高效毛细管电泳法测定肌苷注射液含量
作者：刘莉 张国栋
单位：刘莉(江苏徐州市药品检验所 徐州 221006)；张国栋(北京医科大学分析化学教研室 北京 100083)
关键词：
药物分析杂志000333 肌苷为辅酶类药物，它能参与体内能量代谢及蛋白质的合成，具有提高各种酶(特别是辅酶A)的活性及改善机体代谢作用。其注射液加苯甲酸钠作助溶剂，不能直接用紫外分光光度法测肌苷含量，部颁标准采用纸层析-紫外分光光度法[1]测定含量，操作复杂，费时，且重现性差。文献报道有HPLC法[2]、差示分光光度法[3]、旋光度法[4]、比色法[5]和转换曲线分光光度法[6]测定肌苷注射液含量。本文选用合适内标，采用高效毛细管电泳法同时测定肌苷和苯甲酸钠的含量，该法操作简单、快速，结果准确。
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1 仪器与试药
CE-232型毛细管电泳仪(北京大学化学系)，岛津UV-260分光光度计，肌苷(纯度为99.9%)、苯甲酸钠(纯度为99.5%)对照品均由淮阴和平生物化工厂提供；对氨基苯甲酸(内标)为中国药品生物制品检定所发对照品；肌苷注射液(北京永康制药厂，批号：990315，981026，980814，规格：100 mg∶2 mL);其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
2 测定条件
未涂层石英毛细管柱(75 μm×39 cm)，有效长度30 cm，河北永年光导纤维厂；柱温20 ℃；检测波长254 nm；运行缓冲液：20 mmol.L-1硼酸钠溶液-20 mmol.L-1磷酸缓冲液(36∶64,pH=6.1)；进样：压力进样10 s，运行电压15 kV；运行缓冲液和供试液均需经0.45 μm微孔滤膜过滤后使用；每次进样前分别用0.1 mmol.L-1氢氧化钠溶液，运行缓冲液各冲洗2 min。
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3 溶液的配制
3.1 对照品贮备液的配制 精密称取对照品肌苷100 mg，苯甲酸钠100.7 mg，置100 mL量瓶中加水适量，超声溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.2 内标贮备液的配制 精密称取对氨基苯甲酸21.6 mg, 置50 mL量瓶中加水适量，超声溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.3 样品贮备液的配制 精密量取肌苷注射液1 mL置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
4 方法与结果
4.1 标准曲线与线性范围 精密量取对照品贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，各加内标贮备液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀。分别进样测定峰面积。每一标准液进样5次，测定峰面积，取平均值。以对照品与内标的峰面积比为纵坐标，相应对照品浓度(mg.mL-1)为横坐标，进行线性回归。肌苷和苯甲酸钠的回归方程分别为：
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Y＝4.668 9C+0.206 1 r=0.999 5
Y＝13.329 0C+0.473 6 r=0.999 7
定量线性范围均为0.1～0.5 mg.mL-1。
4.2 回收率实验 精密量取对照品贮备液1.5 mL和已测得含量的样品贮备液1.5 mL，再加内标贮备液1 mL，置10 mL量瓶中用水稀释至刻度，摇匀。进样测定5份，结果表明：肌苷及苯甲酸钠的平均回收率分别为100.9%(RSD为1.6%)和99.3%(RSD为1.2%),n=5。
4.3 样品测定 精密量取样品贮备液3 mL置10 mL量瓶中，加内标贮备液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀。进样5次。典型电泳图见图1。测得峰面积与内标峰面积之比的平均值代入标准曲线方程，计算肌苷的百分标示含量与苯甲酸钠的百分含量。同时与部颁标准法[1]比较，结果基本一致。见表1。
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图1 肌苷注射液的电泳分离图
1.肌苷 2.对氨基苯甲酸 3.苯甲酸钠
表1 样品含量测定结果(%,n=5)
毛细管电泳法
部颁标准法
样品
肌苷
苯甲酸钠
肌苷
990315
93.5 (1.4)
4.407(0.9)
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93.1(2.4)
981026
95.1 (1.2)
4.361(1.1)
95.3(1.8)
980814
94.6 (0.9)
4.526 (1.3)
94.0(2.1)
注：括号内为RSD(%)
5 讨论
5.1 缓冲液pH的选择 在pH 4.5～7.0 范围内考察了肌苷和苯甲酸钠电泳的分离情况。当pH>6.1时，峰形随pH升高而前伸；pH<6.1时，峰形随pH降低而拖尾；pH=6.1时各峰峰形好，且分离度合适。故选pH=6.1。
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5.2 内标的选择 对安替比林、对乙酰氨基酚、对氨基苯甲酸电泳行为进行了考察，发现在本文条件下，安替比林、对乙酰氨基酚与肌苷不能达到基线分离，只有对氨基苯甲酸的迁移率介于组分峰之间，样品测定无干扰，且峰形良好，故选择对氨基苯甲酸作为内标。
5.3 运行电压的选择 升高运行电压可以加快分析速度，一定范围内提高电泳分离效能，实验中比较了运行电压8～19 kV范围内各组分的迁移时间和分离效能的变化规律，最终选择了15 kV运行电压不仅有高柱效，而且大大缩短分析时间。
参考文献
1，卫生部药品标准.生化药品(第一册).1989. 8
2，王董民，王晓琼.高效液相色谱法测定肌苷注射液中肌苷和苯甲酸钠的含量.药物分析杂志，1993，13(5)：331
3，陈炜.差示分光光度法测定肌苷注射液含量.药物分析杂志，1993，13(1)：42
4，洪煜.旋光度法测定肌苷注射液的含量.药物分析杂志，1994，14(4)：55
5，代勇.肌苷注射液的比色法测定.中国医药工业杂志，1994，25(5)：224
6，董亚琳，魏友霞，马玉英等.转换曲线分光光度法测定肌苷注射液含量.中国医院药学杂志，1998，18(10)：461
(本文于2000年3月17日修改回), 百拇医药
单位：刘莉(江苏徐州市药品检验所 徐州 221006)；张国栋(北京医科大学分析化学教研室 北京 100083)
关键词：
药物分析杂志000333 肌苷为辅酶类药物，它能参与体内能量代谢及蛋白质的合成，具有提高各种酶(特别是辅酶A)的活性及改善机体代谢作用。其注射液加苯甲酸钠作助溶剂，不能直接用紫外分光光度法测肌苷含量，部颁标准采用纸层析-紫外分光光度法[1]测定含量，操作复杂，费时，且重现性差。文献报道有HPLC法[2]、差示分光光度法[3]、旋光度法[4]、比色法[5]和转换曲线分光光度法[6]测定肌苷注射液含量。本文选用合适内标，采用高效毛细管电泳法同时测定肌苷和苯甲酸钠的含量，该法操作简单、快速，结果准确。
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1 仪器与试药
CE-232型毛细管电泳仪(北京大学化学系)，岛津UV-260分光光度计，肌苷(纯度为99.9%)、苯甲酸钠(纯度为99.5%)对照品均由淮阴和平生物化工厂提供；对氨基苯甲酸(内标)为中国药品生物制品检定所发对照品；肌苷注射液(北京永康制药厂，批号：990315，981026，980814，规格：100 mg∶2 mL);其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
2 测定条件
未涂层石英毛细管柱(75 μm×39 cm)，有效长度30 cm，河北永年光导纤维厂；柱温20 ℃；检测波长254 nm；运行缓冲液：20 mmol.L-1硼酸钠溶液-20 mmol.L-1磷酸缓冲液(36∶64,pH=6.1)；进样：压力进样10 s，运行电压15 kV；运行缓冲液和供试液均需经0.45 μm微孔滤膜过滤后使用；每次进样前分别用0.1 mmol.L-1氢氧化钠溶液，运行缓冲液各冲洗2 min。
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3 溶液的配制
3.1 对照品贮备液的配制 精密称取对照品肌苷100 mg，苯甲酸钠100.7 mg，置100 mL量瓶中加水适量，超声溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.2 内标贮备液的配制 精密称取对氨基苯甲酸21.6 mg, 置50 mL量瓶中加水适量，超声溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.3 样品贮备液的配制 精密量取肌苷注射液1 mL置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
4 方法与结果
4.1 标准曲线与线性范围 精密量取对照品贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，各加内标贮备液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀。分别进样测定峰面积。每一标准液进样5次，测定峰面积，取平均值。以对照品与内标的峰面积比为纵坐标，相应对照品浓度(mg.mL-1)为横坐标，进行线性回归。肌苷和苯甲酸钠的回归方程分别为：
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Y＝4.668 9C+0.206 1 r=0.999 5
Y＝13.329 0C+0.473 6 r=0.999 7
定量线性范围均为0.1～0.5 mg.mL-1。
4.2 回收率实验 精密量取对照品贮备液1.5 mL和已测得含量的样品贮备液1.5 mL，再加内标贮备液1 mL，置10 mL量瓶中用水稀释至刻度，摇匀。进样测定5份，结果表明：肌苷及苯甲酸钠的平均回收率分别为100.9%(RSD为1.6%)和99.3%(RSD为1.2%),n=5。
4.3 样品测定 精密量取样品贮备液3 mL置10 mL量瓶中，加内标贮备液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀。进样5次。典型电泳图见图1。测得峰面积与内标峰面积之比的平均值代入标准曲线方程，计算肌苷的百分标示含量与苯甲酸钠的百分含量。同时与部颁标准法[1]比较，结果基本一致。见表1。
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图1 肌苷注射液的电泳分离图
1.肌苷 2.对氨基苯甲酸 3.苯甲酸钠
表1 样品含量测定结果(%,n=5)
毛细管电泳法
部颁标准法
样品
肌苷
苯甲酸钠
肌苷
990315
93.5 (1.4)
4.407(0.9)
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93.1(2.4)
981026
95.1 (1.2)
4.361(1.1)
95.3(1.8)
980814
94.6 (0.9)
4.526 (1.3)
94.0(2.1)
注：括号内为RSD(%)
5 讨论
5.1 缓冲液pH的选择 在pH 4.5～7.0 范围内考察了肌苷和苯甲酸钠电泳的分离情况。当pH>6.1时，峰形随pH升高而前伸；pH<6.1时，峰形随pH降低而拖尾；pH=6.1时各峰峰形好，且分离度合适。故选pH=6.1。
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5.2 内标的选择 对安替比林、对乙酰氨基酚、对氨基苯甲酸电泳行为进行了考察，发现在本文条件下，安替比林、对乙酰氨基酚与肌苷不能达到基线分离，只有对氨基苯甲酸的迁移率介于组分峰之间，样品测定无干扰，且峰形良好，故选择对氨基苯甲酸作为内标。
5.3 运行电压的选择 升高运行电压可以加快分析速度，一定范围内提高电泳分离效能，实验中比较了运行电压8～19 kV范围内各组分的迁移时间和分离效能的变化规律，最终选择了15 kV运行电压不仅有高柱效，而且大大缩短分析时间。
参考文献
1，卫生部药品标准.生化药品(第一册).1989. 8
2，王董民，王晓琼.高效液相色谱法测定肌苷注射液中肌苷和苯甲酸钠的含量.药物分析杂志，1993，13(5)：331
3，陈炜.差示分光光度法测定肌苷注射液含量.药物分析杂志，1993，13(1)：42
4，洪煜.旋光度法测定肌苷注射液的含量.药物分析杂志，1994，14(4)：55
5，代勇.肌苷注射液的比色法测定.中国医药工业杂志，1994，25(5)：224
6，董亚琳，魏友霞，马玉英等.转换曲线分光光度法测定肌苷注射液含量.中国医院药学杂志，1998，18(10)：461
(本文于2000年3月17日修改回), 百拇医药