原发性膀胱癌肿瘤浸润淋巴细胞体外抗肿瘤作用的研究*
作者：裴秀英 韩 梅 杨志伟 梁大用 王慕娣 戴寿芝
单位：裴秀英 韩 梅 杨志伟 王慕娣 戴寿芝(宁夏医学院免疫研究室 750004)；梁大用(宁夏医学院附属医院泌尿外科 750004)
关键词：肿瘤浸润性淋巴细胞；白细胞介素-2；膀胱癌；细胞毒活性
宁夏医学杂志990201 【摘要】 目的 探讨原发性膀胱癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外抗肿瘤作用。方法 采用LDH释放法。结果 该TIL对自体肿瘤靶细胞的最高杀伤活性第30天时为72.4%，且呈现一定的靶细胞特异性。结论 膀胱癌TIL在体外经IL-2培养后对自体肿瘤细胞具有明显的杀伤活性，并显示一定的靶细胞特异性。
In vitro antitumor activity of tumor infiltrating lymphocytes
, 百拇医药
from a patient with bladder cancer
Pei Xiuying，Han Mei，Yang Zhiwei，et al
(Dept.of Immunology Ningxia Med.Coll.)
【Abstract】 Objectives To study the antitumor activity in vitro of Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from a patient with bladder cancer.Methods Using the LDH release assay.Results The TILs showed the highest antitumor activity (72.4%) and target specificity.Conclutions After incubation of TILs in medium with IL-2，the TILs exhibited apparently antitumor activity and specificity to autotumor cells
, 百拇医药
【Key words】 Tumor-infilerating，lymphocytes；Interleukin-2；Bladder cancer;Cytotoxic activity
自从发现白细胞介素-2(IL-2)后，人们能在体外对淋巴样细胞进行长期培养，大量扩增，从而克服了以往难于获得足够量抗肿瘤效应细胞的困难，使肿瘤的过继免疫治疗取得了新的进展，如淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞疗法〔1〕，虽然该疗法治疗晚期肿瘤患者取得了令人瞩目的效果，但其副作用严重，治疗的肿瘤类型也有一定限度。据Rosenberg等〔2〕报道，肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)经IL-2培养后具有比LAK细胞更强的抗肿瘤效果。我们分离培养了1例原发性膀胱癌(病理证实为移行细胞癌)患者手术切除肿瘤组织中的TIL，并进行了体外抗肿瘤作用的研究。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料：人类重组的白细胞介素-2(rhIL-2)：中科院上海生物化学研究所和卫生部长春生物制品所产品。
1.2 细胞系：K562细胞，胃癌BGC823细胞得自中科院肿瘤研究所；膀胱癌患者自体新鲜肿瘤细胞由本室冻存复苏，自行维持。
1.3 TIL的分离与培养：参照Whiteside〔3〕等介绍的方法，无菌条件下取手术切除瘤体，置Hanks液中。将瘤体剪碎后经0.25%胰酶，0.002%w/v DNase和0.05%Collagenase消化6小时后，过200目钢网制得细胞悬液。将细胞用含200mmol/L谷氨酰胺，双抗(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)的RPMI 1640培养液洗两遍后，经Ficoll-Hypaque不连续密度梯度离心(2000r/min，20min)后，取上下两层分离液界面上细胞悬液即得TIL，并收集富含肿瘤细胞层悬液(位于75%Ficoll-Hypaque之上界面)。对所获含TIL悬液再经一次同等条件下不连续密度梯度离心，以提高TIL纯度。将TIL(1×106/ml)悬于含IL-2(1000U/ml)，10%人AB血清、2mmol/L谷氨酰胺及双抗的RPMI1640完全培养液中培养(37℃，5%CO2)，于不同时间收集TIL作为效应细胞。
, 百拇医药
1.4 体外细胞毒作用的测定：采用王长安〔4〕等介绍的LDH释放法。同时设立靶细胞自然释放孔及效应细胞自然释放孔，用NP-40(Nonidet P40，Fluka AG)破坏靶细胞作最大释放，用酶联免疫检测仪(华东电子管厂生产)490nm，测OD值，活性计算公式如下：
*为靶细胞自然释放OD值和效应细胞OD值之和
2 结果
2.1 TIL对自体肿瘤细胞的直接杀伤作用：经IL-2培养，TIL对自体肿瘤的杀伤活性明显提高，分别为第10天的38.2%，第15天的43.3%，第21天的49.9%及第30天的72.4%。未加IL-2的TIL对照培养系统对自体瘤靶细胞的杀伤活性较低，第10天时为6%。
2.2 TIL对非自体瘤细胞的杀伤作用：TIL在体外经IL-2作用后，对非自体瘤细胞的杀伤活性因肿瘤细胞的不同而不同，但均弱于对自体瘤细胞的杀伤活性。随着培养天数的增加，杀伤活性也有所提高，其中对K562的杀伤活性分别为第10天的24.4%，第15天的33.6%，第21天的38.8%和第30天的45.8%。对胃癌BGC 823的杀伤活性分别为第10天的19.3%，第15天的23.3%，第21天的29.2%和第30天的26%。而未加IL-2的TIL的杀伤活性同样较低(对K562的杀伤活性第10天为4.3%)。
, http://www.100md.com
3 讨论
1986年，Rosenberg等〔2〕首次报道了TIL体外杀伤肿瘤细胞具有一定的特异性，随后，其他学者也作了类似的报道，并认为与LAK细胞相比，TIL具有更强的抗肿瘤活性〔5，6〕，且LAK细胞与TIL细胞作用于肿瘤细胞的机制不同，LAK细胞的抗肿瘤作用是非特异性的，其主要成分是NK细胞，而TIL的抗肿瘤作用有一定的特异性，其主要成分为CTL细胞。我们在实验中发现，源于膀胱癌患者瘤体的TIL在分离后，对自体肿瘤细胞和非自体瘤细胞的杀伤活性均很低(6%、4.3%)，但经体外IL-2激活后，对自体瘤细胞的杀伤活性显著增高(最高达72.4%)，而对非自体瘤细胞的杀伤活性相对较低(最高为45.8%和29.2%)，呈现一定的靶细胞特异性。
IL-2可刺激TIL在体外大量扩增，使TIL分泌IL-2，IFN-γ，LT增多，提高了其杀瘤活性。TIL的抗肿瘤活性以培养第10～30天之间为最强，这与细胞经IL-2孵育后的增殖倍数相一致。提示膀胱癌TIL在体外经IL-2培养后可用于临床肿瘤的辅助治疗。
, http://www.100md.com
*自治区科委资助项目
参考文献
1 Rosenberg SA.Immunotherapy of cancer using interleukine-2：current status and future prospects.Immunol Today，1988，9：58
2 Rosenberg SA，et al.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science，1986，233：1318
3 Whiteside TL，et al.Separation of tumor-infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors. A comparison between velocity sedimentation and discontinuous density gradients . J Immunol Methods，1986，90：221
4 王长安，许荣，李中华.天然细胞毒测定—LDH释放法.中国免疫学杂志，1988，4(1)：44
5 曹雪涛，叶天星，杨嗣坤.IL-2激活的TIL与LAK细胞体内外抗肿瘤作用的比较.中国免疫学杂志，1990，6(2)：105
6 戴寿芝，周悌，杨志伟，等.淋巴因子对人PBMNC的LAK细胞形成增殖的细胞毒作用的影响.宁夏医学院学报，1995，17(1)：1
(收稿：1998—10—20) 责编：马兴忠, 百拇医药
单位：裴秀英 韩 梅 杨志伟 王慕娣 戴寿芝(宁夏医学院免疫研究室 750004)；梁大用(宁夏医学院附属医院泌尿外科 750004)
关键词：肿瘤浸润性淋巴细胞；白细胞介素-2；膀胱癌；细胞毒活性
宁夏医学杂志990201 【摘要】 目的 探讨原发性膀胱癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外抗肿瘤作用。方法 采用LDH释放法。结果 该TIL对自体肿瘤靶细胞的最高杀伤活性第30天时为72.4%，且呈现一定的靶细胞特异性。结论 膀胱癌TIL在体外经IL-2培养后对自体肿瘤细胞具有明显的杀伤活性，并显示一定的靶细胞特异性。
In vitro antitumor activity of tumor infiltrating lymphocytes
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from a patient with bladder cancer
Pei Xiuying，Han Mei，Yang Zhiwei，et al
(Dept.of Immunology Ningxia Med.Coll.)
【Abstract】 Objectives To study the antitumor activity in vitro of Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from a patient with bladder cancer.Methods Using the LDH release assay.Results The TILs showed the highest antitumor activity (72.4%) and target specificity.Conclutions After incubation of TILs in medium with IL-2，the TILs exhibited apparently antitumor activity and specificity to autotumor cells
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【Key words】 Tumor-infilerating，lymphocytes；Interleukin-2；Bladder cancer;Cytotoxic activity
自从发现白细胞介素-2(IL-2)后，人们能在体外对淋巴样细胞进行长期培养，大量扩增，从而克服了以往难于获得足够量抗肿瘤效应细胞的困难，使肿瘤的过继免疫治疗取得了新的进展，如淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞疗法〔1〕，虽然该疗法治疗晚期肿瘤患者取得了令人瞩目的效果，但其副作用严重，治疗的肿瘤类型也有一定限度。据Rosenberg等〔2〕报道，肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)经IL-2培养后具有比LAK细胞更强的抗肿瘤效果。我们分离培养了1例原发性膀胱癌(病理证实为移行细胞癌)患者手术切除肿瘤组织中的TIL，并进行了体外抗肿瘤作用的研究。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料：人类重组的白细胞介素-2(rhIL-2)：中科院上海生物化学研究所和卫生部长春生物制品所产品。
1.2 细胞系：K562细胞，胃癌BGC823细胞得自中科院肿瘤研究所；膀胱癌患者自体新鲜肿瘤细胞由本室冻存复苏，自行维持。
1.3 TIL的分离与培养：参照Whiteside〔3〕等介绍的方法，无菌条件下取手术切除瘤体，置Hanks液中。将瘤体剪碎后经0.25%胰酶，0.002%w/v DNase和0.05%Collagenase消化6小时后，过200目钢网制得细胞悬液。将细胞用含200mmol/L谷氨酰胺，双抗(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)的RPMI 1640培养液洗两遍后，经Ficoll-Hypaque不连续密度梯度离心(2000r/min，20min)后，取上下两层分离液界面上细胞悬液即得TIL，并收集富含肿瘤细胞层悬液(位于75%Ficoll-Hypaque之上界面)。对所获含TIL悬液再经一次同等条件下不连续密度梯度离心，以提高TIL纯度。将TIL(1×106/ml)悬于含IL-2(1000U/ml)，10%人AB血清、2mmol/L谷氨酰胺及双抗的RPMI1640完全培养液中培养(37℃，5%CO2)，于不同时间收集TIL作为效应细胞。
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1.4 体外细胞毒作用的测定：采用王长安〔4〕等介绍的LDH释放法。同时设立靶细胞自然释放孔及效应细胞自然释放孔，用NP-40(Nonidet P40，Fluka AG)破坏靶细胞作最大释放，用酶联免疫检测仪(华东电子管厂生产)490nm，测OD值，活性计算公式如下：
*为靶细胞自然释放OD值和效应细胞OD值之和
2 结果
2.1 TIL对自体肿瘤细胞的直接杀伤作用：经IL-2培养，TIL对自体肿瘤的杀伤活性明显提高，分别为第10天的38.2%，第15天的43.3%，第21天的49.9%及第30天的72.4%。未加IL-2的TIL对照培养系统对自体瘤靶细胞的杀伤活性较低，第10天时为6%。
2.2 TIL对非自体瘤细胞的杀伤作用：TIL在体外经IL-2作用后，对非自体瘤细胞的杀伤活性因肿瘤细胞的不同而不同，但均弱于对自体瘤细胞的杀伤活性。随着培养天数的增加，杀伤活性也有所提高，其中对K562的杀伤活性分别为第10天的24.4%，第15天的33.6%，第21天的38.8%和第30天的45.8%。对胃癌BGC 823的杀伤活性分别为第10天的19.3%，第15天的23.3%，第21天的29.2%和第30天的26%。而未加IL-2的TIL的杀伤活性同样较低(对K562的杀伤活性第10天为4.3%)。
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3 讨论
1986年，Rosenberg等〔2〕首次报道了TIL体外杀伤肿瘤细胞具有一定的特异性，随后，其他学者也作了类似的报道，并认为与LAK细胞相比，TIL具有更强的抗肿瘤活性〔5，6〕，且LAK细胞与TIL细胞作用于肿瘤细胞的机制不同，LAK细胞的抗肿瘤作用是非特异性的，其主要成分是NK细胞，而TIL的抗肿瘤作用有一定的特异性，其主要成分为CTL细胞。我们在实验中发现，源于膀胱癌患者瘤体的TIL在分离后，对自体肿瘤细胞和非自体瘤细胞的杀伤活性均很低(6%、4.3%)，但经体外IL-2激活后，对自体瘤细胞的杀伤活性显著增高(最高达72.4%)，而对非自体瘤细胞的杀伤活性相对较低(最高为45.8%和29.2%)，呈现一定的靶细胞特异性。
IL-2可刺激TIL在体外大量扩增，使TIL分泌IL-2，IFN-γ，LT增多，提高了其杀瘤活性。TIL的抗肿瘤活性以培养第10～30天之间为最强，这与细胞经IL-2孵育后的增殖倍数相一致。提示膀胱癌TIL在体外经IL-2培养后可用于临床肿瘤的辅助治疗。
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*自治区科委资助项目
参考文献
1 Rosenberg SA.Immunotherapy of cancer using interleukine-2：current status and future prospects.Immunol Today，1988，9：58
2 Rosenberg SA，et al.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science，1986，233：1318
3 Whiteside TL，et al.Separation of tumor-infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors. A comparison between velocity sedimentation and discontinuous density gradients . J Immunol Methods，1986，90：221
4 王长安，许荣，李中华.天然细胞毒测定—LDH释放法.中国免疫学杂志，1988，4(1)：44
5 曹雪涛，叶天星，杨嗣坤.IL-2激活的TIL与LAK细胞体内外抗肿瘤作用的比较.中国免疫学杂志，1990，6(2)：105
6 戴寿芝，周悌，杨志伟，等.淋巴因子对人PBMNC的LAK细胞形成增殖的细胞毒作用的影响.宁夏医学院学报，1995，17(1)：1
(收稿：1998—10—20) 责编：马兴忠, 百拇医药