石蜡包埋肾肿瘤标本VHL基因突变研究
作者：杨志波 刘倩 任常山
单位：刘倩 基础医学院生物化学教研室；任常山 第一临床学院肿瘤研究所分子肿瘤研究室；杨志波 中国医科大学第二临床学院泌尿外科，沈阳 110003
关键词：肾透明细胞癌；石蜡包埋；VHL基因；突变
中国医科990519 摘要 目的：研究石蜡包埋肾肿瘤标本VHL基因突变情况。方法：采用PCR-SSCP银染法分析38例肾透明细胞癌、10例肾颗粒细胞癌、10例肾盂移行细胞癌、10例肾胚瘤VHL基因突变情况。结果：9例肾透明细胞癌VHL基因外显子2发生突变，突变率为23%，其他3种肾肿瘤均未发现VHL基因突变。结论：VHL基因突变与肾透明细胞癌的发生关系密切，PCR-SSCP方法检测VHL基因突变可用于VHL病及肾透明细胞癌的诊断。
Detection on Von Hippel-Lindau Gene Mutation in Paraffin-embedded Kidney Neoplasm
, http://www.100md.com
Yang Zhibo, Liu Qian, Ren Changshan
Department of Urology, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110003
ABSTRACT Objective:This paper was designed to detect von Hippel-Lindau (VHL) gene mutation in the paraffin-embedded renal carcinoma specimens. Methods： We detected the VHL gene mutation in the paraffin-embedded renal clear cell carcinoma (38 cases)，renal granular carcinoma (10 cases)，pelvic transitional cell carcinoma (10 cases) and renal Wilm's tumor (10 cases) using polymerase chain reaction-single strain conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis. Results:Mutation in exon 2 of VHL gene was found in 9 cases of renal clear cell carcinoma and no mutation in the other three kinds of kidney neoplasm. Conclusion:VHL gene mutation played an important role in the pathogenesis of renal clear cell carcinoma. PCR-SSCP analysis was of significance to diagnose the VHL disease and renal clear cell carcinoma.
, 百拇医药
KEY WORDS renal clear cell carcinoma; paraffin-embedded; von Hippel-Lindau gene; mutation
肾癌是常见的恶性肿瘤之一，其发生率为7.5例/10万人，占成人恶性肿瘤的3%左右。近年来出现不断增加趋势。其病因目前尚不清楚，有报道芳香族碳氢化合物、芳香胺、黄曲霉素、放射线和某些病毒可引起肾癌；有人认为烟草中二甲基亚硝基胺可导致肾癌；另外，职业接触，如镉也被认为可以增加肾癌发生的危险性。近年来，在分子生物学领域，关于肾癌研究取得了一定的进展，尤其对希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau, VHL)基因的研究引起了国外学者的广泛关注[1]。VHL基因位于3p25-26，目前VHL基因已被公认为抑癌基因。国外报道新鲜肾透明细胞癌标本该基因突变率为46%～70%[1～3]，而国内尚未见此方面研究。我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)，探讨利用石蜡包埋肾肿瘤标本研究VHL基因突变的可能性，为今后全面开展该方面研究工作打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料来源 本院病理室收集的手术切除、经常规福尔马林固定、石蜡包埋的肾透明细胞癌38例、肾颗粒细胞癌10例，肾盂移行细胞癌10例，肾胚瘤10例。所有患者均于1997～1999年在本院接受外科手术治疗，年龄33～68岁。全部标本均经常规切片，HE染色，并分别由两位病理专家确定标本病理类型。
1.2 DNA提取 每一标本取3张5 μm切片，放入Eppendorf管中，二甲苯脱蜡2次，之后，按常规酚-氯仿法提取DNA。紫外分光光度法测定DNA纯度及含量。
1.3 主要试剂 10×PCR缓冲液(含25 mmol/L MgCl2),dNTPs 250 mmol/L及TaqDNA聚合酶(均购自日本TAKARA公司)。
1.4 PCR扩增引物 为VHL基因第2外显子上的一对引物，上游引物序列为：5′-CGGTGTGGCTCTTTAACAACC-3′；下游引物序列为：5′-CAAGTGGGCTCTTTAACAACC-3′(引物为日本TAKARA公司合成)。其产物为224 bp的DNA片段。
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1.5 PCR-SSCP银染法 取基因组DNA约20 ng、1 μl 10×PCR缓冲液、dNTPs 25 mmol/L、PCR上游引物10 mmol/L、下游引物10 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 u、无菌去离子水加至10 μl。混匀、离心，40 μl矿物油覆盖，置PCR循环仪中。PCR扩增条件为94℃变性7 min后，94℃ 45 s、61℃ 1.5 min、72℃ 1.5 min，共40次循环，最后72℃延伸10 min。
扩增产物中加入40 μl变性示踪液，98℃变性10 min。冰中骤冷，取20 μl上样于含5%甘油的6%聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺：N′N′-双甲叉丙烯酰胺=59∶1)中，15℃、8 W电泳12 h。取出凝胶，进行硝酸银染色，干燥凝胶，观察结果。
2 结果
通过PCR将VHL基因第2外显子上的224 bp进行扩增，硝酸银染色结果显示：38例肾透明细胞癌中有9例发生VHL基因突变(泳动变位)，而10例肾颗粒细胞癌、10例肾盂移行细胞癌以及10例肾胚瘤均未见VHL基因突变(泳动变位)，见图1。
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图1 肾肿瘤VHL基因PCR-SSCP分析结果
1、3、5、7为肿瘤组织，分别为肾透明细胞癌、肾颗粒细胞癌、肾盂移行细胞癌和肾胚瘤。2、4、6、8为相应正常组织。1存在泳动变位
3 讨论
希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease, VHL)是一种显性遗传的肿瘤综合征，常见发生肿瘤有中枢神经系统和视网膜成血管细胞瘤、肾透明细胞癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞瘤和附睾囊肿等。其中肾透明细胞癌是该病最常见的死亡原因。近年来，随着对VHL病遗传病因学研究的深入使得位于染色体3p25-26区域的VHL基因克隆定位成功，VHL基因含3个外显子，由639个核苷酸组成的开放阅读框架编码213个氨基酸。研究发现该基因在VHL病家族成员中突变率达100%；另外，散发的肾透明细胞癌病人中VHL基因突变率为46%～70%，该基因高度甲基化而失活者为11%～19%[4，5]。VHL基因在肾脏其他病理类型肿瘤，如颗粒细胞癌以及其他脏器肿瘤，如胃癌、肺癌、结肠癌等均未发现VHL基因突变，VHL基因失活率之高，与肾透明细胞癌关系之密切，引起了国外学者的广泛关注。Shuin[3]等报告了VHL基因外显子2是突变聚集区域(mutation cluster region, MCR)。本文采用PCR-SSCP银染分析技术研究了38例肾透明细胞癌标本，发现VHL基因外显子2突变率为23%(9例)，稍低于欧美的研究结果(30%)[4，5]。本研究发现肾颗粒细胞癌、肾盂移行细胞癌、肾胚瘤均无VHL基因突变，这一结果与国外研究相一致。本文采用的PCR-SSCP银染分析技术具有快速、准确、灵敏、无核素放射性污染等特点。应用该方法进行VHL基因诊断有助于早期发现VHL病病人，并被有些学者用来进行肾透明细胞癌转移病灶的诊断。另外，VHL基因抑癌机制清楚，抑癌作用明显，而且VHL基因只有3个外显子，仅含639 bp，是基因治疗十分理想的目的基因。对VHL基因的研究将会为VHL病及肾透明细胞癌的早期诊断、治疗提供一条新的途径和广阔的应用前景。
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参考文献
1 Moch H, Schraml P, Bubendorf L, et al. Intratumoral hetergeneity of von Hippel-Lindau gene deletions in renal cell carcinoma detected by fluorescence in situ hybridization. Cancer Res, 1998,58:2304_2309
2 Bailly M, Bain C, Favrot MC, et al. Somatic mutations of von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene in European kidney cancers. Int J Cancer, 1995,63:660_664
3 Shuin T, Kondo S, Torigoe S, et al. Frequent somatic mutations and loss heterozygosity of renal cell carcinomas. Cancer Res, 1994,54:2852_2855
, 百拇医药
4 Stolle C, Glenn G, Zbar B, et al. Improved detection of germline mutations in the von Hippel-Lindau (VHL) disease tumor suppressor gene. Hum Mutat, 1998,12(6):417_423
5 Neumann HP, Bender BU, Berger DP, et al. Prevalence, morphology and biology of renal cell carcinoma in von Hippel-Lindau disease compared to sporadic renal cell carcinoma. J Urol, 1998,160(4):1248_1254
1999-05-20收稿, http://www.100md.com
单位：刘倩 基础医学院生物化学教研室；任常山 第一临床学院肿瘤研究所分子肿瘤研究室；杨志波 中国医科大学第二临床学院泌尿外科，沈阳 110003
关键词：肾透明细胞癌；石蜡包埋；VHL基因；突变
中国医科990519 摘要 目的：研究石蜡包埋肾肿瘤标本VHL基因突变情况。方法：采用PCR-SSCP银染法分析38例肾透明细胞癌、10例肾颗粒细胞癌、10例肾盂移行细胞癌、10例肾胚瘤VHL基因突变情况。结果：9例肾透明细胞癌VHL基因外显子2发生突变，突变率为23%，其他3种肾肿瘤均未发现VHL基因突变。结论：VHL基因突变与肾透明细胞癌的发生关系密切，PCR-SSCP方法检测VHL基因突变可用于VHL病及肾透明细胞癌的诊断。
Detection on Von Hippel-Lindau Gene Mutation in Paraffin-embedded Kidney Neoplasm
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Yang Zhibo, Liu Qian, Ren Changshan
Department of Urology, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110003
ABSTRACT Objective:This paper was designed to detect von Hippel-Lindau (VHL) gene mutation in the paraffin-embedded renal carcinoma specimens. Methods： We detected the VHL gene mutation in the paraffin-embedded renal clear cell carcinoma (38 cases)，renal granular carcinoma (10 cases)，pelvic transitional cell carcinoma (10 cases) and renal Wilm's tumor (10 cases) using polymerase chain reaction-single strain conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis. Results:Mutation in exon 2 of VHL gene was found in 9 cases of renal clear cell carcinoma and no mutation in the other three kinds of kidney neoplasm. Conclusion:VHL gene mutation played an important role in the pathogenesis of renal clear cell carcinoma. PCR-SSCP analysis was of significance to diagnose the VHL disease and renal clear cell carcinoma.
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KEY WORDS renal clear cell carcinoma; paraffin-embedded; von Hippel-Lindau gene; mutation
肾癌是常见的恶性肿瘤之一，其发生率为7.5例/10万人，占成人恶性肿瘤的3%左右。近年来出现不断增加趋势。其病因目前尚不清楚，有报道芳香族碳氢化合物、芳香胺、黄曲霉素、放射线和某些病毒可引起肾癌；有人认为烟草中二甲基亚硝基胺可导致肾癌；另外，职业接触，如镉也被认为可以增加肾癌发生的危险性。近年来，在分子生物学领域，关于肾癌研究取得了一定的进展，尤其对希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau, VHL)基因的研究引起了国外学者的广泛关注[1]。VHL基因位于3p25-26，目前VHL基因已被公认为抑癌基因。国外报道新鲜肾透明细胞癌标本该基因突变率为46%～70%[1～3]，而国内尚未见此方面研究。我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法(PCR-SSCP)，探讨利用石蜡包埋肾肿瘤标本研究VHL基因突变的可能性，为今后全面开展该方面研究工作打下基础。
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1 材料与方法
1.1 材料来源 本院病理室收集的手术切除、经常规福尔马林固定、石蜡包埋的肾透明细胞癌38例、肾颗粒细胞癌10例，肾盂移行细胞癌10例，肾胚瘤10例。所有患者均于1997～1999年在本院接受外科手术治疗，年龄33～68岁。全部标本均经常规切片，HE染色，并分别由两位病理专家确定标本病理类型。
1.2 DNA提取 每一标本取3张5 μm切片，放入Eppendorf管中，二甲苯脱蜡2次，之后，按常规酚-氯仿法提取DNA。紫外分光光度法测定DNA纯度及含量。
1.3 主要试剂 10×PCR缓冲液(含25 mmol/L MgCl2),dNTPs 250 mmol/L及TaqDNA聚合酶(均购自日本TAKARA公司)。
1.4 PCR扩增引物 为VHL基因第2外显子上的一对引物，上游引物序列为：5′-CGGTGTGGCTCTTTAACAACC-3′；下游引物序列为：5′-CAAGTGGGCTCTTTAACAACC-3′(引物为日本TAKARA公司合成)。其产物为224 bp的DNA片段。
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1.5 PCR-SSCP银染法 取基因组DNA约20 ng、1 μl 10×PCR缓冲液、dNTPs 25 mmol/L、PCR上游引物10 mmol/L、下游引物10 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 u、无菌去离子水加至10 μl。混匀、离心，40 μl矿物油覆盖，置PCR循环仪中。PCR扩增条件为94℃变性7 min后，94℃ 45 s、61℃ 1.5 min、72℃ 1.5 min，共40次循环，最后72℃延伸10 min。
扩增产物中加入40 μl变性示踪液，98℃变性10 min。冰中骤冷，取20 μl上样于含5%甘油的6%聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺：N′N′-双甲叉丙烯酰胺=59∶1)中，15℃、8 W电泳12 h。取出凝胶，进行硝酸银染色，干燥凝胶，观察结果。
2 结果
通过PCR将VHL基因第2外显子上的224 bp进行扩增，硝酸银染色结果显示：38例肾透明细胞癌中有9例发生VHL基因突变(泳动变位)，而10例肾颗粒细胞癌、10例肾盂移行细胞癌以及10例肾胚瘤均未见VHL基因突变(泳动变位)，见图1。
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图1 肾肿瘤VHL基因PCR-SSCP分析结果
1、3、5、7为肿瘤组织，分别为肾透明细胞癌、肾颗粒细胞癌、肾盂移行细胞癌和肾胚瘤。2、4、6、8为相应正常组织。1存在泳动变位
3 讨论
希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease, VHL)是一种显性遗传的肿瘤综合征，常见发生肿瘤有中枢神经系统和视网膜成血管细胞瘤、肾透明细胞癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞瘤和附睾囊肿等。其中肾透明细胞癌是该病最常见的死亡原因。近年来，随着对VHL病遗传病因学研究的深入使得位于染色体3p25-26区域的VHL基因克隆定位成功，VHL基因含3个外显子，由639个核苷酸组成的开放阅读框架编码213个氨基酸。研究发现该基因在VHL病家族成员中突变率达100%；另外，散发的肾透明细胞癌病人中VHL基因突变率为46%～70%，该基因高度甲基化而失活者为11%～19%[4，5]。VHL基因在肾脏其他病理类型肿瘤，如颗粒细胞癌以及其他脏器肿瘤，如胃癌、肺癌、结肠癌等均未发现VHL基因突变，VHL基因失活率之高，与肾透明细胞癌关系之密切，引起了国外学者的广泛关注。Shuin[3]等报告了VHL基因外显子2是突变聚集区域(mutation cluster region, MCR)。本文采用PCR-SSCP银染分析技术研究了38例肾透明细胞癌标本，发现VHL基因外显子2突变率为23%(9例)，稍低于欧美的研究结果(30%)[4，5]。本研究发现肾颗粒细胞癌、肾盂移行细胞癌、肾胚瘤均无VHL基因突变，这一结果与国外研究相一致。本文采用的PCR-SSCP银染分析技术具有快速、准确、灵敏、无核素放射性污染等特点。应用该方法进行VHL基因诊断有助于早期发现VHL病病人，并被有些学者用来进行肾透明细胞癌转移病灶的诊断。另外，VHL基因抑癌机制清楚，抑癌作用明显，而且VHL基因只有3个外显子，仅含639 bp，是基因治疗十分理想的目的基因。对VHL基因的研究将会为VHL病及肾透明细胞癌的早期诊断、治疗提供一条新的途径和广阔的应用前景。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Moch H, Schraml P, Bubendorf L, et al. Intratumoral hetergeneity of von Hippel-Lindau gene deletions in renal cell carcinoma detected by fluorescence in situ hybridization. Cancer Res, 1998,58:2304_2309
2 Bailly M, Bain C, Favrot MC, et al. Somatic mutations of von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene in European kidney cancers. Int J Cancer, 1995,63:660_664
3 Shuin T, Kondo S, Torigoe S, et al. Frequent somatic mutations and loss heterozygosity of renal cell carcinomas. Cancer Res, 1994,54:2852_2855
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4 Stolle C, Glenn G, Zbar B, et al. Improved detection of germline mutations in the von Hippel-Lindau (VHL) disease tumor suppressor gene. Hum Mutat, 1998,12(6):417_423
5 Neumann HP, Bender BU, Berger DP, et al. Prevalence, morphology and biology of renal cell carcinoma in von Hippel-Lindau disease compared to sporadic renal cell carcinoma. J Urol, 1998,160(4):1248_1254
1999-05-20收稿, http://www.100md.com