HPLC法测定冬虫夏草中腺苷含量
作者：吴春敏* 叶榕平**
单位：福建省药品检验所 福州 350001
关键词：HPLC；冬虫夏草；腺苷
中草药990909 摘 要 采用甲醇为溶剂，提取冬虫夏草及其虫体、子座中的核苷类成分，用HPLC法测定腺苷的含量；色谱条件以μBondapak C18(4.6mm×250mm,10μm)为色谱柱，0.01mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.5)-甲醇(85∶15)为流动相，检测波长UV260nm；r=0.9999，线性范围0.2～1μg，回收率104.5%。
Determination of Adenosine in Dongchongxiachao (Cordyceps sinensis) by HPLC
, http://www.100md.com
Wu Chunmin and Ye Rongping
(Fujian Institute of Drug Control, Fuzhou 350001)
Abstract A method has been developed for the determination of adenosine in Cordycepes sinensis (Berk.) Sacc. by HPLC. Nucleosides in both worm body and stroma were extracted with MeOH. A μ Bondapak C18 column was used, with phosphate buffer (0.01 mol/L of a mixture of NaH2PO4 and Na2HPO4 of pH 6.5)-MeOH (85∶15) as the mobile phase, and detected at a wavelength of 260 nm. The l?near range was 0.2～1.0 μg， r=0.9999.The average recovery was 104.5%.
, 百拇医药
Key words Cordyceps sinensis adenosine
冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.是我国传统名贵中药材之一。近年来，人们对人工发酵虫草菌粉提出了质量评测方法[1～3] ，而针对天然虫草的质量评价方法却显得相对匮乏。为了有效地控制天然虫草的质量，我们拟定以其有效成分之一的核苷类化合物腺苷(adenosine)为检测指标[1，4]，采用HPLC法对西藏和青海虫草进行定量分析，为冬虫夏草的质量评定提供了一种快捷、有效的检测方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器：高效液相色谱仪(PEⅠ-4000)
1.2 试剂：腺苷(中科院上海生化所东风生化技术公司，层析纯)；尿苷(SIGMA)、腺嘌呤(上海丽珠东风生物技术有限公司)；尿嘧啶(上海试剂二厂)，甲醇(GR)，超纯水，其余均为分析纯。
, http://www.100md.com
1.3 试验材料：青海虫草(青海省药检所提供，分别来自玉树州、果洛州、海北州)，西藏虫草(购自西藏药材公司)。
2 方法与结果
2.1 分析条件：色谱柱：μBondapak C18(4.6 mm×250 mm,10 μm)；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.5)-甲醇(85∶15)，流速1.0 mL/min。理论板数按腺苷峰计不低于2 000；检测波长：UV260 nm。
2.2 标准品色谱参数：精密称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷各10 mg于10 mL容量瓶中，加50%乙醇近刻度，超声助溶后放至室温，定容，摇匀。精密移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中，50%乙醇定容，摇匀。将此溶液在拟定条件下分析，腺苷与前一样品峰可达到完全分离，分离度2.41，保留时间9.9 min(见图1)。
, 百拇医药
时间t(min)
1-混合标准品 2-西藏虫草
A-腺苷 B-腺嘌呤 C-尿苷+尿嘧啶
图1 虫草色谱图
2.3 标准曲线制备：精密称取腺苷25 mg于25 mL量瓶中，加50%乙醇近刻度，超声助溶后放至室温，定容，摇匀。准确量取1，2，3，4，5 mL分置于10 mL量瓶中，用同一溶剂定容，在拟定色谱条件下进样20 μL测定峰面积。以峰面积-浓度作图，腺苷在0.2～1.0μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=19169467.51X+338019.1,相关系数r=0.9999。
2.4 样品预处理：称取虫草样品适量，粉碎，过2号筛，备用。精密称取虫草0.5g于索氏提取器中，加甲醇80 mL，回流提取4.5h。提取液蒸干，50%乙醇定容至5 mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液即为供试液。
, 百拇医药
2.5 回收率试验：采用加样回收法。精密称取虫草粉0.25 g于索氏提取套筒中，精密量取100 μg/mL腺苷标准液1 mL于盛有虫草粉的纸筒内，使虫草粉均匀润湿。将加样后的虫草粉连同索氏提取套筒移入恒温干燥箱中，于60℃烘烤2 h，按2.4所述方法处理，以此法平行操作5份样品，进样20 μL后测得腺苷峰面积，求出平均回收率为104.56%，RSD=2.33%。
2.6 精密度试验：取经预处理的样品(以海北州虫草为例)在拟定的色谱条件下连续进样5次，得峰面积，RSD=0.91%。
2.7 重现性试验：以拟定提取方法平行提取5份样品(以西藏虫草为例)，在拟定色谱条件下分别测定腺苷含量，RSD=4.21%。
2.8 样品分析：依拟定方法分别测定4种虫草样品，进样量20 μL，按外标法以峰面积计算腺苷含量。结果见表1，色谱图见图1。
, 百拇医药
表1 样品测定结果 样品
虫体
(mg/g)
子座
(mg/g)
全体
(mg/g)
西藏虫草
0.362
0.582
0.385
青海
海北虫草
, 百拇医药
0.112
0.326
0.201
玉树虫草
0.141
0.339
0.192
果洛虫草
0.166
0.395
0.240
3 讨论
3.1 样品预处理是天然虫草运用HPLC法测定腺苷含量的关键之一。经试验，我们用甲醇索氏回流提取，可完全杜绝蛋白质的溶出，从而保护了色谱柱。经方法学各项试验，结果令人满意。提取时间以4～5 h为宜(见表2)。样品于2 ℃～4 ℃储存，36 h内腺苷含量稳定。
, 百拇医药
3.2 流动相中磷酸盐缓冲液与甲醇配比为90∶10时，标准品各峰分离良好，但腺苷保留时间偏长。最终选定二者配比为85∶15，虽然尿嘧啶与尿苷无法分离，但均可作为杂质并入杂质峰中，样品中腺苷仍可与杂质峰完全分离，保留时间较为适宜，有利于快速分析。
表2 西藏虫草提取时间比较 提取时间(h)
1
2
3
4
5
6
7
腺苷含量(mg/g)
, 百拇医药
0.201
0.233
0.379
0.390
0.391
0.378
0.360
3.3 试验中，我们分别测定了冬虫夏草2个主产省区的4个样品中腺苷的含量。结果表明，青海3个产地的虫草中腺苷含量基本相同，但较西藏虫草明显偏低。比较两省区的虫草样品外观，青海产虫草的虫体显著大于西藏虫草。经腺苷含量比较试验却发现，西藏虫草的虫体与子座中腺苷含量均高于青海虫草。同时，各虫草子座中腺苷的单位含量均高于虫体，这与文献报道相吻合[5]。以上结果对冬虫夏草以虫体大小决定质量优劣的外观评定方法提出置疑。 参考文献
1 姜丽霞，等.中成药，1993，15(5)：33
2 潘锡强，等.中成药，1994，16(10)：12
3 李来生.色谱，1995，133(4)：305
4 毛丽珍，等.中草药，1993，24(9)：467
5 杨世海，等.中草药，1994，25(9)：488
收稿日期：1999-02-06, 百拇医药(吴春敏* 叶榕平**)
单位：福建省药品检验所 福州 350001
关键词：HPLC；冬虫夏草；腺苷
中草药990909 摘 要 采用甲醇为溶剂，提取冬虫夏草及其虫体、子座中的核苷类成分，用HPLC法测定腺苷的含量；色谱条件以μBondapak C18(4.6mm×250mm,10μm)为色谱柱，0.01mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.5)-甲醇(85∶15)为流动相，检测波长UV260nm；r=0.9999，线性范围0.2～1μg，回收率104.5%。
Determination of Adenosine in Dongchongxiachao (Cordyceps sinensis) by HPLC
, http://www.100md.com
Wu Chunmin and Ye Rongping
(Fujian Institute of Drug Control, Fuzhou 350001)
Abstract A method has been developed for the determination of adenosine in Cordycepes sinensis (Berk.) Sacc. by HPLC. Nucleosides in both worm body and stroma were extracted with MeOH. A μ Bondapak C18 column was used, with phosphate buffer (0.01 mol/L of a mixture of NaH2PO4 and Na2HPO4 of pH 6.5)-MeOH (85∶15) as the mobile phase, and detected at a wavelength of 260 nm. The l?near range was 0.2～1.0 μg， r=0.9999.The average recovery was 104.5%.
, 百拇医药
Key words Cordyceps sinensis adenosine
冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.是我国传统名贵中药材之一。近年来，人们对人工发酵虫草菌粉提出了质量评测方法[1～3] ，而针对天然虫草的质量评价方法却显得相对匮乏。为了有效地控制天然虫草的质量，我们拟定以其有效成分之一的核苷类化合物腺苷(adenosine)为检测指标[1，4]，采用HPLC法对西藏和青海虫草进行定量分析，为冬虫夏草的质量评定提供了一种快捷、有效的检测方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器：高效液相色谱仪(PEⅠ-4000)
1.2 试剂：腺苷(中科院上海生化所东风生化技术公司，层析纯)；尿苷(SIGMA)、腺嘌呤(上海丽珠东风生物技术有限公司)；尿嘧啶(上海试剂二厂)，甲醇(GR)，超纯水，其余均为分析纯。
, http://www.100md.com
1.3 试验材料：青海虫草(青海省药检所提供，分别来自玉树州、果洛州、海北州)，西藏虫草(购自西藏药材公司)。
2 方法与结果
2.1 分析条件：色谱柱：μBondapak C18(4.6 mm×250 mm,10 μm)；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.5)-甲醇(85∶15)，流速1.0 mL/min。理论板数按腺苷峰计不低于2 000；检测波长：UV260 nm。
2.2 标准品色谱参数：精密称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷各10 mg于10 mL容量瓶中，加50%乙醇近刻度，超声助溶后放至室温，定容，摇匀。精密移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中，50%乙醇定容，摇匀。将此溶液在拟定条件下分析，腺苷与前一样品峰可达到完全分离，分离度2.41，保留时间9.9 min(见图1)。
, 百拇医药
时间t(min)
1-混合标准品 2-西藏虫草
A-腺苷 B-腺嘌呤 C-尿苷+尿嘧啶
图1 虫草色谱图
2.3 标准曲线制备：精密称取腺苷25 mg于25 mL量瓶中，加50%乙醇近刻度，超声助溶后放至室温，定容，摇匀。准确量取1，2，3，4，5 mL分置于10 mL量瓶中，用同一溶剂定容，在拟定色谱条件下进样20 μL测定峰面积。以峰面积-浓度作图，腺苷在0.2～1.0μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=19169467.51X+338019.1,相关系数r=0.9999。
2.4 样品预处理：称取虫草样品适量，粉碎，过2号筛，备用。精密称取虫草0.5g于索氏提取器中，加甲醇80 mL，回流提取4.5h。提取液蒸干，50%乙醇定容至5 mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液即为供试液。
, 百拇医药
2.5 回收率试验：采用加样回收法。精密称取虫草粉0.25 g于索氏提取套筒中，精密量取100 μg/mL腺苷标准液1 mL于盛有虫草粉的纸筒内，使虫草粉均匀润湿。将加样后的虫草粉连同索氏提取套筒移入恒温干燥箱中，于60℃烘烤2 h，按2.4所述方法处理，以此法平行操作5份样品，进样20 μL后测得腺苷峰面积，求出平均回收率为104.56%，RSD=2.33%。
2.6 精密度试验：取经预处理的样品(以海北州虫草为例)在拟定的色谱条件下连续进样5次，得峰面积，RSD=0.91%。
2.7 重现性试验：以拟定提取方法平行提取5份样品(以西藏虫草为例)，在拟定色谱条件下分别测定腺苷含量，RSD=4.21%。
2.8 样品分析：依拟定方法分别测定4种虫草样品，进样量20 μL，按外标法以峰面积计算腺苷含量。结果见表1，色谱图见图1。
, 百拇医药
表1 样品测定结果 样品
虫体
(mg/g)
子座
(mg/g)
全体
(mg/g)
西藏虫草
0.362
0.582
0.385
青海
海北虫草
, 百拇医药
0.112
0.326
0.201
玉树虫草
0.141
0.339
0.192
果洛虫草
0.166
0.395
0.240
3 讨论
3.1 样品预处理是天然虫草运用HPLC法测定腺苷含量的关键之一。经试验，我们用甲醇索氏回流提取，可完全杜绝蛋白质的溶出，从而保护了色谱柱。经方法学各项试验，结果令人满意。提取时间以4～5 h为宜(见表2)。样品于2 ℃～4 ℃储存，36 h内腺苷含量稳定。
, 百拇医药
3.2 流动相中磷酸盐缓冲液与甲醇配比为90∶10时，标准品各峰分离良好，但腺苷保留时间偏长。最终选定二者配比为85∶15，虽然尿嘧啶与尿苷无法分离，但均可作为杂质并入杂质峰中，样品中腺苷仍可与杂质峰完全分离，保留时间较为适宜，有利于快速分析。
表2 西藏虫草提取时间比较 提取时间(h)
1
2
3
4
5
6
7
腺苷含量(mg/g)
, 百拇医药
0.201
0.233
0.379
0.390
0.391
0.378
0.360
3.3 试验中，我们分别测定了冬虫夏草2个主产省区的4个样品中腺苷的含量。结果表明，青海3个产地的虫草中腺苷含量基本相同，但较西藏虫草明显偏低。比较两省区的虫草样品外观，青海产虫草的虫体显著大于西藏虫草。经腺苷含量比较试验却发现，西藏虫草的虫体与子座中腺苷含量均高于青海虫草。同时，各虫草子座中腺苷的单位含量均高于虫体，这与文献报道相吻合[5]。以上结果对冬虫夏草以虫体大小决定质量优劣的外观评定方法提出置疑。 参考文献
1 姜丽霞，等.中成药，1993，15(5)：33
2 潘锡强，等.中成药，1994，16(10)：12
3 李来生.色谱，1995，133(4)：305
4 毛丽珍，等.中草药，1993，24(9)：467
5 杨世海，等.中草药，1994，25(9)：488
收稿日期：1999-02-06, 百拇医药(吴春敏* 叶榕平**)