银杏叶提取物对小鼠骨骼肌过氧化损伤的保护作用
作者：宫 霞 卢元芳
单位：宫 霞 卢元芳 (山东省曲阜师范大学生物系(273165))
关键词：银杏叶提取物；骨骼肌；自由基
中国运动医学杂志980422 提要 通过建立灌服银杏叶提取物小鼠的适量游泳和力竭游泳实验模型，测定了小鼠骨骼肌的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力和丙二醛(MDA)的水平。结果显示，灌服银杏叶提取物小鼠的SOD和GSH-Px的活力均显著高于各自的对照组，MDA的含量低于各自的对照组，说明服用银杏叶提取物可减轻运动所产生的内源性自由基对小鼠的伤害，表明银杏叶提取物具有较强的抗自由基损伤和抗脂质过氧化损伤的作用。
氧自由基反应和脂质过氧化反应在人体的新陈代谢中均起着重要作用。它们积极参与机体内许多正常的生理生化反应和免疫反应。体内的自由基保持在低浓度有利无害的动态平衡之中。现代科学研究表明，长时间有氧疲劳运动时，生物机体的代谢活动增强，需氧量急剧增加，氧化代谢的副产物自由基生成增多，抗氧化能力相对降低，脂质过氧化水平增高，造成运动能力下降，并对机体产生危害。因此，从天然物质中筛选高效无毒的自由基清除剂，成为运动医学的一个研究热点。国内外研究表明[1]，银杏叶提取物(EGb)是天然的抗氧化剂，可清除多种自由基，但把EGb用于运动训练方面的实验尚未见报导。本研究通过测定灌服EGb的小鼠适量游泳和力竭游泳后，其骨骼肌的SOD、GSH-Px、MDA水平的变化，探讨延缓运动疲劳的发生与恢复的途径。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
材料：昆明种雄性小鼠28只，体重26克左右，由中国科学院上海实验动物中心提供。
主要试剂：SOD测定试剂盒、GSH-Px测定试剂盒和MDA测定试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。冰醋酸为国产分析纯。考马斯亮蓝G250为FLuKa进口分装。
运动模型：将自由进食脱水混合饲料和普通自来水的无训练小鼠，随机分成服EGb组和未服EGb组，每组又分成适量游泳组和力竭游泳组两个亚组。服EGb组每天灌喂EGb稀释液1ml，未服EGb组每天灌喂生理盐水1ml，共灌喂15天。实验期间所有动物的进食和饮水如常。停止灌喂24小时后，进行运动测试。
运动方式：实验动物在桶式游泳池中(d=50cm)分组进行无负重游泳，水温28℃，水深为小鼠体长的3倍。适量游泳的小鼠游泳30分钟后取出；力竭游泳小鼠游泳至力竭，力竭时间95±10分，力竭判断标准按文献[2]。然后乙醚麻醉，剖腹取材。
, 百拇医药
骨骼肌匀浆的制备：除去肌肉表面的结缔组织，用4℃预冷的生理盐水洗净血液。用滤纸吸干后，迅速称重。然后加入4℃预冷的生理盐水，在组织研磨器中制成10%的匀浆备用。
EGb的制备及测定指标：EGb的制备，用醇—水提取法，并稀释成1mg/ml的浓度。SOD活力的测 定用黄嘌呤氧化法；GSH-Px活力的测定用DTNB法；MDA含量的测定用硫代巴比妥酸荧光法。
2 结果
SOD的活性见表1。表1表明，服EGb的适量游泳组和力竭游泳组小鼠骨骼肌SOD的活性都显著高于未服EGb的对照组。
表1 小鼠骨骼肌SOD的活性(
±S,Nu/ml prot.) 组别
适量游泳
, 百拇医药
力竭游泳
未服EGb组
266.88±134.79
114.7±57.65
服EGb组
563.01±40.88*
475.47±47.06**
与对照组比较：*p<0.001 **p<0.001
GSH-Px的活性见表2。表2表明，服EGb适量游泳组和力竭游泳组小鼠骨骼肌GSH-Px的活力均显著高于对照组。
表2 小鼠骨骼肌GSH-Px的活性(±S,U/ml prot.) 组别
, 百拇医药
适量游泳
力竭游泳
未服EGb组
53.56±16.64
43.41±17.83
服EGb组
101.08±7.57*
67.77±24.87**
与对照组比较：*p<0.001 **p<0.05
MDA的含量见表3。由表3可看出，服EGb适量游泳组小鼠骨骼肌中MDA的含量比对照组少，但不显著。这可能与运动强度、受试个体状况及取样时间有关。服EGb力竭游泳组和对照组相比，MDA的含量显著降低。
, 百拇医药
表3 小鼠骨骼肌MDA的含量(±S,nM/ml prot.) 组别
适量游泳
力竭游泳
未服EGb组
4.86±2.89
10.44±2.92
服EGb组
3.80±16.18*
7.63±11.25**
与对照组比较：*p>0.05 **p<0.05
, 百拇医药
3 讨论
本研究对力竭游泳组小鼠骨骼肌的抗氧化物酶活力和脂质过氧化水平测定结果表明，骨骼肌抗氧化物酶活性下降，脂质过氧化水平升高，自由基产生和清除的动态平衡失调，造成过氧化损伤。骨骼肌是机体内代谢旺盛的组织，力竭性游泳使肌组织能量需要剧增，耗氧增多，氧代谢的结果必然产生氧自由基。另一方面，局部组织缺氧及代谢产物的堆积，影响线粒体的氧化功能。同时，氧气大量消耗为氧的单电子还原提供了更多的机会，从而进一步激发自由基连锁反应，加速抗氧化物酶的消耗，致使抗氧化系统受损。过氧化脂质的大量生成，引起分子间连锁聚合，使膜流动性降低，通透性增加，必然影响肌细胞的电子传递和磷酸化过程，造成O2利用率下降，ATP合成减少，导致运动能力下降至衰竭。Davis[5]首次应用ESR技术直接测定了衰竭运动的大鼠肌肉匀浆中自由基信号，该信号增强了2～3倍。张蕴琨[4]等研究力竭性游泳的小鼠，脂质过氧化程度最严重的是骨骼肌组织。
, 百拇医药
银杏叶提取物(EGb)的主要活性成份银杏黄酮和银杏内脂，其分子结构中含有多个还原性羟基(-OH)功能基团[6，7]，可直接消除O2.、.OH、H2O2，捕捉脂质自由基、脂质过氧化自由基和烷自由基，等等。这些自由基起一种氢原子供体作用，能终止自由基连锁反应链，从而阻止和抑制氧自由基反应及脂质过氧化反应的运动性加剧，抑制MDA、共轭二烯等有毒物质的生成。同时，EGb还参与调节和提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活力[8，9]。本实验表明，服EGb的小鼠适量游泳或力竭游泳后，骨骼肌的抗氧化酶(SOD、GSH-Px)的活力与其对照比显著升高，而MDA的含量显著降低，从而减缓了SOD、GSH-Px的巯基(-SH)结构、DNA和其它蛋白的损伤，促使SOD、GSH-Px等抗氧化酶生成量增多，活性正常提高。
综上所述，EGb具有较强的抗氧化、抗自由基的作用，是一种良好的自由基清除剂，可防止和延缓运动性疲劳的产生，提高运动能力。
, 百拇医药
参考文献
1.陈修.银杏叶提取物的心脑血管的药理研究进展与启示.中国中西医结合杂志.1996，16(7)：388
2.Dawson CA,et al. Swimming in small laboratory animals.Med Sci Sports.1970;2(2):51-78
3.庄向平等.银杏叶黄酮含量的测定和提取方法.中草药.1992；23(8)：122—124
4.张蕴琨等.力竭性游泳对小鼠脑、肝、肌组织自由基代谢和血清CK、LDH活性的影响.中国运动医学杂志.1995；14(2)：69
5.Davis KJA,et al.Frcc radicals and tissue damagc produced by excrcise.Bioehem.Biophysics.Res.Communication.1982;107:1198-1205.
, http://www.100md.com
6.游松.银杏的化学及药理研究进展.沈阳药学院学报.1988；5(2)：142
7.Andreas IIasler,et al.Complex flavonol glycosides from the leaves of Ginkgo biloba.Phytochemistry. 1992;31(4):1391-1394
8.陈文为.自由基与中医中药.陈瑗、周玫主编.自由基医学.人民军医出版社.1991；354—468
9.句海松等.甘草类黄酮对脂质过氧化和活性氧处由基的作用.药学学报.1989；24(11)：807—812
(1998.06.08收稿)s
(1998.06.25修回), 百拇医药
单位：宫 霞 卢元芳 (山东省曲阜师范大学生物系(273165))
关键词：银杏叶提取物；骨骼肌；自由基
中国运动医学杂志980422 提要 通过建立灌服银杏叶提取物小鼠的适量游泳和力竭游泳实验模型，测定了小鼠骨骼肌的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力和丙二醛(MDA)的水平。结果显示，灌服银杏叶提取物小鼠的SOD和GSH-Px的活力均显著高于各自的对照组，MDA的含量低于各自的对照组，说明服用银杏叶提取物可减轻运动所产生的内源性自由基对小鼠的伤害，表明银杏叶提取物具有较强的抗自由基损伤和抗脂质过氧化损伤的作用。
氧自由基反应和脂质过氧化反应在人体的新陈代谢中均起着重要作用。它们积极参与机体内许多正常的生理生化反应和免疫反应。体内的自由基保持在低浓度有利无害的动态平衡之中。现代科学研究表明，长时间有氧疲劳运动时，生物机体的代谢活动增强，需氧量急剧增加，氧化代谢的副产物自由基生成增多，抗氧化能力相对降低，脂质过氧化水平增高，造成运动能力下降，并对机体产生危害。因此，从天然物质中筛选高效无毒的自由基清除剂，成为运动医学的一个研究热点。国内外研究表明[1]，银杏叶提取物(EGb)是天然的抗氧化剂，可清除多种自由基，但把EGb用于运动训练方面的实验尚未见报导。本研究通过测定灌服EGb的小鼠适量游泳和力竭游泳后，其骨骼肌的SOD、GSH-Px、MDA水平的变化，探讨延缓运动疲劳的发生与恢复的途径。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
材料：昆明种雄性小鼠28只，体重26克左右，由中国科学院上海实验动物中心提供。
主要试剂：SOD测定试剂盒、GSH-Px测定试剂盒和MDA测定试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。冰醋酸为国产分析纯。考马斯亮蓝G250为FLuKa进口分装。
运动模型：将自由进食脱水混合饲料和普通自来水的无训练小鼠，随机分成服EGb组和未服EGb组，每组又分成适量游泳组和力竭游泳组两个亚组。服EGb组每天灌喂EGb稀释液1ml，未服EGb组每天灌喂生理盐水1ml，共灌喂15天。实验期间所有动物的进食和饮水如常。停止灌喂24小时后，进行运动测试。
运动方式：实验动物在桶式游泳池中(d=50cm)分组进行无负重游泳，水温28℃，水深为小鼠体长的3倍。适量游泳的小鼠游泳30分钟后取出；力竭游泳小鼠游泳至力竭，力竭时间95±10分，力竭判断标准按文献[2]。然后乙醚麻醉，剖腹取材。
, 百拇医药
骨骼肌匀浆的制备：除去肌肉表面的结缔组织，用4℃预冷的生理盐水洗净血液。用滤纸吸干后，迅速称重。然后加入4℃预冷的生理盐水，在组织研磨器中制成10%的匀浆备用。
EGb的制备及测定指标：EGb的制备，用醇—水提取法，并稀释成1mg/ml的浓度。SOD活力的测 定用黄嘌呤氧化法；GSH-Px活力的测定用DTNB法；MDA含量的测定用硫代巴比妥酸荧光法。
2 结果
SOD的活性见表1。表1表明，服EGb的适量游泳组和力竭游泳组小鼠骨骼肌SOD的活性都显著高于未服EGb的对照组。
表1 小鼠骨骼肌SOD的活性(
±S,Nu/ml prot.) 组别适量游泳
, 百拇医药
力竭游泳
未服EGb组
266.88±134.79
114.7±57.65
服EGb组
563.01±40.88*
475.47±47.06**
与对照组比较：*p<0.001 **p<0.001
GSH-Px的活性见表2。表2表明，服EGb适量游泳组和力竭游泳组小鼠骨骼肌GSH-Px的活力均显著高于对照组。
表2 小鼠骨骼肌GSH-Px的活性(
±S,U/ml prot.) 组别, 百拇医药
适量游泳
力竭游泳
未服EGb组
53.56±16.64
43.41±17.83
服EGb组
101.08±7.57*
67.77±24.87**
与对照组比较：*p<0.001 **p<0.05
MDA的含量见表3。由表3可看出，服EGb适量游泳组小鼠骨骼肌中MDA的含量比对照组少，但不显著。这可能与运动强度、受试个体状况及取样时间有关。服EGb力竭游泳组和对照组相比，MDA的含量显著降低。
, 百拇医药
表3 小鼠骨骼肌MDA的含量(
±S,nM/ml prot.) 组别适量游泳
力竭游泳
未服EGb组
4.86±2.89
10.44±2.92
服EGb组
3.80±16.18*
7.63±11.25**
与对照组比较：*p>0.05 **p<0.05
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3 讨论
本研究对力竭游泳组小鼠骨骼肌的抗氧化物酶活力和脂质过氧化水平测定结果表明，骨骼肌抗氧化物酶活性下降，脂质过氧化水平升高，自由基产生和清除的动态平衡失调，造成过氧化损伤。骨骼肌是机体内代谢旺盛的组织，力竭性游泳使肌组织能量需要剧增，耗氧增多，氧代谢的结果必然产生氧自由基。另一方面，局部组织缺氧及代谢产物的堆积，影响线粒体的氧化功能。同时，氧气大量消耗为氧的单电子还原提供了更多的机会，从而进一步激发自由基连锁反应，加速抗氧化物酶的消耗，致使抗氧化系统受损。过氧化脂质的大量生成，引起分子间连锁聚合，使膜流动性降低，通透性增加，必然影响肌细胞的电子传递和磷酸化过程，造成O2利用率下降，ATP合成减少，导致运动能力下降至衰竭。Davis[5]首次应用ESR技术直接测定了衰竭运动的大鼠肌肉匀浆中自由基信号，该信号增强了2～3倍。张蕴琨[4]等研究力竭性游泳的小鼠，脂质过氧化程度最严重的是骨骼肌组织。
, 百拇医药
银杏叶提取物(EGb)的主要活性成份银杏黄酮和银杏内脂，其分子结构中含有多个还原性羟基(-OH)功能基团[6，7]，可直接消除O2.、.OH、H2O2，捕捉脂质自由基、脂质过氧化自由基和烷自由基，等等。这些自由基起一种氢原子供体作用，能终止自由基连锁反应链，从而阻止和抑制氧自由基反应及脂质过氧化反应的运动性加剧，抑制MDA、共轭二烯等有毒物质的生成。同时，EGb还参与调节和提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活力[8，9]。本实验表明，服EGb的小鼠适量游泳或力竭游泳后，骨骼肌的抗氧化酶(SOD、GSH-Px)的活力与其对照比显著升高，而MDA的含量显著降低，从而减缓了SOD、GSH-Px的巯基(-SH)结构、DNA和其它蛋白的损伤，促使SOD、GSH-Px等抗氧化酶生成量增多，活性正常提高。
综上所述，EGb具有较强的抗氧化、抗自由基的作用，是一种良好的自由基清除剂，可防止和延缓运动性疲劳的产生，提高运动能力。
, 百拇医药
参考文献
1.陈修.银杏叶提取物的心脑血管的药理研究进展与启示.中国中西医结合杂志.1996，16(7)：388
2.Dawson CA,et al. Swimming in small laboratory animals.Med Sci Sports.1970;2(2):51-78
3.庄向平等.银杏叶黄酮含量的测定和提取方法.中草药.1992；23(8)：122—124
4.张蕴琨等.力竭性游泳对小鼠脑、肝、肌组织自由基代谢和血清CK、LDH活性的影响.中国运动医学杂志.1995；14(2)：69
5.Davis KJA,et al.Frcc radicals and tissue damagc produced by excrcise.Bioehem.Biophysics.Res.Communication.1982;107:1198-1205.
, http://www.100md.com
6.游松.银杏的化学及药理研究进展.沈阳药学院学报.1988；5(2)：142
7.Andreas IIasler,et al.Complex flavonol glycosides from the leaves of Ginkgo biloba.Phytochemistry. 1992;31(4):1391-1394
8.陈文为.自由基与中医中药.陈瑗、周玫主编.自由基医学.人民军医出版社.1991；354—468
9.句海松等.甘草类黄酮对脂质过氧化和活性氧处由基的作用.药学学报.1989；24(11)：807—812
(1998.06.08收稿)s
(1998.06.25修回), 百拇医药