全脑缺血大鼠海马及血液血小板激活因子动态变化的研究
作者：张新江 王荣 杨金升 韩筱玉
单位：张新江 杨金升 韩筱玉(730050兰州军区总医院神经内科)；王荣(兰州军区药检所)
关键词：脑缺血；血小板激活因子
临床神经病学杂志000103 【摘要】 目的 研究血小板激活因子(PAF)在急性脑缺血过程中的作用。方法 用高效薄层层析法对大鼠全脑缺血后再灌注1、3、6、72小时血液、海马、大脑顶叶皮质的PAF进行了观察。结果 再灌注1小时后海马中PAF 含量较对照组明显升高(P<0.01),而3小时时则下降至正常水平(P>0.05)。血液中PAF的升高出现较晚,再灌注后3小时时血中PAF明显升高,6小时时最明显,72小时时与对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)。结论 脑缺血后海马PAF的变化快而短暂,早期血液中PAF可能主要来自脑组织,与血脑屏障破坏有关。提示PAF 参与了脑缺血早期的病理生理过程。
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Dynamic change on platelet activating factor in blood and hippocampus of rats global cerebral ischemia
Zhang Xinjiang,Wang Rong,Yang Jinsheng,et al
(Department of Neurology,Lanzhou General Hospital of PLA,Lanzhou 730050)
【Abstract】 Objective To investigate the role of platelet activating factor (PAF) in rats after acute cerebral ischemia.Methods After rat global cerebral ischemia and reperfusion for 1,3,6 and 72 h,Wistar rats were killed and the PAF in rats' blood,hippocampus and cerebral parietal lobe cortex was measured with high performance thin-layer chromatography.Results after reperfusion for 1 h PAF in hippocampus was significantly higher than the controls(Ρ<0.01),and it decreased to the normal level at 3 h (P>0.05).The elevation of PAF in blood showed later,after reperfusion for 3 h it was significantly higher than the controls,and it was most remarkable at 6 h.There was remarkable difference between 72 h and the controls(P<0.05).Conclusion The change of hippocampus PAF was quick and short after cerebral ischemia.PAF in blood of early stage might come from brain tissue,and related to the destruction of the blood-brain barrier.The study suggested that PAF might play an important role in the pathophysiologic course on early stage of cerebral ischemia.
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【Key words】Cerebral ischemia Platelet activating factor
血小板激活因子(PAF)是目前发现的最强的血小板聚集物,可能参与了脑缺血的病理过程[1]。为了解PAF在脑缺血过程中的作用,本研究用高效薄层层析法对全脑缺血大鼠脑组织和血液PAF予以检测,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 30只雄性Wistar大鼠购自兰州医学院动物实验中心,体重250～300 g,随机分为缺血后再灌注1、3、6、72小时和假手术组,每组各6只。
1.2 方法
1.2.1 动物模型及标本处理 按Pulsinelli[2]法制成全脑缺血模型。脑缺血再灌注组动物处理如下:用硫喷妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉, 烧灼双侧椎动脉后颈部正中切口分离双侧颈总动脉,置线备用。次日,在动物清醒状态下夹闭双侧颈总动脉10分钟,打开动脉夹为再灌注开始。假手术组不烧灼双侧椎动脉,不夹闭双侧颈总动脉,其余步骤同再灌注组。分别在不同时期断头取血,EDTA-Na2抗凝,立即吸取全血2 ml,注入已盛有10 ml甲醇溶液的小瓶内,振摇,离心后取上清液,按Bligh-Dyer法萃取。取氯仿相密封后-30℃冻存。同时,于冰盘内分离海马、顶叶皮质,称重后用反应终止液(甲醇∶Tris缓冲液∶醋酸溶液=5∶1∶0.04)制成1%脑匀浆液,振摇后离心,取上清液,此后处理同血液标本。
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1.2.2 试剂及仪器 PAF标准品购自Sigma公司,磷酸钼、氯仿、甲醇均为分析醇,高效薄层板购自青岛海洋化工厂,津岛CS-920型薄层扫描仪。
1.2.3 检测方法 参考李慧萍等[3]的方法将萃取后的氯仿标本用真空抽干,再用氯仿溶解,高效板点样,同板有PAF标准品同行,氯仿∶甲醇∶水=65∶35∶1为展开剂,10%磷钼酸显色,630 nm波长下扫描,测定峰面积,PAF的Rf值为0.23～0.26,在标准品工作曲线上查得样品PAF含量。
1.2.4 统计学方法 方差分析。
2 结果
脑缺血大鼠血液、海马、大脑皮质PAF含量的动态变化,见表1。
表1 脑缺血大鼠海马、皮质、血液PAF的动态变化(
±s)
, 百拇医药
海马
(μg/g组织)
皮质
(μg/g组织)
血液
(μg/L)
对 照 组
33.38±5.60
16.70±6.34
1.05±0.31
缺血1小时组
57.57±15.53Δ
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14.94±4.28
1.01±0.20
缺血3小时组
33.07±13.81
17.23±8.72
1.61±0.56*
缺血6小时组
41.50±17.86
15.23±7.24
1.90±0.61Δ
缺血72小时组
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33.00±12.14
18.33±9.05
1.46±0.31*
与对照组比较*P<0.05,ΔP<0.01
由表1可以看出,缺血再灌注1小时时海马中PAF含量较对照组明显升高(P<0.01),但3小时时及以后各组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。各组之间顶叶皮质PAF含量无明显差异(均P>0.05)。血液中PAF含量在3小时时较对照组及1小时组均明显升高(均P<0.05),6小时时升高更明显,与对照组、1小时组比较均P<0.01,3、6、72小时各组间比较P>0.05,72小时组与1小时及对照组比较均P<0.05。
3 讨论
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血小板激活因子是一种磷脂介质,具有广泛的生物学活性。近年来PAF与脑缺血的关系受到重视[1]。由于血液、组织中含有PAF乙酰水解酶, 可使PAF迅速水解,因此血液和组织中PAF较难捕捉。为此,我们将标本立即置于酸性甲醇溶液内,可迅速灭活PAF乙酰水解酶, 同时高效薄层层析技术可纯化PAF,使各组数据更具有可比性。
观察本组资料发现在脑缺血再灌注1小时时海马中PAF有一过性增高,而3小时后则基本恢复正常,提示脑缺血后PAF的变化极其短暂,与Nishida等[4]的结果相似。众所周知,短暂性脑缺血大鼠不同脑区对缺血的敏感程度不同,以海马神经元的病理损害最严重[5],而脑缺血再灌注过程中海马中PAF升高最明显[4],因此,脑组织内PAF含量在一定程度上能反映脑缺血性损害的严重程度。本研究未观察到大脑皮质PAF含量的显著性变化,可能与皮质对缺血性损害的反应程度不及海马明显有关。本研究还发现血液中PAF的变化较脑组织为晚,但持续时间较长。再灌注后3小时时大鼠血液中PAF含量才开始升高,6小时时含量似乎更高,但较3小时时无明显差异(P>0.05),72小时时仍高于对照组(P<0.05)。基础研究表明,神经细胞、血管内皮细胞、血小板及中性白细胞等在缺氧、钙离子、白介素的刺激作用下均可释放PAF[6、7]。由于大鼠脑组织内PAF的变化发生在血液PAF变化之前, 推测脑缺血早期血液中的PAF可能来自脑组织,与血脑屏障的破坏有关,但未观察到血液PAF含量与脑组织内PAF含量有明确相关性,可能与二者的变化不同步有关。缺血的神经组织产生大量PAF的机理尚不清楚,可能与磷脂酶A2的激活、大量花生四烯酸的形成有关[8]。本研究发现72小时时血液PAF含量仍高于正常,这与临床对脑梗死患者血液PAF的观察相吻合[9]。而动物脑组织内PAF在脑缺血3小时后即降至正常,因此推测脑缺血后期血液中的PAF可能来自受损的血管内皮细胞、血小板、中性白细胞等[7,9]。PAF可通过以下几个方面参与脑缺血的病理损伤[1,7,8,10]:(1) 激活血小板。PAF是目前发现的最强的血小板聚集剂,可使局部发生微血栓、血流动力学改变。(2) 使脑血流量减少。直接收缩脑血管或作用于颗粒白细胞,使其释放白三烯,进而介导脑血管收缩,也可通过破坏脑血流的自动调节作用而使脑血流量减少。(3) 直接损害神经细胞。(4) 促使癌基因、白介素1和白介素4的表达。(5) 破坏血脑屏障。可能与PAF作用于血管内皮细胞、中性和嗜酸性粒细胞有关。
, 百拇医药
总之,脑缺血后神经组织内PAF的变化极为短暂,而血液中PAF含量增高发生较晚,但持续时间较长,推测缺血早期血液中的PAF主要来自缺血神经元,由于PAF可激活血小板、促使中性白细胞浸润、加重血管内皮损害,而这些细胞又可产生PAF,从而维持了血液中PAF的较高浓度,形成恶性循环。有资料[8]证实：PAF受体拮抗剂可明显减轻脑缺血性损害程度,也支持PAF参与了脑缺血的发病过程,但其具体作用机理有待进一步研究。
参 考 文 献
1，Lindsberg PJ,Yue TL,Frerichs KU,et al.Evidence for PAF as a novel mediator in experimental stroke in rabits.Stroke,1990,21:1452
2，Pulsinelli WA,Brierley JB,Plum F.Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forbrain ischemia.Ann Neurol,1982,11:491
, http://www.100md.com
3，李慧萍,张瑞强,张劲农.高效薄层层析法检测人血液中血小板激活因子.上海医学检验杂志,1992,7:137
4，Nishida K,Markey SP.Platelet-activating factor in brain regions after transcent ischemia in gerbils.Stroke,1996,27:514
5，Smith ML,Auer RN,Siesjo BK.The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of for brain ischemia.Acta Neuropathol,1984,64:319
6，Francescangeli E,Goracci G.The denovo biosynthesis of platelet-activating factor in rat brain.Biochem Biophys Res Commun,1989,161:107
, 百拇医药
7，Lewis MS,Ralph E,Whatley K,et al.Hydrogen peroxide stimulates the synthesis of PAF by endothelium and induce endothelial cell-dependent neutrophil adhesion.J Clin Invest,1988,82:2045
8，Panetta J,Marcheselli VL,Braquet P,et al.Effection of platelet activating antagonist(BN 52021) on free fatty acids,diacylglycerols,polyphosphoinositiales and blood flow in the gerbil:Inhibition of ischemia-reperfusion induced cerebral injury.Biochem Bioplys Res Commun,1987,149:580
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9，Sator KI,Maizumi T,Troshida H,et al.Increased levels of blood PAF and PAF-like lipids in patients with ischemic stroke.Acta Neurol Scan,1992,85:122
10，Dubois C,Bissonnetle E,Rola-Pleszcynski M.Platelet-activating factor enhances tumor necrosis factor production byalveolar macrophages:prevention by PAF receptor antagonists and lipoxygenase inhibitors.J Immunol,1989,143:964
收稿1998-07-08 修回1999-01-04, 百拇医药
单位：张新江 杨金升 韩筱玉(730050兰州军区总医院神经内科)；王荣(兰州军区药检所)
关键词：脑缺血；血小板激活因子
临床神经病学杂志000103 【摘要】 目的 研究血小板激活因子(PAF)在急性脑缺血过程中的作用。方法 用高效薄层层析法对大鼠全脑缺血后再灌注1、3、6、72小时血液、海马、大脑顶叶皮质的PAF进行了观察。结果 再灌注1小时后海马中PAF 含量较对照组明显升高(P<0.01),而3小时时则下降至正常水平(P>0.05)。血液中PAF的升高出现较晚,再灌注后3小时时血中PAF明显升高,6小时时最明显,72小时时与对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)。结论 脑缺血后海马PAF的变化快而短暂,早期血液中PAF可能主要来自脑组织,与血脑屏障破坏有关。提示PAF 参与了脑缺血早期的病理生理过程。
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Dynamic change on platelet activating factor in blood and hippocampus of rats global cerebral ischemia
Zhang Xinjiang,Wang Rong,Yang Jinsheng,et al
(Department of Neurology,Lanzhou General Hospital of PLA,Lanzhou 730050)
【Abstract】 Objective To investigate the role of platelet activating factor (PAF) in rats after acute cerebral ischemia.Methods After rat global cerebral ischemia and reperfusion for 1,3,6 and 72 h,Wistar rats were killed and the PAF in rats' blood,hippocampus and cerebral parietal lobe cortex was measured with high performance thin-layer chromatography.Results after reperfusion for 1 h PAF in hippocampus was significantly higher than the controls(Ρ<0.01),and it decreased to the normal level at 3 h (P>0.05).The elevation of PAF in blood showed later,after reperfusion for 3 h it was significantly higher than the controls,and it was most remarkable at 6 h.There was remarkable difference between 72 h and the controls(P<0.05).Conclusion The change of hippocampus PAF was quick and short after cerebral ischemia.PAF in blood of early stage might come from brain tissue,and related to the destruction of the blood-brain barrier.The study suggested that PAF might play an important role in the pathophysiologic course on early stage of cerebral ischemia.
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【Key words】Cerebral ischemia Platelet activating factor
血小板激活因子(PAF)是目前发现的最强的血小板聚集物,可能参与了脑缺血的病理过程[1]。为了解PAF在脑缺血过程中的作用,本研究用高效薄层层析法对全脑缺血大鼠脑组织和血液PAF予以检测,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 30只雄性Wistar大鼠购自兰州医学院动物实验中心,体重250～300 g,随机分为缺血后再灌注1、3、6、72小时和假手术组,每组各6只。
1.2 方法
1.2.1 动物模型及标本处理 按Pulsinelli[2]法制成全脑缺血模型。脑缺血再灌注组动物处理如下:用硫喷妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉, 烧灼双侧椎动脉后颈部正中切口分离双侧颈总动脉,置线备用。次日,在动物清醒状态下夹闭双侧颈总动脉10分钟,打开动脉夹为再灌注开始。假手术组不烧灼双侧椎动脉,不夹闭双侧颈总动脉,其余步骤同再灌注组。分别在不同时期断头取血,EDTA-Na2抗凝,立即吸取全血2 ml,注入已盛有10 ml甲醇溶液的小瓶内,振摇,离心后取上清液,按Bligh-Dyer法萃取。取氯仿相密封后-30℃冻存。同时,于冰盘内分离海马、顶叶皮质,称重后用反应终止液(甲醇∶Tris缓冲液∶醋酸溶液=5∶1∶0.04)制成1%脑匀浆液,振摇后离心,取上清液,此后处理同血液标本。
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1.2.2 试剂及仪器 PAF标准品购自Sigma公司,磷酸钼、氯仿、甲醇均为分析醇,高效薄层板购自青岛海洋化工厂,津岛CS-920型薄层扫描仪。
1.2.3 检测方法 参考李慧萍等[3]的方法将萃取后的氯仿标本用真空抽干,再用氯仿溶解,高效板点样,同板有PAF标准品同行,氯仿∶甲醇∶水=65∶35∶1为展开剂,10%磷钼酸显色,630 nm波长下扫描,测定峰面积,PAF的Rf值为0.23～0.26,在标准品工作曲线上查得样品PAF含量。
1.2.4 统计学方法 方差分析。
2 结果
脑缺血大鼠血液、海马、大脑皮质PAF含量的动态变化,见表1。
表1 脑缺血大鼠海马、皮质、血液PAF的动态变化(
±s), 百拇医药
海马
(μg/g组织)
皮质
(μg/g组织)
血液
(μg/L)
对 照 组
33.38±5.60
16.70±6.34
1.05±0.31
缺血1小时组
57.57±15.53Δ
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14.94±4.28
1.01±0.20
缺血3小时组
33.07±13.81
17.23±8.72
1.61±0.56*
缺血6小时组
41.50±17.86
15.23±7.24
1.90±0.61Δ
缺血72小时组
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33.00±12.14
18.33±9.05
1.46±0.31*
与对照组比较*P<0.05,ΔP<0.01
由表1可以看出,缺血再灌注1小时时海马中PAF含量较对照组明显升高(P<0.01),但3小时时及以后各组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。各组之间顶叶皮质PAF含量无明显差异(均P>0.05)。血液中PAF含量在3小时时较对照组及1小时组均明显升高(均P<0.05),6小时时升高更明显,与对照组、1小时组比较均P<0.01,3、6、72小时各组间比较P>0.05,72小时组与1小时及对照组比较均P<0.05。
3 讨论
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血小板激活因子是一种磷脂介质,具有广泛的生物学活性。近年来PAF与脑缺血的关系受到重视[1]。由于血液、组织中含有PAF乙酰水解酶, 可使PAF迅速水解,因此血液和组织中PAF较难捕捉。为此,我们将标本立即置于酸性甲醇溶液内,可迅速灭活PAF乙酰水解酶, 同时高效薄层层析技术可纯化PAF,使各组数据更具有可比性。
观察本组资料发现在脑缺血再灌注1小时时海马中PAF有一过性增高,而3小时后则基本恢复正常,提示脑缺血后PAF的变化极其短暂,与Nishida等[4]的结果相似。众所周知,短暂性脑缺血大鼠不同脑区对缺血的敏感程度不同,以海马神经元的病理损害最严重[5],而脑缺血再灌注过程中海马中PAF升高最明显[4],因此,脑组织内PAF含量在一定程度上能反映脑缺血性损害的严重程度。本研究未观察到大脑皮质PAF含量的显著性变化,可能与皮质对缺血性损害的反应程度不及海马明显有关。本研究还发现血液中PAF的变化较脑组织为晚,但持续时间较长。再灌注后3小时时大鼠血液中PAF含量才开始升高,6小时时含量似乎更高,但较3小时时无明显差异(P>0.05),72小时时仍高于对照组(P<0.05)。基础研究表明,神经细胞、血管内皮细胞、血小板及中性白细胞等在缺氧、钙离子、白介素的刺激作用下均可释放PAF[6、7]。由于大鼠脑组织内PAF的变化发生在血液PAF变化之前, 推测脑缺血早期血液中的PAF可能来自脑组织,与血脑屏障的破坏有关,但未观察到血液PAF含量与脑组织内PAF含量有明确相关性,可能与二者的变化不同步有关。缺血的神经组织产生大量PAF的机理尚不清楚,可能与磷脂酶A2的激活、大量花生四烯酸的形成有关[8]。本研究发现72小时时血液PAF含量仍高于正常,这与临床对脑梗死患者血液PAF的观察相吻合[9]。而动物脑组织内PAF在脑缺血3小时后即降至正常,因此推测脑缺血后期血液中的PAF可能来自受损的血管内皮细胞、血小板、中性白细胞等[7,9]。PAF可通过以下几个方面参与脑缺血的病理损伤[1,7,8,10]:(1) 激活血小板。PAF是目前发现的最强的血小板聚集剂,可使局部发生微血栓、血流动力学改变。(2) 使脑血流量减少。直接收缩脑血管或作用于颗粒白细胞,使其释放白三烯,进而介导脑血管收缩,也可通过破坏脑血流的自动调节作用而使脑血流量减少。(3) 直接损害神经细胞。(4) 促使癌基因、白介素1和白介素4的表达。(5) 破坏血脑屏障。可能与PAF作用于血管内皮细胞、中性和嗜酸性粒细胞有关。
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总之,脑缺血后神经组织内PAF的变化极为短暂,而血液中PAF含量增高发生较晚,但持续时间较长,推测缺血早期血液中的PAF主要来自缺血神经元,由于PAF可激活血小板、促使中性白细胞浸润、加重血管内皮损害,而这些细胞又可产生PAF,从而维持了血液中PAF的较高浓度,形成恶性循环。有资料[8]证实：PAF受体拮抗剂可明显减轻脑缺血性损害程度,也支持PAF参与了脑缺血的发病过程,但其具体作用机理有待进一步研究。
参 考 文 献
1，Lindsberg PJ,Yue TL,Frerichs KU,et al.Evidence for PAF as a novel mediator in experimental stroke in rabits.Stroke,1990,21:1452
2，Pulsinelli WA,Brierley JB,Plum F.Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forbrain ischemia.Ann Neurol,1982,11:491
, http://www.100md.com
3，李慧萍,张瑞强,张劲农.高效薄层层析法检测人血液中血小板激活因子.上海医学检验杂志,1992,7:137
4，Nishida K,Markey SP.Platelet-activating factor in brain regions after transcent ischemia in gerbils.Stroke,1996,27:514
5，Smith ML,Auer RN,Siesjo BK.The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of for brain ischemia.Acta Neuropathol,1984,64:319
6，Francescangeli E,Goracci G.The denovo biosynthesis of platelet-activating factor in rat brain.Biochem Biophys Res Commun,1989,161:107
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7，Lewis MS,Ralph E,Whatley K,et al.Hydrogen peroxide stimulates the synthesis of PAF by endothelium and induce endothelial cell-dependent neutrophil adhesion.J Clin Invest,1988,82:2045
8，Panetta J,Marcheselli VL,Braquet P,et al.Effection of platelet activating antagonist(BN 52021) on free fatty acids,diacylglycerols,polyphosphoinositiales and blood flow in the gerbil:Inhibition of ischemia-reperfusion induced cerebral injury.Biochem Bioplys Res Commun,1987,149:580
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9，Sator KI,Maizumi T,Troshida H,et al.Increased levels of blood PAF and PAF-like lipids in patients with ischemic stroke.Acta Neurol Scan,1992,85:122
10，Dubois C,Bissonnetle E,Rola-Pleszcynski M.Platelet-activating factor enhances tumor necrosis factor production byalveolar macrophages:prevention by PAF receptor antagonists and lipoxygenase inhibitors.J Immunol,1989,143:964
收稿1998-07-08 修回1999-01-04, 百拇医药