理气扶正中药消除运动性疲劳过程中骨骼肌α-肌动蛋白基因的表达*
作者：赵中应 冯连世 宗丕芳
单位：赵中应 冯连世 宗丕芳 (国家体育总局体育科学研究所 (北京 100061))
关键词：理气扶正中药；疲劳；骨骼肌；α-肌动蛋白；表达
中国运动医学杂志980408 提要 为了探讨运动性疲劳过程中理气扶正中药作用的分子机理以及寻求安全有效的消除运动性疲劳的中药复方制剂，设计了强化训练导致疲劳的大鼠模型，用定量反转录聚合酶链式反应(Quantitative RTPCR)方法，研究了疲劳恢复过程中，大鼠骨骼肌α-肌动蛋白(α-actin)基因表达的变化。结果表明：所有运动施药组的表达均高于安静对照组，且强化训练恢复24小时组(E-24)、强化训练恢复48小时组(E—48)显著高于安静对照组。强化训练施药组较相应的强化训练非施药组均无明显差异。结果提示理气扶正中药在大鼠运动性疲劳恢复过程中对骨骼肌α-肌动蛋白基因表达的作用具有时效性
, 百拇医药
Expression of α-actin in skeletal muscle during removing exercise-induced
muscle fatigue in rats by the Li-qi Fu-zhen Chinese medicine
Zhao Zhongying,Feng Lianshi,Zong Pifang
National Research Institute of Sports Science, Beijing 100061
In order to investigate the molecular mechanism of Li-qi Fu-zhen Chinese medicine during removing exercise-induced muscle fatigue and seek for an effective Chinese medicine compound dealing with exercise fatigue,an SD rat model of intensive training was constructed and the expression of α-actin of skeletal muscle during refreshine was studied by the quantitative RT-PCR(QRT-PCR). It shows that the expression level of all groups treated with the Chinese medicine is higher than that of rest control,and the expression after 24 and 48 hours from intensive training increases significantly than that from rest control.There is no-significant difference between the groups treated and non-treated with the Chinese medicine.These results suggest that a timing exists while Li-qi Fu-zhen Chinese medicine functions on expression of α-actin in skeletal muscle.
, 百拇医药
Key words:Li-qi Fu-zhen Chinese medicine,fatigue,skeletal muscle,α-actin,expression
1 前言
用补脾中药消除运动疲劳已有诸多研究[1，2]。有些疏肝理气药物具有良好的改善肌肉能量代谢的作用，运用补益与疏理肝气和脾气的中药制剂可使损伤的肌纤维基本恢复正常，并纠正能量代谢的异常[1，2]。骨骼肌肌纤维的再生受多种因素的调节。α-肌动蛋白(α-actin),作为肌纤维的重要组成部分，其再生同样受多种因素的调节。近年来有不少学者指出肌肉生成决定因子(MDFs)是参与建立和维持骨骼肌细胞中肌肉生成策略的重要因素[3、4]。但骨骼肌中这些肌肉特异性的依赖于MDFs存在的启动子如何起作用尚不清楚。到目前为止，有关中药对运动性疲劳过程中骨骼肌α-肌动蛋白(α-actin)基因表达变化的研究尚未见报导。本文从分子生物学的角度研究理气扶正类中药制剂对骨骼肌α-肌动蛋白基因表达的影响，从而进一步弄清该中药制剂在肌纤维再生过程中作用的分子机理。
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2 材料与方法
2.1 实验对象：雄性SD大鼠110只(北京医科大学实验动物研究部提供)，体重160±20g。经过在电跑道上筛选后，将能跑的动物进行正规训练，留下10只作为安静对照组(C)，自由饮食、饮水，不运动。
2.2 训练方法：采用逐渐增强的方式进行跑台训练，坡度为0，每周5天，每天20分钟，每周一重复前周5的速度，周二、周三、周四逐日加量，达到本周要求的速度，周5重复。第1至第5周的每周末，分别达到15米/分、22米/分、27米/分、31米/分、35米/分的目标速度。训练动物于第5周末随机分为两大组。第一大组为强化训练，与安静对照组一样每日灌水；另一大组为强化训练+中药组，每日施药(安静对照组既不运动又不施药，且只取材1次)。这2大组都继续训练及延长时间达每日30分，于7周末将这两大组各分成3组，每组8—10只，按不同的时间点分别取材。取材各组为：安静对照组(C)；训练组(E)，包括强化训练安静组(ER)，强化训练运动即刻组(E-0)，强化训练恢复30分钟组(E-0.5)，强化训练恢复24小时组(E-24)，强化训练恢复48小时组(E-48)；运动施药组(EM)，包括强化训练加中药安静组(EMR)，强化训练+中药运动即刻组(EM-0)，强化训练+中药恢复30分钟组(EM=0.5)，强化训练+中药恢复24小时组(EM-24)，强化训练+中药恢复48小时组(EM-48)。
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2.3 取材：取股四头肌肌腹处组织置-80℃低温冰箱中保存备用。
2.4 定量：定量反转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)
2.4.1 总RNA的提取(异硫酸氰胍一步法)
取米粒大小的肌肉组织置1.5ml的无菌eppendorf管中，并用眼科剪将其剪碎，加入RNA裂解液(北京鼎国生物技术发展中心提供)200ul，室温放置10min后，加入100μl三氯甲烷，充分混匀，12，000 rpm离心10分钟，取上清液并向其中加入3倍体积的无水乙醇低温沉淀20min，12，000rpm离心10min,75%乙醇洗，空气干燥。
2.4.2 反转录及PCR反应
采用北京鼎国生物技术发展中心QRT-PCR试剂盒。经互联网搜索GENBANK中的α-肌动蛋白基因并用其中的Picker-3进行引物设计。内参照为400bp，截取的α-肌动蛋白为189bp。
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向得到的总RNA中加入15μl RT液，加入 1μl AMV，混匀，42℃保温30分钟。取5μl反应产物置500μl薄壁管中，加入20μl PCR液(内含内参照引物)及80ng上下游α-肌动蛋白引物，再加入1μl Taq酶及适量石蜡油。94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟，在PE480热循环仪上进行35个循环。取15μl产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳。结果用Pharmacia LKB UltroScan XL扫描仪作光密度扫描。
2.5 数据的统计学处理：每个数据代表α-肌动蛋白与内参照条带的灰度比，所有组数据一律采用X±SD表示，用SPSS软件进行独立样本t检验，显著性水平：p<0.05为显著差异，p<0.01为极显著差异
3 结果(见图1、表1)
图1 大鼠骨骼肌α-肌动蛋白QRT-PCR电泳结果
, 百拇医药
Figure 1 The electrophoresis bands of rat α-actin in QRT-PCR
3.1 所有EM组与C组的比较：各组表达均高于C组的表达，并且EM—24组较C组有极显著的增加(P<0.01)，EM—48小时组较C组有显著的增加(P<0.05)，其它各施药组较C组无显著性增加(P>0.05)。
表1 大鼠骨骼肌α-肌动蛋白与内参照条带的灰度比结果
Tab.1 The ratio between intensities of bands corresponding to α-actin and internal reference of rat skeletal muscle 组别group
训练后安静组
, 百拇医药 rest after
exercise
训练后即刻组
immediately after
exercise
训练后半小时
0.5hr after
exercise
训练后24小时
24 hrs after
exercise
训练后48小时
, 百拇医药
48 hrs after
exercise
安静对照组
rest control
0.32±0.04
训练组
exercise
0.51±0.23*
0.52±0.05
0.66±0.23**
0.50±0.13
0.40±0.12
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训练施药组
exercise+
medicine
0.74±0.07
0.66±0.15
0.49±0.14
0.50±0.23**
0.60±0.12
*表示p<0.05，**表示p<0.01(与安静对照组比较)。*means p<0.05,**means p<0.01(comparison with rest control)
3.2 EM—0、EM—0.5、EM—24、EM—48组与EMR组的比较：只有EM—24组较EMR组有显著性降低(p<0.05)，其余各恢复组较EMR组均无显著性降低(p>0.05)。
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3.3 EM—0.5、EM—24、EM—48组与EM—0组的比较：各组均低于EM—0组，但无显著性差异(p>0.05)。
3.4 E组与相应EM组的比较：安静组、恢复即刻组、恢复48小时的EM组较相应的E组均有不同程度的升高，但均无显著性差别(p>0.05)，而恢复30分钟的EM组较相应的E组有非显著性降低(p>0.05)，恢复24小时EM与E组基本持平。
4 分析与讨论
有关中药在恢复体能和调节机体免疫力方面的作用已不容置疑。从中医理论角度，曾有人提出运动性疲劳的原因在于脾气运化失调的观点，并证实在运动时，当肌肉发生疲劳时，脾的运化失调，物质能量代谢系统出现代谢障碍。另外，脾的功能失调又可影响到肝，从而造成机体整体调节紊乱，导致运动性疲劳的发生。本研究 进一步从骨骼肌α-肌动蛋白的基因表达入手，探讨了理气扶正中药对疲劳中骨骼肌作用的分子机理。
, 百拇医药
骨骼肌α-肌动蛋白是骨骼肌中一种重要的收缩蛋白，对维持骨骼肌的结构和功能起着至关重要的作用。许多收缩蛋白由小的多基因家族所编码，这些基因在心室、心房、平滑肌、快肌及慢肌中的差异性表达赋予不同的蛋白表型，它们的表达大多数是在转录水平上加以调控[5]。在哺乳动物中已鉴定出6种同工型肌动蛋白，包括2种非肌肉型肌动蛋白(β和γ)、2种平滑肌型肌动蛋白(γ小肠型和α血管型)以及2种横纹肌型肌动蛋白(α骨骼肌型和α心肌型)。它们的名称根据其表达的主要组织以及其等电点而确定，其中α、β及γ的等电点依次上升。其编码序列高度保守，但他们的非翻译区序列却变化较大。肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白(G-actin)，由375个氨基酸所组成，分子量为42KD。生物体中包含7个肌动蛋白基因，编码不同的肌动蛋白同功蛋白。它们含有较多的酸性氨基酸残基，等电点约为5.5，α-肌动蛋白的等电点最低(PI=5.4)[6]。α-肌动蛋白普遍存在于哺乳动物的各种细胞中，作为细胞骨架的主要成分之一，对维持细胞形态、产生细胞运动及细胞其他的生理功能发挥着重要作用。这在肌肉组织中表现得尤为突出，因为它与肌球蛋白一起，构成了肌肉收缩蛋白的主要成份。
, 百拇医药
骨骼肌肌动蛋白的表达调控较为复杂，以哺乳动物为例，其骨骼肌的肌动蛋白基因含有多个转录因子的结合位点。例如CArG框，结合一种与血清反应因子(SRF)相同或相关的因子；再如E框，结合肌肉生成决定因子如MyoD和肌肉生成素；还有-CCGCCC-位点，结合转录因子Sp1[7]。目前克隆的肌动蛋白基因只有人、牛及少数啮齿类。大鼠骨骼肌α-肌动蛋白已由R.Zakut et al(1982)克隆并进行了核苷酸序列的测定[8]。它包括7个外显子和6个内含子，在5’非翻译区(UTR)有一个较大的内含子，编码区内部有5个较小的内含子。由其核苷酸序列推导的氨基酸序列与兔及牛骨骼肌111完全一致。在第161个核苷酸处存在一个Goldberg-Hogness框，通过S1核酸内切酶分析以后，发现该位点的下游第30个核苷酸处有转录起始点ACAC。从已得到的数据表明，尽管肌动蛋白氨基酸序列具有较强的保守性，但内含子的数目和位置变异很大，这些内含子是很多基因进化的源泉之一。
骨骼肌α-肌动蛋白的表达受多种药物的影响。Philip B et al[9]对去神经7天的大鼠施以双氯醇胺〔一种人工合成代谢药物〕，发现其可以完全阻止去神经比目鱼及腓肠肌α-肌动蛋白mRNA及细胞色素mRNA的下降，而对悬垂后肢的蛋白含量却无明显影响。但通过对正常雄性大鼠进行7天的双氯醇胺处理以后，发现其总肌肉蛋白合成速率上升了34%，并且腓肠肌体积增加了13%。这些数据表明双氯醇胺可以在萎缩成年大鼠骨骼肌中维持某些RNA的含量，但其机理尚不清楚。Robert et al[10]研究显示睾酮也能通过肌肉蛋白的合成来增加肌肉的体积，但这种蛋白合成的增加是由mRNA的合成增加所致还是其他调控因素在起作用尚不得知。本文的研究结果也显示理气扶正中药也可导致其中的3组运动施药组大鼠较相应的运动非施药组大鼠α肌动蛋白表达的非显著性增加，即安静组、恢复即刻组、恢复48小时的EM组较相应的E组均有不同程度的非显著性升高，分别提高45.1%、26.9%和50%，而恢复30分钟的EM组较相应的E组降低了34.7%，恢复24小时EM与E组基本持平。这说明理气扶正中药对骨骼肌α肌动蛋白表达的影响具有一定的时间性，且运动可能在其中起重要作用。恢复30分钟组表达的下降，这一方面可能是由于该时间段由于能量供给相对不足，RNA合成速率小于其降解速率，另一方面可能是中药本身在此时的不同作用所致。另外，从表1还可看出，所有运动施药组较安静对照组均有不同程度的增加，且恢复后24及48小时分别有极显著和显著的增加。这提示理气扶正中药影响α-肌动蛋白表达的最佳时间在运动恢复后的24小时左右，之后逐渐降低。mRNA在体内的含量是其分解与合成动态平衡的结果，理气扶正中药在运动性疲劳恢复过程中究竟是促进α-肌动蛋白mRNA的合成还是增加其稳定性还有待于进一步的研究。
, 百拇医药
Donald B et al[11]成功地利用反转录病毒将大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因连同启动子导入大鼠损伤的骨骼组织并获得了稳定的表达。该技术将会使完整成年哺乳动物骨骼肌中肌肉特异的基因及其启动子表达的研究成为可能。此外，通过刺激干细胞增殖以使该反转录病毒介导的基因转移普遍使用于其他组织中。研究基因表达的经典方法大多以点杂交、Northern、S1核酸酶保护法为主。但这些方法大多频聚繁琐，且操作中的系统误差在所难免。本研究用一种新的分析基因表达的方法——定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,即RT-PCR)方法是当今定量分析基因表达的一种最为快速而又敏感的方法[13]，其敏感性高，特异性强，并且能够同时分析大量的样本。该技术的关键在于选择一个合适的内参照。本研究中截取了大鼠18SmRNA中5’端400bp的片段作为内参照。因为18SmRNA在细胞总mRNA中丰度最高，且表达相对较为稳定，是一种较为理想的内参照。该方法在前期处理中无须任何定量操作，2对引物在同一体系中扩增，避免了不同样本分别扩增时的产生的定量误差。但本方法也有不足之处，因为2对引物序列及扩增序列的不同可能会造成扩增效率的差异，这可能会带来一定的误差。另外，由于内参照模板的绝对量是未知的。故无法对目的基因进行绝对定量，而只能对其进行相对定量。
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总之，骨骼肌α-肌动蛋白合成的调节可能涉及多个水平的调节，如基因结构、转录、转录后、翻译、翻译后水平的调节等，这其中的每一个环节可受诸多因素的影响，摸索某一环节或几个环节中特定的影响因素，不仅可进一步弄清α-肌动蛋白表达的调控机制，而且也为合理的药物设计提供理论依据。
*本课题受国家自然科学基金重点课题No.39430140资助
参考文献
1.杨维益等，健脾理气法对骨骼肌能量代谢的研究，中国运动医学杂志，1994；(1)：28—31
2.杨维益等，健脾理气方药与能量代谢的关系，北京中医药大学学报，1994，(2)：64
3.Olson EN MyoD family:Aparadigm for development? Genes Dev,1990;4:1454-1461
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4.Weintraub H,et al.The MyoD gene family:Nodal point during specification of the muscle cell lineage.Science ,1991;251:761-766
5.Vittorio S,et al.Muscle-specific gene expression:a comparison of cardiac andskeletal muscle transcription strategies.Circulation Research,1993;72(5):925-931
6.陈明，李爱媛，肌动蛋白、肌动蛋白结合蛋白质和细胞运动的研究进展，生命科学；1997，9(1)：1—7
7.Helen W,et al. the nucleotide sequence,structure,and preliminary studies on the transcriptional regulation of bovine skeletal α-actin gene. DNA and Cell Biology,1995,14(7):609-618
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8.Zakut R,et al. Nucleotide sequence of the rat skeletal muscle actin gene.nature,1982;298(26):857-859
9.philip B,et al. Clenbuterol prevents or inhibits loss of specific mRNAs in atrophying rat skeletal muscle.Am. J. Physiol,.1988;254(Cell Physiol.23):657-660
10.Robert C,et al. Effect of testosterone on muscle mass and muscle protein systhesis. J. Appl. Physiol.,1989;66(1):498-503
11.Donald B,et al. Stable incorporation of a bacterial gene into adult rat skeletal muscle in vivo.Am.J.Physiol.,1990;260(Cell Physiol.27):578-581
(1998.06.17收稿), 百拇医药
单位：赵中应 冯连世 宗丕芳 (国家体育总局体育科学研究所 (北京 100061))
关键词：理气扶正中药；疲劳；骨骼肌；α-肌动蛋白；表达
中国运动医学杂志980408 提要 为了探讨运动性疲劳过程中理气扶正中药作用的分子机理以及寻求安全有效的消除运动性疲劳的中药复方制剂，设计了强化训练导致疲劳的大鼠模型，用定量反转录聚合酶链式反应(Quantitative RTPCR)方法，研究了疲劳恢复过程中，大鼠骨骼肌α-肌动蛋白(α-actin)基因表达的变化。结果表明：所有运动施药组的表达均高于安静对照组，且强化训练恢复24小时组(E-24)、强化训练恢复48小时组(E—48)显著高于安静对照组。强化训练施药组较相应的强化训练非施药组均无明显差异。结果提示理气扶正中药在大鼠运动性疲劳恢复过程中对骨骼肌α-肌动蛋白基因表达的作用具有时效性
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Expression of α-actin in skeletal muscle during removing exercise-induced
muscle fatigue in rats by the Li-qi Fu-zhen Chinese medicine
Zhao Zhongying,Feng Lianshi,Zong Pifang
National Research Institute of Sports Science, Beijing 100061
In order to investigate the molecular mechanism of Li-qi Fu-zhen Chinese medicine during removing exercise-induced muscle fatigue and seek for an effective Chinese medicine compound dealing with exercise fatigue,an SD rat model of intensive training was constructed and the expression of α-actin of skeletal muscle during refreshine was studied by the quantitative RT-PCR(QRT-PCR). It shows that the expression level of all groups treated with the Chinese medicine is higher than that of rest control,and the expression after 24 and 48 hours from intensive training increases significantly than that from rest control.There is no-significant difference between the groups treated and non-treated with the Chinese medicine.These results suggest that a timing exists while Li-qi Fu-zhen Chinese medicine functions on expression of α-actin in skeletal muscle.
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Key words:Li-qi Fu-zhen Chinese medicine,fatigue,skeletal muscle,α-actin,expression
1 前言
用补脾中药消除运动疲劳已有诸多研究[1，2]。有些疏肝理气药物具有良好的改善肌肉能量代谢的作用，运用补益与疏理肝气和脾气的中药制剂可使损伤的肌纤维基本恢复正常，并纠正能量代谢的异常[1，2]。骨骼肌肌纤维的再生受多种因素的调节。α-肌动蛋白(α-actin),作为肌纤维的重要组成部分，其再生同样受多种因素的调节。近年来有不少学者指出肌肉生成决定因子(MDFs)是参与建立和维持骨骼肌细胞中肌肉生成策略的重要因素[3、4]。但骨骼肌中这些肌肉特异性的依赖于MDFs存在的启动子如何起作用尚不清楚。到目前为止，有关中药对运动性疲劳过程中骨骼肌α-肌动蛋白(α-actin)基因表达变化的研究尚未见报导。本文从分子生物学的角度研究理气扶正类中药制剂对骨骼肌α-肌动蛋白基因表达的影响，从而进一步弄清该中药制剂在肌纤维再生过程中作用的分子机理。
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2 材料与方法
2.1 实验对象：雄性SD大鼠110只(北京医科大学实验动物研究部提供)，体重160±20g。经过在电跑道上筛选后，将能跑的动物进行正规训练，留下10只作为安静对照组(C)，自由饮食、饮水，不运动。
2.2 训练方法：采用逐渐增强的方式进行跑台训练，坡度为0，每周5天，每天20分钟，每周一重复前周5的速度，周二、周三、周四逐日加量，达到本周要求的速度，周5重复。第1至第5周的每周末，分别达到15米/分、22米/分、27米/分、31米/分、35米/分的目标速度。训练动物于第5周末随机分为两大组。第一大组为强化训练，与安静对照组一样每日灌水；另一大组为强化训练+中药组，每日施药(安静对照组既不运动又不施药，且只取材1次)。这2大组都继续训练及延长时间达每日30分，于7周末将这两大组各分成3组，每组8—10只，按不同的时间点分别取材。取材各组为：安静对照组(C)；训练组(E)，包括强化训练安静组(ER)，强化训练运动即刻组(E-0)，强化训练恢复30分钟组(E-0.5)，强化训练恢复24小时组(E-24)，强化训练恢复48小时组(E-48)；运动施药组(EM)，包括强化训练加中药安静组(EMR)，强化训练+中药运动即刻组(EM-0)，强化训练+中药恢复30分钟组(EM=0.5)，强化训练+中药恢复24小时组(EM-24)，强化训练+中药恢复48小时组(EM-48)。
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2.3 取材：取股四头肌肌腹处组织置-80℃低温冰箱中保存备用。
2.4 定量：定量反转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)
2.4.1 总RNA的提取(异硫酸氰胍一步法)
取米粒大小的肌肉组织置1.5ml的无菌eppendorf管中，并用眼科剪将其剪碎，加入RNA裂解液(北京鼎国生物技术发展中心提供)200ul，室温放置10min后，加入100μl三氯甲烷，充分混匀，12，000 rpm离心10分钟，取上清液并向其中加入3倍体积的无水乙醇低温沉淀20min，12，000rpm离心10min,75%乙醇洗，空气干燥。
2.4.2 反转录及PCR反应
采用北京鼎国生物技术发展中心QRT-PCR试剂盒。经互联网搜索GENBANK中的α-肌动蛋白基因并用其中的Picker-3进行引物设计。内参照为400bp，截取的α-肌动蛋白为189bp。
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向得到的总RNA中加入15μl RT液，加入 1μl AMV，混匀，42℃保温30分钟。取5μl反应产物置500μl薄壁管中，加入20μl PCR液(内含内参照引物)及80ng上下游α-肌动蛋白引物，再加入1μl Taq酶及适量石蜡油。94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟，在PE480热循环仪上进行35个循环。取15μl产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳。结果用Pharmacia LKB UltroScan XL扫描仪作光密度扫描。
2.5 数据的统计学处理：每个数据代表α-肌动蛋白与内参照条带的灰度比，所有组数据一律采用X±SD表示，用SPSS软件进行独立样本t检验，显著性水平：p<0.05为显著差异，p<0.01为极显著差异
3 结果(见图1、表1)
图1 大鼠骨骼肌α-肌动蛋白QRT-PCR电泳结果
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Figure 1 The electrophoresis bands of rat α-actin in QRT-PCR
3.1 所有EM组与C组的比较：各组表达均高于C组的表达，并且EM—24组较C组有极显著的增加(P<0.01)，EM—48小时组较C组有显著的增加(P<0.05)，其它各施药组较C组无显著性增加(P>0.05)。
表1 大鼠骨骼肌α-肌动蛋白与内参照条带的灰度比结果
Tab.1 The ratio between intensities of bands corresponding to α-actin and internal reference of rat skeletal muscle 组别group
训练后安静组
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exercise
训练后即刻组
immediately after
exercise
训练后半小时
0.5hr after
exercise
训练后24小时
24 hrs after
exercise
训练后48小时
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48 hrs after
exercise
安静对照组
rest control
0.32±0.04
训练组
exercise
0.51±0.23*
0.52±0.05
0.66±0.23**
0.50±0.13
0.40±0.12
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训练施药组
exercise+
medicine
0.74±0.07
0.66±0.15
0.49±0.14
0.50±0.23**
0.60±0.12
*表示p<0.05，**表示p<0.01(与安静对照组比较)。*means p<0.05,**means p<0.01(comparison with rest control)
3.2 EM—0、EM—0.5、EM—24、EM—48组与EMR组的比较：只有EM—24组较EMR组有显著性降低(p<0.05)，其余各恢复组较EMR组均无显著性降低(p>0.05)。
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3.3 EM—0.5、EM—24、EM—48组与EM—0组的比较：各组均低于EM—0组，但无显著性差异(p>0.05)。
3.4 E组与相应EM组的比较：安静组、恢复即刻组、恢复48小时的EM组较相应的E组均有不同程度的升高，但均无显著性差别(p>0.05)，而恢复30分钟的EM组较相应的E组有非显著性降低(p>0.05)，恢复24小时EM与E组基本持平。
4 分析与讨论
有关中药在恢复体能和调节机体免疫力方面的作用已不容置疑。从中医理论角度，曾有人提出运动性疲劳的原因在于脾气运化失调的观点，并证实在运动时，当肌肉发生疲劳时，脾的运化失调，物质能量代谢系统出现代谢障碍。另外，脾的功能失调又可影响到肝，从而造成机体整体调节紊乱，导致运动性疲劳的发生。本研究 进一步从骨骼肌α-肌动蛋白的基因表达入手，探讨了理气扶正中药对疲劳中骨骼肌作用的分子机理。
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骨骼肌α-肌动蛋白是骨骼肌中一种重要的收缩蛋白，对维持骨骼肌的结构和功能起着至关重要的作用。许多收缩蛋白由小的多基因家族所编码，这些基因在心室、心房、平滑肌、快肌及慢肌中的差异性表达赋予不同的蛋白表型，它们的表达大多数是在转录水平上加以调控[5]。在哺乳动物中已鉴定出6种同工型肌动蛋白，包括2种非肌肉型肌动蛋白(β和γ)、2种平滑肌型肌动蛋白(γ小肠型和α血管型)以及2种横纹肌型肌动蛋白(α骨骼肌型和α心肌型)。它们的名称根据其表达的主要组织以及其等电点而确定，其中α、β及γ的等电点依次上升。其编码序列高度保守，但他们的非翻译区序列却变化较大。肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白(G-actin)，由375个氨基酸所组成，分子量为42KD。生物体中包含7个肌动蛋白基因，编码不同的肌动蛋白同功蛋白。它们含有较多的酸性氨基酸残基，等电点约为5.5，α-肌动蛋白的等电点最低(PI=5.4)[6]。α-肌动蛋白普遍存在于哺乳动物的各种细胞中，作为细胞骨架的主要成分之一，对维持细胞形态、产生细胞运动及细胞其他的生理功能发挥着重要作用。这在肌肉组织中表现得尤为突出，因为它与肌球蛋白一起，构成了肌肉收缩蛋白的主要成份。
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骨骼肌肌动蛋白的表达调控较为复杂，以哺乳动物为例，其骨骼肌的肌动蛋白基因含有多个转录因子的结合位点。例如CArG框，结合一种与血清反应因子(SRF)相同或相关的因子；再如E框，结合肌肉生成决定因子如MyoD和肌肉生成素；还有-CCGCCC-位点，结合转录因子Sp1[7]。目前克隆的肌动蛋白基因只有人、牛及少数啮齿类。大鼠骨骼肌α-肌动蛋白已由R.Zakut et al(1982)克隆并进行了核苷酸序列的测定[8]。它包括7个外显子和6个内含子，在5’非翻译区(UTR)有一个较大的内含子，编码区内部有5个较小的内含子。由其核苷酸序列推导的氨基酸序列与兔及牛骨骼肌111完全一致。在第161个核苷酸处存在一个Goldberg-Hogness框，通过S1核酸内切酶分析以后，发现该位点的下游第30个核苷酸处有转录起始点ACAC。从已得到的数据表明，尽管肌动蛋白氨基酸序列具有较强的保守性，但内含子的数目和位置变异很大，这些内含子是很多基因进化的源泉之一。
骨骼肌α-肌动蛋白的表达受多种药物的影响。Philip B et al[9]对去神经7天的大鼠施以双氯醇胺〔一种人工合成代谢药物〕，发现其可以完全阻止去神经比目鱼及腓肠肌α-肌动蛋白mRNA及细胞色素mRNA的下降，而对悬垂后肢的蛋白含量却无明显影响。但通过对正常雄性大鼠进行7天的双氯醇胺处理以后，发现其总肌肉蛋白合成速率上升了34%，并且腓肠肌体积增加了13%。这些数据表明双氯醇胺可以在萎缩成年大鼠骨骼肌中维持某些RNA的含量，但其机理尚不清楚。Robert et al[10]研究显示睾酮也能通过肌肉蛋白的合成来增加肌肉的体积，但这种蛋白合成的增加是由mRNA的合成增加所致还是其他调控因素在起作用尚不得知。本文的研究结果也显示理气扶正中药也可导致其中的3组运动施药组大鼠较相应的运动非施药组大鼠α肌动蛋白表达的非显著性增加，即安静组、恢复即刻组、恢复48小时的EM组较相应的E组均有不同程度的非显著性升高，分别提高45.1%、26.9%和50%，而恢复30分钟的EM组较相应的E组降低了34.7%，恢复24小时EM与E组基本持平。这说明理气扶正中药对骨骼肌α肌动蛋白表达的影响具有一定的时间性，且运动可能在其中起重要作用。恢复30分钟组表达的下降，这一方面可能是由于该时间段由于能量供给相对不足，RNA合成速率小于其降解速率，另一方面可能是中药本身在此时的不同作用所致。另外，从表1还可看出，所有运动施药组较安静对照组均有不同程度的增加，且恢复后24及48小时分别有极显著和显著的增加。这提示理气扶正中药影响α-肌动蛋白表达的最佳时间在运动恢复后的24小时左右，之后逐渐降低。mRNA在体内的含量是其分解与合成动态平衡的结果，理气扶正中药在运动性疲劳恢复过程中究竟是促进α-肌动蛋白mRNA的合成还是增加其稳定性还有待于进一步的研究。
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Donald B et al[11]成功地利用反转录病毒将大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因连同启动子导入大鼠损伤的骨骼组织并获得了稳定的表达。该技术将会使完整成年哺乳动物骨骼肌中肌肉特异的基因及其启动子表达的研究成为可能。此外，通过刺激干细胞增殖以使该反转录病毒介导的基因转移普遍使用于其他组织中。研究基因表达的经典方法大多以点杂交、Northern、S1核酸酶保护法为主。但这些方法大多频聚繁琐，且操作中的系统误差在所难免。本研究用一种新的分析基因表达的方法——定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,即RT-PCR)方法是当今定量分析基因表达的一种最为快速而又敏感的方法[13]，其敏感性高，特异性强，并且能够同时分析大量的样本。该技术的关键在于选择一个合适的内参照。本研究中截取了大鼠18SmRNA中5’端400bp的片段作为内参照。因为18SmRNA在细胞总mRNA中丰度最高，且表达相对较为稳定，是一种较为理想的内参照。该方法在前期处理中无须任何定量操作，2对引物在同一体系中扩增，避免了不同样本分别扩增时的产生的定量误差。但本方法也有不足之处，因为2对引物序列及扩增序列的不同可能会造成扩增效率的差异，这可能会带来一定的误差。另外，由于内参照模板的绝对量是未知的。故无法对目的基因进行绝对定量，而只能对其进行相对定量。
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总之，骨骼肌α-肌动蛋白合成的调节可能涉及多个水平的调节，如基因结构、转录、转录后、翻译、翻译后水平的调节等，这其中的每一个环节可受诸多因素的影响，摸索某一环节或几个环节中特定的影响因素，不仅可进一步弄清α-肌动蛋白表达的调控机制，而且也为合理的药物设计提供理论依据。
*本课题受国家自然科学基金重点课题No.39430140资助
参考文献
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3.Olson EN MyoD family:Aparadigm for development? Genes Dev,1990;4:1454-1461
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4.Weintraub H,et al.The MyoD gene family:Nodal point during specification of the muscle cell lineage.Science ,1991;251:761-766
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9.philip B,et al. Clenbuterol prevents or inhibits loss of specific mRNAs in atrophying rat skeletal muscle.Am. J. Physiol,.1988;254(Cell Physiol.23):657-660
10.Robert C,et al. Effect of testosterone on muscle mass and muscle protein systhesis. J. Appl. Physiol.,1989;66(1):498-503
11.Donald B,et al. Stable incorporation of a bacterial gene into adult rat skeletal muscle in vivo.Am.J.Physiol.,1990;260(Cell Physiol.27):578-581
(1998.06.17收稿), 百拇医药