慢性劳损伤所致的膝关节骨关节炎最常见[54]。
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至今，治疗OA的最常用方法仍是药物治疗。在全身给药的过程中(口服、肌注和静脉滴注)，到达关节内的药量很有限，全身组织、器官均要暴露在药物的副作用之下，药物的半衰期往往较短，长期反复用药又使得病人不易坚持。关节内药物注射虽然可以解决药物进入关节内的问题，但是，因为药物半衰期和疗效持续时间的限制，关节内药物注射要反复多次进行，大大增加了关节感染的机会。直到目前，还没有一种药物对OA的治疗效果和治疗方便程度令人满意。对骨关节炎的手术治疗也不能很好解决关节软骨的修复问题，更不能解决关节软骨随病程进展还将被进一步破坏的结局。许多晚期病人不得不接受人工关节置换手术。所以，有些学者称骨关节炎是不可治愈的疾患[8，9]。用基因治疗的方法将编码某一有治疗作用的蛋白的基因用适当的载体转化到关节滑膜或关节软骨中去，使该基因可以在关节中长期、稳定、高效地表达，类似于在关节内放入了无数个小的制药厂，药物被不停地生产出来，并不停地作用于有病变的单一关节。因此推测，基因治疗方法用于治疗骨关节炎，将可能改变治疗骨关节炎的现状[10]。
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随着基因治疗方法被不断完善和人们对病毒载体安全性的进一步了解，越来越多的基因治疗方案被批准应用。到1996年，美洲、欧洲所申报的基因治疗方案已达232个，比1995年增加82个；接受各种基因治疗的病人数也从1062例增加到1537例[11]。因此，增加对此方面的了解是有一定必要的。
2 细胞因子、生长因子和骨关节炎的发生
近年来的研究表明，细胞因子和多肽生长因子不仅在关节软骨和滑膜的正常结构和功能的维持方面起着重要作用，而且，一些因子在关节炎的病理过程中对关节软骨和关节滑膜也具有一定的破坏作用[12，13，15]。其中，胰岛素样生长因子(IGF,insulin-like growth factor)在骨关节炎(OA,osteoarthritis)发生过程中对软骨细胞蛋白多糖的合成起着关键的调节作用[17]。转化生长因子-β(TGF-β,transforming growth factor-beta)在关节内的主要作用有：促进大分子量和小分子量蛋白多糖的合成，促进酶抑制蛋白的合成，增加白细胞介素-1受体拮抗蛋白(IL-1ra,interleukin-1 receptor antagonist)的表达。减少白细胞介素-1受体(IL-1R,interleukin-1receptor)表达，并有促进关节软骨边缘和关节囊止点处骨刺或骨唇形成的作用[15]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,basic fibroblast growth factor)可促进IL-1R和白细胞介素-1(IL-1)介导的蛋白酶表达[18，19]，还可能参与OA滑膜的增生过程[20]。
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在OA发生中最引人注目的是白细胞介素-1(IL-1,interleukin-1)和肿瘤坏死因子(TNF，tumor necrosis factor)这两种细胞因子[15，16]。IL-1和TNF是关节炎病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子[15，16，21]。IL-1可抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅸ型胶原的合成，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成，使软骨的结构蛋白发生质的改变，这在OA的发生中要比促进软骨基质的降解更有破坏性[22]。IL-1可通过刺激滑膜细胞产生胶原酶和酪蛋白酶[23]、刺激软骨细胞产生金属蛋白酶[24]，从而促进软骨基质的降解；可通过刺激滑膜细胞产生前列腺素E2(PEG2)[24]和分泌血管细胞粘附分子-1(VCAM-1,vascular cell adhesion molecule-1)[25]，参与炎症反应；可促进骨吸收及成骨细胞样细胞的增殖，与OA的骨刺或骨唇形成以及软骨下骨的囊性变有关[21，24，25]。已知骨形态发生蛋白(BMP,bone morphogenetic protein)可在肌肉组织中诱导异位骨化，但在植入BMP的肌肉处注射抗IL-1的单克隆抗体或多克隆抗体，就会使BMP诱导异位骨化失败[26]，也说明IL-1也可能与OA的骨刺或骨唇形成有关。Hung等人[27]将重组人白细胞介素-1β(rhIL-1 β,recombinant human interleukin-1)注入兔膝关节，发现滑膜内有大量白细胞浸润，滑膜细胞增生，滑膜肥厚，并有关节软骨蛋白多糖合成下降。
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TNF在关节炎(包括OA)的发生过程中对关节软骨起着重要的破坏作用[15，16]。Cameron等人[45]对因膝关节前交叉韧带断裂所致的急性、亚急性和慢性膝关节炎的关节液中的TNF-α、IL-1的含量进行了测定。急性关节炎中，关节液中的TNF-α的含量突然增加，而IL-1的含量增加却不明显。亚急性和慢性期时，TNF-α的含量虽有所下降但仍比IL-1高。有人证明，无论是用胶原诱导关节炎之前[46]，还是用胶原诱导关节炎之后[47]，向关节内注射TNF-α均可加重关节炎的病变。反之，用胶原诱导关节炎之前或之后[48，49]向关节内注射的TNF-α的单克隆抗体则可以明显减轻关节炎病变。
可见，消除IL-1和TNF的作用在OA的治疗和预防中是很关键的。
3 对骨关节炎进行基因治疗的现状
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鉴于IL-1在骨关节炎发病中的十分重要的作用，目前对骨关节炎进行基因治疗的最基本目的是用特定的基因转移载体为工具(如反转录病毒载体、腺病毒载体、脂质体载体等)，将白细胞介-1素受体拮抗蛋白(hIL-1ra)基因转移到关节内，使该基因在关节内大量表达，表达出的hIL-1ra与病理状态下产生的hIL-1相互作用，从而阻断hIL-1的破坏作用，达到对骨关节炎的预防、治疗或长期稳定地减轻骨关节炎患者的临床症状的目的。
1992年，Bandara等人用反转录病毒为载体，将β-半乳糖苷酶(LacZ)基因转化到体外培养兔滑膜细胞中，再将这些有LacZ基因表达的细胞注射到兔膝关节中，使LacZ基因在膝关节滑膜中的表达时间长达3个月，并提出了用此方法对关节炎进行基因治疗的设想[10]。
目前用于基因治疗的关节炎的动物模型有胶原诱导的关节炎(CIA,collagen induced arthritis,一种类风湿性关节炎的运动模型)[28]，细菌细胞壁蛋白诱导的大鼠踝关节关节炎[29]和重组人白细胞介素-1β(rhIL-1β)关节内注射导致的兔膝关节关节炎[29]几种，还有一些用正常关节[30]和培养细胞进行基因转化和基因表达研究的[30，31]。这些研究中所用的基因转移载体有反转录病毒载体(如MFG载体)[3，27，29，30]，腺病毒载体[31—35]和HVJ(日本Sandai病毒)——脂质体的复合载体[36]等。所用靶细胞有软骨细胞[28，33]、滑膜细胞[10，12，27，30，31]、中国仓鼠卵细胞(CHO)[28]、NIH3T3细胞[37]，淋巴细胞[38]和脾细胞[39]等。所用的靶组织有滑膜组织[28]和软骨组织[31]。所用治疗基因除了个别报导的血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的编码基因[32]、TGF-β基因[38]、TNF受体基因[39]、IL-4基因和IL-13基因等以外，其余均为人白细胞介素-1受体拮抗蛋白(hIL-1ra)基因[4，27，29，30，31，33，37]。所用的基因治疗方案主要有EX VIVO方法和IN VIVO方法两种。用EX VIVO方法时，先将含治疗基因的重组病毒载体转化到病毒包装细胞中生产重组病毒颗粒，再用重组病毒颗粒感染体外培养的细胞，使细胞中有治疗基因的表达，再将表达治疗基因的细胞注射到关节内[29，30]，从而达到对关节炎进行基因治疗的目的。用IN VIVO方法时，直接将插入治疗基因的重组病毒颗粒注射到关节内[28，36]，以达到治疗基因在关节内直接表达的目的。
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Hung等人[27]把hIL-1ra基因重组到反转录病毒上，将重组病毒转化到体外培养滑膜细胞中，再将有hIL-1ra表达的滑膜细胞注射到被rhIL-1 β诱导出关节炎的关节内，可使滑膜内白细胞浸润、滑膜细胞增生、滑膜肥厚和关节软骨蛋白多糖合成减少等病理变化得到抑制。而且，hIL-1ra在关节内的表达时间可达3个月。
Bakker[37]等人用MFG反转录病毒作载体将hIL-1ra基因转染到NIF3T3成纤维细胞中，体外hIL-1ra的表达量最高达5000ng/106 NIH3T3细胞/24小时。在关节炎未发生之前就将可表达hIL-1ra的NIH3T3细胞注射到膝关节中，结果发现，关节内表达的hIL-1ra完全阻止了胶原诱导的关节炎症和软骨破坏。
Markarov等人[40]将hIL-1ra基因重组到SRAM3反转录病毒载体上，再用重组病毒颗粒感染大鼠滑膜细胞，体外表达量为200ng hIL-1ra/106细胞/24小时。
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Boggs[41]等人用MFG反转录病毒载体重组上hIL-1ra基因，用经过包装细胞繁殖的重组病毒颗粒感染小鼠骨髓中的造血干细胞后，再注射到经射线照射的小鼠体内，小鼠血清中hIL-1ra的含量可达40-1200ng/ml血清，表达时间可长达15个月。
用腺病毒载体重组上hIL-1ra后，使其在体外培养的软骨细胞中表达，表达量可达1000ng/ml细胞上清液。观察时间为10天[42]。将有hIL-1ra表达的软骨细胞移植到体外培养关节软骨块的表面继续培养，可防止IL-1介导的培养软骨块中软骨基质的降解[42]。
在各种关节炎基因治疗的研究中，RA的基因治疗研究进展最快。1995年，美国重组DNA顾问委员会(Recombinant DNA Advisory Committee)批准了第一个用于人体RA基因治疗的方案，这也是第一个被批准用于人类非致命性疾病的基因治疗方案。本方案将已插入hIL-1ra基因的重组反转录病毒载体MFG-IRAP，经病毒包装细胞包装后生成带治疗基因的重组病毒颗粒，用它感染体外培养的患者滑膜细胞，使滑膜细胞能表达hIL-1ra。再将能表达hIL-1ra的滑膜细胞注射到RA患者的关节内[3]，以治疗患者的RA。1996年7月，已将这一方案正式用于对9名RA患者进行基因治疗。在应用中，细胞表达hIL-1ra的量必需达到30ng/106细胞/48小时以上才被筛选使用[3]。
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对OA的基因治疗在国际上还刚刚起步，目前只有个别报导。Pelletier等人[43]将hIL-1ra基因重组到MFG反转录病毒载体上，重组病毒颗粒用于感染狗膝关节的自体滑膜细胞，筛选后注射到用切断狗膝关节前交叉韧带所制做的骨关节炎模型中，2周时关节冲洗液中的hIL-1ra含量为202.8±131.5ng/ml，4周时为2.8±2.2ng/ml hIL-1ra。关节内表达的hIL-1ra对OA的炎症和关节软骨的破坏均有明显的抑制作用。
国内还未见到有关对RA、OA进行基因治疗的报导。
4 存在的问题
总之，目前骨关节炎基因治疗的现状是：
(1)对RA基因治疗的工作已经开展得比较深入，而对OA基因治疗的研究还刚开始。
(2)所有有关工作只重视用单一基因进行基因治疗。而骨关节炎的发病因素中远不止一种hIL-1或TNF-α，相关研究已经证明，联合应用重组hIL-1ra蛋白和TNF受体蛋白治疗关节炎可使疗效明显加强[43，44]，还有必要在这方面进行尝试。
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(3)治疗基因的表达量有待进一步提高。在目前有关关节炎基因治疗的研究报告中，hIL-1ra的表达量从30ng/106细胞/48小时[3]至5000ng/106细胞/24小时不等[37]。体外实验已经证明，需1000ng的hIL-1ra才能完全抑制1ng的IL-1对小鼠髌骨软骨中蛋白多糖降解作用[37]。因此，达不到一定的表达量，治疗基因就不到应有的治疗作用。可试用腺病毒辅助的反转录病素介导的EX VIVO法增加治疗基因的表达量。
(4)治疗基因的表达时间有待延长。Bakker等人[37]用每24小时能产生1000ng hIL-1ra的NIH3T3细胞关节内注射，完全抑制了小鼠RA模型的炎症、渗出和关节软骨破坏。但这样高的表达量只持续了5天，限制了此方案的实用性。原因是多方面的。原因之一可能是MFG反转录病毒的重组载体在成纤维细胞样细胞中表达治疗基因时，控制基因表达的长末端重复序列(LTR)的作用大约是一个月时间[51]。如果将成纤维细胞或滑膜细胞换成动物自体骨髓中的造血干细胞，可能可以明显延长基因表达时间[41]。
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(5)所用病毒载体的安全性还有待于进一步确认。用于在基因治疗中转移治疗基因的载体除了病毒载体外，还有很多非病毒载体(如质粒DNA和脂质体载体等)。但是，因为病毒载体在治疗基因的转移效率和治疗基因的表达量和稳定性等方面比非病毒载体具有明显的优越性，绝大多数的基因治疗方案还在采用病毒载体。其中最多的是反转录病毒载体[55]。虽然用于转移基因的反转录病毒是通过改建的、自身不能复制的复制缺陷型病毒，通过大量的动物试验和临床应用，已经证明，复制缺陷型的反转录病毒对宿主细胞的插入突变和与野生病毒共生时恢复复制能力而致病的发生率只是小于或等于自发突变率[52]，但是，反转录病毒的致癌性，反转录病毒可以随机插入人类基因组中所导致的可能有害的基因突变，以及反转录病毒载体在人体中万一遇到野生型病毒而恢复复制能力的可能性，直到目前还困扰着人们。从理论上说，使用腺病毒载体容易诱发炎症反应，可以导致破坏性的细胞免疫应答，与野生腺病素重组致病的可能性比反转录病毒更大。所以，开发更安全、更好用的基因治疗载体是今后进行基因治疗的最艰巨的任务。
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5 对骨关节炎进行基因治疗的展望
(1)与RA相比，OA所累及的关节数比RA少，也很少像RA那样伴有全身症状，更适合使用关节局部基因治疗；OA的临床症状和关节受损程度比同等级别的RA轻，对OA的基因治疗效果会更佳；OA累及的人群比RA大得多，基因治疗的效益也会比RA更大。
(2)OA是长期从事专项训练的运动员的常见病、多发病，对运动员的训练和运动成绩的提高危害也较大。从治疗效果不佳、反复发作、长期遭受关节肿痛和关节功能受限折磨而不能参加正常训练、不能提高运动成绩的患有OA的运动员的需要和实现的可能性考虑，对OA进行基因治疗的研究是必要的。
(3)对OA的基因治疗研究虽然刚刚起步，但是，由于hIL-1、TNF-α等细胞因子和生长因子在OA和RA发病中的作用类似，又有对RA基因治疗的研究基础和临床应用基础，对OA基因治疗方案的完善将会比RA更快，将OA基因治疗方案从研究推向临床应用所花的时间可能会比RA更短。
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(4)实验研究已经证明，在制做骨关节炎动物模型时，在骨关节炎尚未发生时就将hIL-1ra基因(治疗基因)导入关节内，结果发现，关节内表达的hIL-1ra可明显抑制关节内的炎症反应，并可有效阻止病变区的软骨组织的破坏[43]。可见，对骨关节炎的基因治疗方案有可能在预防运动员骨关节炎的发生方面有着重要用途。一个运动员从开始进行比较密集的专项训练到退役，短的只有几年，长的也只不过十来年。如果对OA的基因治疗方案可以在接受一次治疗后使治疗剂量的有效治疗成份hIL-1ra的表达时间持续半年到一年，那么，运动员在服役期间，只需接受每年1—2次的关节内注射就可达到有效预防骨关节炎的目的。这样，不仅可以保证运动员在服役期间最大地发挥他的运动潜能，创造更多的好成绩，而且，运动员退役后所拥有的健康关节会极大地改善他退役后的生活质量。
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(1998.04.10收稿), 百拇医药
单位：余家阔 于长隆 曲绵域 (北京医科大学运动医学研究所(100083))
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骨关节炎的基因治疗现状和应用前景1 前言
显微手术，器官、组织的移植或置换手术，关节镜、组织镜等微创手术的发展，给运动创伤和运动骨科的发展带来了勃勃生机。自从基因治疗技术从当初的只用于治疗典型的遗传性基因缺陷病[1]，转向目前广泛用于治疗多种获得性疾病(如肿瘤、关节炎和骨与软组织损伤)以来[2～6]，对创伤领域获得性疾病的基因治疗，正成为全世界关注的热点，1996和1997年的有关文献猛增。
目前，对类风湿性关节炎(RA)的基因治疗，已于1996年进入临床I期应用阶段[3]。骨关节炎(OA)是比RA更常见的关节疾患。在最常见的三大老年病中，OA的患病率和患病人数在世界范围内均居于首位[7]。60—70岁的老年人的OA患病率约为60%，70岁以上的老年人的OA患病率约为70[50]。有资料表明，所有专项训练的运动员，其骨关节炎的发病率均比同龄普通人群高[53]。我所对多种项目运动员伤病的统计资料表明，膝关节是全身各关节中发生运动创伤最多的关节，其中又以慢性劳损伤所致的膝关节骨关节炎最常见[54]。
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至今，治疗OA的最常用方法仍是药物治疗。在全身给药的过程中(口服、肌注和静脉滴注)，到达关节内的药量很有限，全身组织、器官均要暴露在药物的副作用之下，药物的半衰期往往较短，长期反复用药又使得病人不易坚持。关节内药物注射虽然可以解决药物进入关节内的问题，但是，因为药物半衰期和疗效持续时间的限制，关节内药物注射要反复多次进行，大大增加了关节感染的机会。直到目前，还没有一种药物对OA的治疗效果和治疗方便程度令人满意。对骨关节炎的手术治疗也不能很好解决关节软骨的修复问题，更不能解决关节软骨随病程进展还将被进一步破坏的结局。许多晚期病人不得不接受人工关节置换手术。所以，有些学者称骨关节炎是不可治愈的疾患[8，9]。用基因治疗的方法将编码某一有治疗作用的蛋白的基因用适当的载体转化到关节滑膜或关节软骨中去，使该基因可以在关节中长期、稳定、高效地表达，类似于在关节内放入了无数个小的制药厂，药物被不停地生产出来，并不停地作用于有病变的单一关节。因此推测，基因治疗方法用于治疗骨关节炎，将可能改变治疗骨关节炎的现状[10]。
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随着基因治疗方法被不断完善和人们对病毒载体安全性的进一步了解，越来越多的基因治疗方案被批准应用。到1996年，美洲、欧洲所申报的基因治疗方案已达232个，比1995年增加82个；接受各种基因治疗的病人数也从1062例增加到1537例[11]。因此，增加对此方面的了解是有一定必要的。
2 细胞因子、生长因子和骨关节炎的发生
近年来的研究表明，细胞因子和多肽生长因子不仅在关节软骨和滑膜的正常结构和功能的维持方面起着重要作用，而且，一些因子在关节炎的病理过程中对关节软骨和关节滑膜也具有一定的破坏作用[12，13，15]。其中，胰岛素样生长因子(IGF,insulin-like growth factor)在骨关节炎(OA,osteoarthritis)发生过程中对软骨细胞蛋白多糖的合成起着关键的调节作用[17]。转化生长因子-β(TGF-β,transforming growth factor-beta)在关节内的主要作用有：促进大分子量和小分子量蛋白多糖的合成，促进酶抑制蛋白的合成，增加白细胞介素-1受体拮抗蛋白(IL-1ra,interleukin-1 receptor antagonist)的表达。减少白细胞介素-1受体(IL-1R,interleukin-1receptor)表达，并有促进关节软骨边缘和关节囊止点处骨刺或骨唇形成的作用[15]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,basic fibroblast growth factor)可促进IL-1R和白细胞介素-1(IL-1)介导的蛋白酶表达[18，19]，还可能参与OA滑膜的增生过程[20]。
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在OA发生中最引人注目的是白细胞介素-1(IL-1,interleukin-1)和肿瘤坏死因子(TNF，tumor necrosis factor)这两种细胞因子[15，16]。IL-1和TNF是关节炎病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子[15，16，21]。IL-1可抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅸ型胶原的合成，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成，使软骨的结构蛋白发生质的改变，这在OA的发生中要比促进软骨基质的降解更有破坏性[22]。IL-1可通过刺激滑膜细胞产生胶原酶和酪蛋白酶[23]、刺激软骨细胞产生金属蛋白酶[24]，从而促进软骨基质的降解；可通过刺激滑膜细胞产生前列腺素E2(PEG2)[24]和分泌血管细胞粘附分子-1(VCAM-1,vascular cell adhesion molecule-1)[25]，参与炎症反应；可促进骨吸收及成骨细胞样细胞的增殖，与OA的骨刺或骨唇形成以及软骨下骨的囊性变有关[21，24，25]。已知骨形态发生蛋白(BMP,bone morphogenetic protein)可在肌肉组织中诱导异位骨化，但在植入BMP的肌肉处注射抗IL-1的单克隆抗体或多克隆抗体，就会使BMP诱导异位骨化失败[26]，也说明IL-1也可能与OA的骨刺或骨唇形成有关。Hung等人[27]将重组人白细胞介素-1β(rhIL-1 β,recombinant human interleukin-1)注入兔膝关节，发现滑膜内有大量白细胞浸润，滑膜细胞增生，滑膜肥厚，并有关节软骨蛋白多糖合成下降。
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TNF在关节炎(包括OA)的发生过程中对关节软骨起着重要的破坏作用[15，16]。Cameron等人[45]对因膝关节前交叉韧带断裂所致的急性、亚急性和慢性膝关节炎的关节液中的TNF-α、IL-1的含量进行了测定。急性关节炎中，关节液中的TNF-α的含量突然增加，而IL-1的含量增加却不明显。亚急性和慢性期时，TNF-α的含量虽有所下降但仍比IL-1高。有人证明，无论是用胶原诱导关节炎之前[46]，还是用胶原诱导关节炎之后[47]，向关节内注射TNF-α均可加重关节炎的病变。反之，用胶原诱导关节炎之前或之后[48，49]向关节内注射的TNF-α的单克隆抗体则可以明显减轻关节炎病变。
可见，消除IL-1和TNF的作用在OA的治疗和预防中是很关键的。
3 对骨关节炎进行基因治疗的现状
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鉴于IL-1在骨关节炎发病中的十分重要的作用，目前对骨关节炎进行基因治疗的最基本目的是用特定的基因转移载体为工具(如反转录病毒载体、腺病毒载体、脂质体载体等)，将白细胞介-1素受体拮抗蛋白(hIL-1ra)基因转移到关节内，使该基因在关节内大量表达，表达出的hIL-1ra与病理状态下产生的hIL-1相互作用，从而阻断hIL-1的破坏作用，达到对骨关节炎的预防、治疗或长期稳定地减轻骨关节炎患者的临床症状的目的。
1992年，Bandara等人用反转录病毒为载体，将β-半乳糖苷酶(LacZ)基因转化到体外培养兔滑膜细胞中，再将这些有LacZ基因表达的细胞注射到兔膝关节中，使LacZ基因在膝关节滑膜中的表达时间长达3个月，并提出了用此方法对关节炎进行基因治疗的设想[10]。
目前用于基因治疗的关节炎的动物模型有胶原诱导的关节炎(CIA,collagen induced arthritis,一种类风湿性关节炎的运动模型)[28]，细菌细胞壁蛋白诱导的大鼠踝关节关节炎[29]和重组人白细胞介素-1β(rhIL-1β)关节内注射导致的兔膝关节关节炎[29]几种，还有一些用正常关节[30]和培养细胞进行基因转化和基因表达研究的[30，31]。这些研究中所用的基因转移载体有反转录病毒载体(如MFG载体)[3，27，29，30]，腺病毒载体[31—35]和HVJ(日本Sandai病毒)——脂质体的复合载体[36]等。所用靶细胞有软骨细胞[28，33]、滑膜细胞[10，12，27，30，31]、中国仓鼠卵细胞(CHO)[28]、NIH3T3细胞[37]，淋巴细胞[38]和脾细胞[39]等。所用的靶组织有滑膜组织[28]和软骨组织[31]。所用治疗基因除了个别报导的血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的编码基因[32]、TGF-β基因[38]、TNF受体基因[39]、IL-4基因和IL-13基因等以外，其余均为人白细胞介素-1受体拮抗蛋白(hIL-1ra)基因[4，27，29，30，31，33，37]。所用的基因治疗方案主要有EX VIVO方法和IN VIVO方法两种。用EX VIVO方法时，先将含治疗基因的重组病毒载体转化到病毒包装细胞中生产重组病毒颗粒，再用重组病毒颗粒感染体外培养的细胞，使细胞中有治疗基因的表达，再将表达治疗基因的细胞注射到关节内[29，30]，从而达到对关节炎进行基因治疗的目的。用IN VIVO方法时，直接将插入治疗基因的重组病毒颗粒注射到关节内[28，36]，以达到治疗基因在关节内直接表达的目的。
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Hung等人[27]把hIL-1ra基因重组到反转录病毒上，将重组病毒转化到体外培养滑膜细胞中，再将有hIL-1ra表达的滑膜细胞注射到被rhIL-1 β诱导出关节炎的关节内，可使滑膜内白细胞浸润、滑膜细胞增生、滑膜肥厚和关节软骨蛋白多糖合成减少等病理变化得到抑制。而且，hIL-1ra在关节内的表达时间可达3个月。
Bakker[37]等人用MFG反转录病毒作载体将hIL-1ra基因转染到NIF3T3成纤维细胞中，体外hIL-1ra的表达量最高达5000ng/106 NIH3T3细胞/24小时。在关节炎未发生之前就将可表达hIL-1ra的NIH3T3细胞注射到膝关节中，结果发现，关节内表达的hIL-1ra完全阻止了胶原诱导的关节炎症和软骨破坏。
Markarov等人[40]将hIL-1ra基因重组到SRAM3反转录病毒载体上，再用重组病毒颗粒感染大鼠滑膜细胞，体外表达量为200ng hIL-1ra/106细胞/24小时。
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Boggs[41]等人用MFG反转录病毒载体重组上hIL-1ra基因，用经过包装细胞繁殖的重组病毒颗粒感染小鼠骨髓中的造血干细胞后，再注射到经射线照射的小鼠体内，小鼠血清中hIL-1ra的含量可达40-1200ng/ml血清，表达时间可长达15个月。
用腺病毒载体重组上hIL-1ra后，使其在体外培养的软骨细胞中表达，表达量可达1000ng/ml细胞上清液。观察时间为10天[42]。将有hIL-1ra表达的软骨细胞移植到体外培养关节软骨块的表面继续培养，可防止IL-1介导的培养软骨块中软骨基质的降解[42]。
在各种关节炎基因治疗的研究中，RA的基因治疗研究进展最快。1995年，美国重组DNA顾问委员会(Recombinant DNA Advisory Committee)批准了第一个用于人体RA基因治疗的方案，这也是第一个被批准用于人类非致命性疾病的基因治疗方案。本方案将已插入hIL-1ra基因的重组反转录病毒载体MFG-IRAP，经病毒包装细胞包装后生成带治疗基因的重组病毒颗粒，用它感染体外培养的患者滑膜细胞，使滑膜细胞能表达hIL-1ra。再将能表达hIL-1ra的滑膜细胞注射到RA患者的关节内[3]，以治疗患者的RA。1996年7月，已将这一方案正式用于对9名RA患者进行基因治疗。在应用中，细胞表达hIL-1ra的量必需达到30ng/106细胞/48小时以上才被筛选使用[3]。
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对OA的基因治疗在国际上还刚刚起步，目前只有个别报导。Pelletier等人[43]将hIL-1ra基因重组到MFG反转录病毒载体上，重组病毒颗粒用于感染狗膝关节的自体滑膜细胞，筛选后注射到用切断狗膝关节前交叉韧带所制做的骨关节炎模型中，2周时关节冲洗液中的hIL-1ra含量为202.8±131.5ng/ml，4周时为2.8±2.2ng/ml hIL-1ra。关节内表达的hIL-1ra对OA的炎症和关节软骨的破坏均有明显的抑制作用。
国内还未见到有关对RA、OA进行基因治疗的报导。
4 存在的问题
总之，目前骨关节炎基因治疗的现状是：
(1)对RA基因治疗的工作已经开展得比较深入，而对OA基因治疗的研究还刚开始。
(2)所有有关工作只重视用单一基因进行基因治疗。而骨关节炎的发病因素中远不止一种hIL-1或TNF-α，相关研究已经证明，联合应用重组hIL-1ra蛋白和TNF受体蛋白治疗关节炎可使疗效明显加强[43，44]，还有必要在这方面进行尝试。
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(3)治疗基因的表达量有待进一步提高。在目前有关关节炎基因治疗的研究报告中，hIL-1ra的表达量从30ng/106细胞/48小时[3]至5000ng/106细胞/24小时不等[37]。体外实验已经证明，需1000ng的hIL-1ra才能完全抑制1ng的IL-1对小鼠髌骨软骨中蛋白多糖降解作用[37]。因此，达不到一定的表达量，治疗基因就不到应有的治疗作用。可试用腺病毒辅助的反转录病素介导的EX VIVO法增加治疗基因的表达量。
(4)治疗基因的表达时间有待延长。Bakker等人[37]用每24小时能产生1000ng hIL-1ra的NIH3T3细胞关节内注射，完全抑制了小鼠RA模型的炎症、渗出和关节软骨破坏。但这样高的表达量只持续了5天，限制了此方案的实用性。原因是多方面的。原因之一可能是MFG反转录病毒的重组载体在成纤维细胞样细胞中表达治疗基因时，控制基因表达的长末端重复序列(LTR)的作用大约是一个月时间[51]。如果将成纤维细胞或滑膜细胞换成动物自体骨髓中的造血干细胞，可能可以明显延长基因表达时间[41]。
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(5)所用病毒载体的安全性还有待于进一步确认。用于在基因治疗中转移治疗基因的载体除了病毒载体外，还有很多非病毒载体(如质粒DNA和脂质体载体等)。但是，因为病毒载体在治疗基因的转移效率和治疗基因的表达量和稳定性等方面比非病毒载体具有明显的优越性，绝大多数的基因治疗方案还在采用病毒载体。其中最多的是反转录病毒载体[55]。虽然用于转移基因的反转录病毒是通过改建的、自身不能复制的复制缺陷型病毒，通过大量的动物试验和临床应用，已经证明，复制缺陷型的反转录病毒对宿主细胞的插入突变和与野生病毒共生时恢复复制能力而致病的发生率只是小于或等于自发突变率[52]，但是，反转录病毒的致癌性，反转录病毒可以随机插入人类基因组中所导致的可能有害的基因突变，以及反转录病毒载体在人体中万一遇到野生型病毒而恢复复制能力的可能性，直到目前还困扰着人们。从理论上说，使用腺病毒载体容易诱发炎症反应，可以导致破坏性的细胞免疫应答，与野生腺病素重组致病的可能性比反转录病毒更大。所以，开发更安全、更好用的基因治疗载体是今后进行基因治疗的最艰巨的任务。
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5 对骨关节炎进行基因治疗的展望
(1)与RA相比，OA所累及的关节数比RA少，也很少像RA那样伴有全身症状，更适合使用关节局部基因治疗；OA的临床症状和关节受损程度比同等级别的RA轻，对OA的基因治疗效果会更佳；OA累及的人群比RA大得多，基因治疗的效益也会比RA更大。
(2)OA是长期从事专项训练的运动员的常见病、多发病，对运动员的训练和运动成绩的提高危害也较大。从治疗效果不佳、反复发作、长期遭受关节肿痛和关节功能受限折磨而不能参加正常训练、不能提高运动成绩的患有OA的运动员的需要和实现的可能性考虑，对OA进行基因治疗的研究是必要的。
(3)对OA的基因治疗研究虽然刚刚起步，但是，由于hIL-1、TNF-α等细胞因子和生长因子在OA和RA发病中的作用类似，又有对RA基因治疗的研究基础和临床应用基础，对OA基因治疗方案的完善将会比RA更快，将OA基因治疗方案从研究推向临床应用所花的时间可能会比RA更短。
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(4)实验研究已经证明，在制做骨关节炎动物模型时，在骨关节炎尚未发生时就将hIL-1ra基因(治疗基因)导入关节内，结果发现，关节内表达的hIL-1ra可明显抑制关节内的炎症反应，并可有效阻止病变区的软骨组织的破坏[43]。可见，对骨关节炎的基因治疗方案有可能在预防运动员骨关节炎的发生方面有着重要用途。一个运动员从开始进行比较密集的专项训练到退役，短的只有几年，长的也只不过十来年。如果对OA的基因治疗方案可以在接受一次治疗后使治疗剂量的有效治疗成份hIL-1ra的表达时间持续半年到一年，那么，运动员在服役期间，只需接受每年1—2次的关节内注射就可达到有效预防骨关节炎的目的。这样，不仅可以保证运动员在服役期间最大地发挥他的运动潜能，创造更多的好成绩，而且，运动员退役后所拥有的健康关节会极大地改善他退役后的生活质量。
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