肝癌瘤苗激活的肿瘤浸润性淋巴细胞对血清sIL-2R水平的影响及意义*
作者：刘剑勇 李 挺 杨南武 刘剑仑 韦长元 张丽生 唐东平 唐 凯 潘凤慧
单位：刘剑勇 李 挺 杨南武 刘剑仑 韦长元 广西医科大学附属肿瘤医院普瘤科；张丽生 唐东平 唐 凯 潘凤慧 广西肿瘤防治研究所
关键词：肝癌瘤苗；激活；肿瘤浸润性淋巴细胞；可溶性白介素-2受体
广西医学990501 摘要 目的：为了探讨肝癌瘤苗激活的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)对原发性肝癌(PHC)患者血清可溶性白介素-2受体(sIL-2R)的影响及意义。方法：使用冷冻方法制成肝癌瘤苗，用于激活TIL。对22例原发性肝癌患者使用经肝癌瘤苗激活的TIL治疗，并应用双抗体夹心ELISA法检测治疗前后sIL-2R水平变化以及与对照组相比较。结果：用经肝癌瘤苗激活的TIL治疗者，其血清sIL-2R水平下降幅度最大，用未经肝癌瘤苗激活的TIL治疗者下降幅度次之，而未用TIL治疗者下降幅度最小。结论：提示经肝癌瘤苗激活的TIL能很快地解除原发性肝癌患者的免疫抑制，原因可能是由于它具有更强的杀伤体内残留的肿瘤细胞能力。
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Effects and significance of tumor infiltrating lymphocytes
stimulated by liver cancer vaccines on serum sIL-2R
Liu Jianyong,Li Ting,Yang Nanwu,et al.
Department of General Surgery,Affiliated Tumor Hospital,Guangxi Medical University(Nanning 530021)
Abstract Objective:The effects and significance of tumor infiltrating lymphocytes(TIL) stimulated by liver cancer vaccines on the levels of serum soluble interleukin-2 receptor(sIL-2R) of primary hepatocarcinoma(PHC) patients were studied.Method:The liver cancer vaccines were made by cryodestorying method.The TIL was stimulated by liver cancer vaccines.Twenty-two patients with PHC were treated with TIL stimulated by liver cancer vaccines.The levels of serum sIL-2R were assayed with double-antibldy-scandwich ELISA method before and after treatment,and compared with control groups.Result:It is the biggest that the descent amplitude of the serum sIL-2R of patients treated with TIL stimulated by liver cancer vaccines,and it is smaller that of patients treated with TIL not stimulated by liver cancer vaccines,and it is the smallest that of patients not treated with TIL.Conclusion:The results indicated that the TIL stimulated by liver cancer vaccines can relieve the immunodepression of patients with PHC quickly.The cause may be that TIL stimulated by liver cancer vaccines possessed higher casualty function for remaining tumor cells in vivo.
, 百拇医药
Key words Liver cancer vaccines;stimulation;Tumor infiltrating lymphocytes(TIL);sIL-2R
肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL)对恶性肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤作用(1)。我们使用冷冻方法制作出肝癌瘤苗，用它来激活从原发性肝癌组织分离出来的TIL，使TIL的抗瘤活性得到了进一步的提高(2)。目前我们在临床上应用经肝癌瘤苗激活的TIL，观察到它能使血清sIL-2R水平发生变化，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 原发性肝癌65例，全部为临床Ⅱ期患者，均能完整切除肝癌组织，并经病理证实为肝细胞性肝癌。65例患者中，男44例，女21例，年龄31～66岁。正常对照22例为健康献血员，男15例，女7例，年龄29～50岁。
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1.1.2 主要试剂：RPMI1640培养基为美国GIBCOBRL公司产品。rIL-2(重组白细胞介素Ⅱ)为北京生物制品公司产品。胰酶和Ⅳ型胶原酶为SIGMA公司产品。Ⅰ型DNA酶和透明质酸酶为华美公司产品。淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。血清sIL-2R测定采用双抗体夹心ELISA由白求恩医科大学免疫教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 TIL的分离及培养：参照文献(3)的方法进行。
1.2.2 肝癌瘤苗的制备：在分离每例肝癌组织中的TIL时，取肝癌细胞悬液，用RPMI1640液稀释成细胞浓度为1×105/ml的瘤细胞悬液，分装于冻存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，慢融，共三个冻融周期，然后置于-20℃冰箱里贮存，备用。
1.2.3 肝癌瘤苗激活的TIL的制备：于分离培养TIL当天加入肝癌瘤苗，所加入的瘤苗是由相应本例肝癌细胞制作而成，浓度为效应细胞∶肿瘤细胞(E/T)=50∶1，即每50个肿瘤浸润性淋巴细胞用1个肝癌细胞制成的瘤苗来激活。TIL在加入肝癌瘤苗后继续进行培养扩增。
, 百拇医药
1.2.4 实验分为A组、B组、C组以及正常对照组共4组。将65例肝癌患者分在A、B、C 3组中。A组(n=22)：患者于术后第20天开始静脉滴注经肝癌瘤苗激活的TIL，每天用细胞数为108个，连用10天。B组(n=21)：患者应用未经肝癌瘤苗激活的TIL，应用时间、方式和细胞数均与A组相同。C组(n=22)：患者未应用TIL，其他治疗与A、B组无区别。正常对照组由22例健康献血员组成。
1.2.5 分别于术前、术后第19天(A、B组应用TIL前1天)、术后第30天(A、B组应用TIL后1天)检测A、B、C3组患者血清sIL-2R水平。另外，测定22名健康献血员sIL-2R水平。
1.2.6 数理统计方法：数据用
来表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析和多重比较，相关分析采用Kendall等级相关分析。
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2 结果
表1结果显示，术前A、B、C3组sIL-2R水平相互比较无显著性差异(P>0.05)，但它们分别与正常对照组比较，则均明显高于后者(P<0.01)。
表1 PHC患者治疗前后血清sIL-2R水平的变化 组别
例数
sIL-2R(u/ml,)
术前
术后第19天
术后第30天
正常对照组
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22
149.27±56.24
-
-
A组
22
855.31±181.55*
563.44±91.11**
152.53±58.31***
B组
21
871.81±184.36*
, 百拇医药
560.29±92.65**
291.65±78.53△
C组
22
866.43±187.02*
549.07±88.92**
524.87±81.26△△
*与正常对照组相比P<0.01，同期与另两组相比P>0.05。
**与本组术前相比P<0.05，同期与其他组相比P>0.05。
, 百拇医药
***与本组术前和术后第19天相比均为P<0.01，同期与另两组相比均为P<0.01，与正常对照组相比P>0.05。
△与本组术前相比P<0.01，与本组术后第19天相比P<0.05，同期与另两组相比P<0.05，与正常对照组相比P<0.05。
△△与本组术前相比P<0.05，与本组术后第19天相比P>0.05，同期与A组相比P<0.01，同期与B组相比P<0.05，与正常对照组相比P<0.01。
术后第19天A、B、C3组sIL-2R水平与本组术前相比较均明显下降(P<0.05)，但同期3组之间相互比较无显著性差异(P>0.05)。
术后第30天，A组sIL-2R水平与本组术前和术后第19天相比较明显降低(P<0.01)，也明显低于同期B组(P<0.01)和C组(P<0.01)。B组sIL-2R水平与本组术前相比明显降低(P<0.01)，亦低于本组术后第19天(P<0.05)和同期C组(P<0.05)。C组sIL-2R水平与本组术前相比明显降低(P<0.05)，但与本组术后第19天相比则无显著性差异(P>0.05)。3 讨论
, 百拇医药
原发性肝癌患者免疫功能低下，已为许多实验研究和临床观察所证实(4)。最近研究认为，肿瘤患者血清sIL-2R水平异常增高是由于癌细胞刺激，T细胞P55蛋白过度表达的结果。血中大量sIL-2R又反过来抑制了T细胞的克隆扩增，降低NK细胞活性，影响B细胞功能(5)。检测血清sIL-2R水平能够从正、反两方面较好地反映机体免疫状态(6)。在本研究中，A、B、C3组患者术前血清sIL-2R水平均明显高于正常对照组，而3组间相互比较无显著性差异，显示了3组患者机体均处于免疫抑制状态，这与其他作者报道一致(7)。
在本研究中，术后第19天，A、B、C3组患者血清sIL-2R水平均明显下降，这是由于肝癌患者经行手术治疗后减少了肿瘤负荷所致。然而，其血清sIL-2R水平仍高于正常对照组。说明机体免疫抑制仍未完全解除，考虑原因主要是：(1)虽然已切除肿瘤，但此时机体内仍会残留有一定数目的肿瘤细胞以及肿瘤细胞产生的免疫抑制因子(TDSF)；(2)手术创伤及麻醉等对免疫系统的影响。
, 百拇医药
术后第30天，A组患者(术后第20～29天应用经肝癌瘤苗激活的TIL)的血清sIL-2R水平较其术后第19天又有所下降，而且低于同期的B组，与正常对照组比较已无显著性差异。B组患者(术后第20～29天应用未经瘤苗激活的TIL)的血清sIL-2R水平亦较其术后第19天又有所下降，而且低于同期的C组，但仍高于正常对照组。C组患者(未应用TIL)的血清sIL-2R水平与其术后第19天比较无显著性差异，明显高于正常对照组，亦高于同期的A组和B组。以上的结果表明，术后应用经肝癌瘤苗激活的TIL的肝癌患者，其机体免疫抑制状态解除最快。在术后应用未经瘤苗激活的TIL的肝癌患者，其机体免疫抑制状态解除相对较慢。而术后未应用TIL的肝癌患者，其机体免疫抑制状态解除则最慢。姚德茂(8)报道，经TIL治疗后可明显提高肿瘤病人的细胞免疫功能。作者等人(2)曾报道使用冷冻方法制作出肝癌瘤苗用于激活TIL，由于冷冻免疫的作用，TIL经肝癌瘤苗激活后具有更强的体外抗瘤活性。综上所述，导致本研究结果的原因可能是：未经肝癌瘤苗激活的TIL已具有一定的杀伤体内残留肿瘤细胞能力，而经肝癌瘤苗激活的TIL较未经激活者具有更强杀伤体内残留的肿瘤细胞能力，以致能更快地解除由于肿瘤细胞造成的免疫抑制。结果提示经肝癌瘤苗激活的TIL在治疗原发性肝癌方面将具有良好的前景。
, 百拇医药
*广西区科委资助课题(合同编号：9523029)
参考文献
1 Rosenberg SA,Spiess P,Diane S,et al.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.Science 1986；233：1318
2 刘剑勇，李 挺，刘剑仑，等.肝癌瘤苗激活的TIL在体外抗肿瘤活性的研究.广西医科大学学报 1998；15(3)：8
3 Whiteside TL,Miescher S,Mac Donald HR,et al.Separation of tumor-infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors.A comparision between velocity sedimentation and discontinuous density gradients.J Immunol Methods 1986；90(2)：221
, 百拇医药
4 常 旭，区庆嘉，陈积圣.原发性肝癌的免疫状态及免疫治疗.国外医学肿瘤学分册 1991；18(3)：136
5 陈伟强，张世能.肝癌患者治疗前后T细胞亚群和sIL-2R水平的变化.上海免疫学杂志 1998；18(4)：238
6 Zeng ZC,Tang ZY,Liu KD,et al.Observation of changes in peripheral T-lymphocyte subsets by flow cytometry in patients with liver cancer treated with radioimmunotherapy.Nuc Med Commun 1995；16(5)：378
7 Lee WJ,Chang KJ,Lee CS,et al.Select depression of T-lymphocytes subsets in gastric cancer patients:an implication of immunotherapy.J Surg Oncol 1994；55(3)：165
8 姚德茂，潘承恩，王一理，等.肿瘤浸润淋巴细胞和重组人白细胞介素-2对进展期肿瘤病人细胞免疫功能的影响.中华实验外科杂志 1996；13(2)：82, http://www.100md.com
单位：刘剑勇 李 挺 杨南武 刘剑仑 韦长元 广西医科大学附属肿瘤医院普瘤科；张丽生 唐东平 唐 凯 潘凤慧 广西肿瘤防治研究所
关键词：肝癌瘤苗；激活；肿瘤浸润性淋巴细胞；可溶性白介素-2受体
广西医学990501 摘要 目的：为了探讨肝癌瘤苗激活的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)对原发性肝癌(PHC)患者血清可溶性白介素-2受体(sIL-2R)的影响及意义。方法：使用冷冻方法制成肝癌瘤苗，用于激活TIL。对22例原发性肝癌患者使用经肝癌瘤苗激活的TIL治疗，并应用双抗体夹心ELISA法检测治疗前后sIL-2R水平变化以及与对照组相比较。结果：用经肝癌瘤苗激活的TIL治疗者，其血清sIL-2R水平下降幅度最大，用未经肝癌瘤苗激活的TIL治疗者下降幅度次之，而未用TIL治疗者下降幅度最小。结论：提示经肝癌瘤苗激活的TIL能很快地解除原发性肝癌患者的免疫抑制，原因可能是由于它具有更强的杀伤体内残留的肿瘤细胞能力。
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Effects and significance of tumor infiltrating lymphocytes
stimulated by liver cancer vaccines on serum sIL-2R
Liu Jianyong,Li Ting,Yang Nanwu,et al.
Department of General Surgery,Affiliated Tumor Hospital,Guangxi Medical University(Nanning 530021)
Abstract Objective:The effects and significance of tumor infiltrating lymphocytes(TIL) stimulated by liver cancer vaccines on the levels of serum soluble interleukin-2 receptor(sIL-2R) of primary hepatocarcinoma(PHC) patients were studied.Method:The liver cancer vaccines were made by cryodestorying method.The TIL was stimulated by liver cancer vaccines.Twenty-two patients with PHC were treated with TIL stimulated by liver cancer vaccines.The levels of serum sIL-2R were assayed with double-antibldy-scandwich ELISA method before and after treatment,and compared with control groups.Result:It is the biggest that the descent amplitude of the serum sIL-2R of patients treated with TIL stimulated by liver cancer vaccines,and it is smaller that of patients treated with TIL not stimulated by liver cancer vaccines,and it is the smallest that of patients not treated with TIL.Conclusion:The results indicated that the TIL stimulated by liver cancer vaccines can relieve the immunodepression of patients with PHC quickly.The cause may be that TIL stimulated by liver cancer vaccines possessed higher casualty function for remaining tumor cells in vivo.
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Key words Liver cancer vaccines;stimulation;Tumor infiltrating lymphocytes(TIL);sIL-2R
肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL)对恶性肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤作用(1)。我们使用冷冻方法制作出肝癌瘤苗，用它来激活从原发性肝癌组织分离出来的TIL，使TIL的抗瘤活性得到了进一步的提高(2)。目前我们在临床上应用经肝癌瘤苗激活的TIL，观察到它能使血清sIL-2R水平发生变化，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 原发性肝癌65例，全部为临床Ⅱ期患者，均能完整切除肝癌组织，并经病理证实为肝细胞性肝癌。65例患者中，男44例，女21例，年龄31～66岁。正常对照22例为健康献血员，男15例，女7例，年龄29～50岁。
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1.1.2 主要试剂：RPMI1640培养基为美国GIBCOBRL公司产品。rIL-2(重组白细胞介素Ⅱ)为北京生物制品公司产品。胰酶和Ⅳ型胶原酶为SIGMA公司产品。Ⅰ型DNA酶和透明质酸酶为华美公司产品。淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。血清sIL-2R测定采用双抗体夹心ELISA由白求恩医科大学免疫教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 TIL的分离及培养：参照文献(3)的方法进行。
1.2.2 肝癌瘤苗的制备：在分离每例肝癌组织中的TIL时，取肝癌细胞悬液，用RPMI1640液稀释成细胞浓度为1×105/ml的瘤细胞悬液，分装于冻存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，慢融，共三个冻融周期，然后置于-20℃冰箱里贮存，备用。
1.2.3 肝癌瘤苗激活的TIL的制备：于分离培养TIL当天加入肝癌瘤苗，所加入的瘤苗是由相应本例肝癌细胞制作而成，浓度为效应细胞∶肿瘤细胞(E/T)=50∶1，即每50个肿瘤浸润性淋巴细胞用1个肝癌细胞制成的瘤苗来激活。TIL在加入肝癌瘤苗后继续进行培养扩增。
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1.2.4 实验分为A组、B组、C组以及正常对照组共4组。将65例肝癌患者分在A、B、C 3组中。A组(n=22)：患者于术后第20天开始静脉滴注经肝癌瘤苗激活的TIL，每天用细胞数为108个，连用10天。B组(n=21)：患者应用未经肝癌瘤苗激活的TIL，应用时间、方式和细胞数均与A组相同。C组(n=22)：患者未应用TIL，其他治疗与A、B组无区别。正常对照组由22例健康献血员组成。
1.2.5 分别于术前、术后第19天(A、B组应用TIL前1天)、术后第30天(A、B组应用TIL后1天)检测A、B、C3组患者血清sIL-2R水平。另外，测定22名健康献血员sIL-2R水平。
1.2.6 数理统计方法：数据用
来表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析和多重比较，相关分析采用Kendall等级相关分析。, http://www.100md.com
2 结果
表1结果显示，术前A、B、C3组sIL-2R水平相互比较无显著性差异(P>0.05)，但它们分别与正常对照组比较，则均明显高于后者(P<0.01)。
表1 PHC患者治疗前后血清sIL-2R水平的变化 组别
例数
sIL-2R(u/ml,
)术前
术后第19天
术后第30天
正常对照组
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22
149.27±56.24
-
-
A组
22
855.31±181.55*
563.44±91.11**
152.53±58.31***
B组
21
871.81±184.36*
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560.29±92.65**
291.65±78.53△
C组
22
866.43±187.02*
549.07±88.92**
524.87±81.26△△
*与正常对照组相比P<0.01，同期与另两组相比P>0.05。
**与本组术前相比P<0.05，同期与其他组相比P>0.05。
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***与本组术前和术后第19天相比均为P<0.01，同期与另两组相比均为P<0.01，与正常对照组相比P>0.05。
△与本组术前相比P<0.01，与本组术后第19天相比P<0.05，同期与另两组相比P<0.05，与正常对照组相比P<0.05。
△△与本组术前相比P<0.05，与本组术后第19天相比P>0.05，同期与A组相比P<0.01，同期与B组相比P<0.05，与正常对照组相比P<0.01。
术后第19天A、B、C3组sIL-2R水平与本组术前相比较均明显下降(P<0.05)，但同期3组之间相互比较无显著性差异(P>0.05)。
术后第30天，A组sIL-2R水平与本组术前和术后第19天相比较明显降低(P<0.01)，也明显低于同期B组(P<0.01)和C组(P<0.01)。B组sIL-2R水平与本组术前相比明显降低(P<0.01)，亦低于本组术后第19天(P<0.05)和同期C组(P<0.05)。C组sIL-2R水平与本组术前相比明显降低(P<0.05)，但与本组术后第19天相比则无显著性差异(P>0.05)。3 讨论
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原发性肝癌患者免疫功能低下，已为许多实验研究和临床观察所证实(4)。最近研究认为，肿瘤患者血清sIL-2R水平异常增高是由于癌细胞刺激，T细胞P55蛋白过度表达的结果。血中大量sIL-2R又反过来抑制了T细胞的克隆扩增，降低NK细胞活性，影响B细胞功能(5)。检测血清sIL-2R水平能够从正、反两方面较好地反映机体免疫状态(6)。在本研究中，A、B、C3组患者术前血清sIL-2R水平均明显高于正常对照组，而3组间相互比较无显著性差异，显示了3组患者机体均处于免疫抑制状态，这与其他作者报道一致(7)。
在本研究中，术后第19天，A、B、C3组患者血清sIL-2R水平均明显下降，这是由于肝癌患者经行手术治疗后减少了肿瘤负荷所致。然而，其血清sIL-2R水平仍高于正常对照组。说明机体免疫抑制仍未完全解除，考虑原因主要是：(1)虽然已切除肿瘤，但此时机体内仍会残留有一定数目的肿瘤细胞以及肿瘤细胞产生的免疫抑制因子(TDSF)；(2)手术创伤及麻醉等对免疫系统的影响。
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术后第30天，A组患者(术后第20～29天应用经肝癌瘤苗激活的TIL)的血清sIL-2R水平较其术后第19天又有所下降，而且低于同期的B组，与正常对照组比较已无显著性差异。B组患者(术后第20～29天应用未经瘤苗激活的TIL)的血清sIL-2R水平亦较其术后第19天又有所下降，而且低于同期的C组，但仍高于正常对照组。C组患者(未应用TIL)的血清sIL-2R水平与其术后第19天比较无显著性差异，明显高于正常对照组，亦高于同期的A组和B组。以上的结果表明，术后应用经肝癌瘤苗激活的TIL的肝癌患者，其机体免疫抑制状态解除最快。在术后应用未经瘤苗激活的TIL的肝癌患者，其机体免疫抑制状态解除相对较慢。而术后未应用TIL的肝癌患者，其机体免疫抑制状态解除则最慢。姚德茂(8)报道，经TIL治疗后可明显提高肿瘤病人的细胞免疫功能。作者等人(2)曾报道使用冷冻方法制作出肝癌瘤苗用于激活TIL，由于冷冻免疫的作用，TIL经肝癌瘤苗激活后具有更强的体外抗瘤活性。综上所述，导致本研究结果的原因可能是：未经肝癌瘤苗激活的TIL已具有一定的杀伤体内残留肿瘤细胞能力，而经肝癌瘤苗激活的TIL较未经激活者具有更强杀伤体内残留的肿瘤细胞能力，以致能更快地解除由于肿瘤细胞造成的免疫抑制。结果提示经肝癌瘤苗激活的TIL在治疗原发性肝癌方面将具有良好的前景。
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*广西区科委资助课题(合同编号：9523029)
参考文献
1 Rosenberg SA,Spiess P,Diane S,et al.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.Science 1986；233：1318
2 刘剑勇，李 挺，刘剑仑，等.肝癌瘤苗激活的TIL在体外抗肿瘤活性的研究.广西医科大学学报 1998；15(3)：8
3 Whiteside TL,Miescher S,Mac Donald HR,et al.Separation of tumor-infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors.A comparision between velocity sedimentation and discontinuous density gradients.J Immunol Methods 1986；90(2)：221
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4 常 旭，区庆嘉，陈积圣.原发性肝癌的免疫状态及免疫治疗.国外医学肿瘤学分册 1991；18(3)：136
5 陈伟强，张世能.肝癌患者治疗前后T细胞亚群和sIL-2R水平的变化.上海免疫学杂志 1998；18(4)：238
6 Zeng ZC,Tang ZY,Liu KD,et al.Observation of changes in peripheral T-lymphocyte subsets by flow cytometry in patients with liver cancer treated with radioimmunotherapy.Nuc Med Commun 1995；16(5)：378
7 Lee WJ,Chang KJ,Lee CS,et al.Select depression of T-lymphocytes subsets in gastric cancer patients:an implication of immunotherapy.J Surg Oncol 1994；55(3)：165
8 姚德茂，潘承恩，王一理，等.肿瘤浸润淋巴细胞和重组人白细胞介素-2对进展期肿瘤病人细胞免疫功能的影响.中华实验外科杂志 1996；13(2)：82, http://www.100md.com