鼻咽癌细胞凋亡与血管生成的关系
作者：黄光武 李杰恩 徐志文 邝国乾 韦敏怡
单位：黄光武 李杰恩 徐志文(广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科,广西南宁530021)；邝国乾韦敏怡(广西医科大学第一附属医院病理科,广西南宁530021)
关键词：鼻咽肿癌；凋亡；TUNEL；血管生成
癌症000522
【摘要】目的：探讨鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞凋亡及瘤内血管生成与患者预后的关系。方法：采用TdT酶介导的生物素化dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)和免疫组化S-P法，分别检测20例正常鼻咽粘膜组织及73例NPC组织的细胞凋亡率(apoptosis rate，AR)、瘤内微血管密度(microvessel density,MVD)及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。NPC复发转移组24人，未复发组49人。结果：正常鼻咽粘膜AR显著高于NPC组织(P<0.01);NPC复发转移组的MVD及VEGF显著高于未复发组(P<0.05)，而AR则显著低于未复发组(P<0.05)；MVD与VEGF、MVD与AR呈正相关(P<0.05)。结论：在NPC发展过程中，细胞凋亡明显受到抑制；VEGF是血管生成的重要因子,并通过促进血管生成影响患者的预后；细胞凋亡与NPC患者的预后有关。
, 百拇医药
中图分类号：R739.4文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0468-03
Relationship between apoptosis and angiogenesis in nasopharyngeal carcinoma
HUANG Guang-wu， LI Jie-en， XU Zhi-wen, et al.
(Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021,P.R.China)
【Abstract】 Objective： To investigate the relationship among apoptosis, intratumoral microvessel density (MVD) and prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC) patient. Methods： Using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP biotin nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry S-P method, the apoptotic rate (AR) (number of apoptotic cells/total number of tumor cells), MVD and VEGF expression were examined in normal nasopharyngeal mucosa (20 cases) and NPC tissues (73 cases including 24 recurrent metastatic cases and 49 nonrecurrent cases). Results： Few apoptotic cells were found in NPC. The AR of normal tissues was significantly higher than that of NPC(P<0.01). MVD and VEGF of recurrent nasopharyngeal carcinoma (R-NPC) were higher than that of nonrecurrent nasopharyngeal carcinoma (NR-NPC) (P< 0.05) , while AR was lower in R-NPC than in NR-NPC. Expression of VEGF significantly correlated with MVD, and AR with VEGF (P< 0.05). Conclusions： Apoptosis is inhibited during the process of nasopharyngeal carcinogenesis. VEGF is involved in the angiogenesis of NPC, and angiogenesis influences the prognosis of the patient. Angiogenesis and apoptosis may be useful to predict the prognosis of NPC patients.
, 百拇医药
Key words： Nasopharyngeal neoplasms; Apoptosis; TUNEL; Angiogenesis
近来研究表明，细胞凋亡(apoptosis)及肿瘤内微血管密度(microvesseldensity,MVD)与肿瘤的发生、发展、治疗及预后关系密切，因而成为肿瘤研究的新热点。为探讨细胞凋亡及MVD在鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)发生发展中的作用及其与患者预后的关系，我们采用TUNEL原位末端标记技术和免疫组化S-P法对福尔马林固定、石蜡包埋的NPC组织
1材料与方法
1.1临床资料
收集广西医科大学第一附院1995年～1996年收治的73例NPC患者的临床资料及石蜡标本，男54例，女19例，年龄17～73岁，平均42岁。随访3年，其中19人因复发转移死亡，5人失访。另取20例鼻咽粘膜慢性炎组织作对照组。
, 百拇医药
1.2试剂
采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒。F8-RA(第八因子相关抗原)、VEGF单抗及免疫组化试剂盒等购自北京中山生物公司。
1.3染色
组织连续切片,采用TUNEL法检测NPC及鼻咽粘膜慢性炎症组织的细胞凋亡率(apoptosisrate,AR)、MVD及血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表达，严格按凋亡检测试剂盒说明书操作，并作阳性及阴性对照。阴性对照为省去TUNEL液；阳性对照用DNA酶I消化组织(20分钟，室温)。VEGF及MVD检测则采用免疫组化S-P法，F8-RA、VEGF工作浓度均为1∶50。苏木素复染。
1.4数据处理
使用PEMS(华西医科大学统计学教研室)统计软件包对数据进行统计学处理，t,t’检验及等级相关分析。
, 百拇医药
2结果
2.1结果判断
TUNEL标记的阳性细胞判断按试剂盒说明，即光镜下散在的细胞核被标记成红色的细胞即为凋亡细胞。AR以光镜下计算1000个细胞中的阳性细胞数来表示。VEGF阳性细胞的细胞浆呈棕黄色。在同一NPC组织的连续切片中，可见凋亡的癌细胞被坚固红染成红色，散在分布于癌细胞中；VEGF除癌细胞阳性外，亦可出现在间质淋巴细胞；血管内皮细胞被F8-RA染成棕黄色，癌组织中微血管分布不均，主要分布于癌巢间质内，而癌巢内血管分布很少(图1～3)。MVD计数方法参照文献[1]。结果表明：NPC组织的MVD、VEGF的表达明显高于正常鼻咽粘膜组织，而AR则明显低于正常鼻咽粘膜组织(P<0.01)。见表1。
表1正常鼻咽粘膜及癌组织的AR,MVD
和VEGF表达(
±S) 组别
, 百拇医药
n
AR
MVD
VEGF
P值
正常鼻咽粘膜
20
3.17±1.63
2.63±0.96
1 0.33±0.48
<0.01
NPC
73
, 百拇医药
1.72±1.21
4.58±4.78
1.95±0.79
2.2AR及MVD、VEGF表达与临床相关性
NPC细胞凋亡与病灶大小有关；复发或转移死亡患者(19例)的AR明显低于无复发转移者(P<0.05)。MVD、VEGF表达与NPC临床分期相关，进展期(45例)较早期高 ,复发或转移死亡患者的MVD、VEGF明显高于未复发转移者(P<0.05)。
图1 红色为坚固红衬染的NPC凋亡细胞，散在分布于癌细胞中TUNEL×400
, 百拇医药
图2 NPC细胞VEGF蛋白阳性的细胞浆及细胞核呈棕黄色S-P×200
图3 NPC中的MVD，多分布于癌间质S-P×200
2.3 AR及MVD、VEGF之间的相关性AR与VEGF(R=0.45、P<0.05)，MVD与VEGF( R="0."73，P<0.01)均呈正相关(等级相关分析)。
3讨论
细胞凋亡是细胞死亡的基本形式之一，不仅在正常的生理状态具有重要作用，而且与多种疾病的发生发展有密切关系[2]。近年来研究认为细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生，是由于细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结果[3],细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以阻碍肿瘤迅速增长。我们采用原位细胞凋亡染色技术(TUNEL)发现在NPC组织中出现自发的癌细胞凋亡，且多见于癌间质，周围常有淋巴细胞浸润。尽管其凋亡率明显低于正常鼻咽粘膜组织，但说明NPC患者肿瘤内细胞凋亡机制仍然存在，NPC的发生可能为细胞过度增殖，细胞凋亡减少的结果。并推测其细胞凋亡的发生可能与淋巴细胞的免疫诱导作用有关。张帆等[4]证实IgM可诱导B淋巴瘤Daudi细胞凋亡。但在免疫缺陷的鼻咽癌荷瘤裸鼠的移植瘤组织中却发现大量的凋亡细胞[5],这种瘤细胞凋亡不可能是细胞免疫的结果，而认为为凋亡调控分子参与的结果[6]。
, 百拇医药
血管生成是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。它受到血管生成因子的调控，以VEGF的促血管生成作用最强。VEGF表达的调控较为复杂，雌激素、腺苷酸环化酶激活剂、蛋白激酶C以及缺氧等因素均可诱导VEGF的表达，此外，某些癌基因如ras基因、p53基因亦可诱导VEGF的表达。本研究发现，NPC组织的VEGF及MVD明显高于正常鼻咽粘膜组织，而进展期较早期高，VEGF与MVD呈正相关，说明VEGF是NPC血管生成的重要因子，并通过促进血管生成影响患者的预后。
通过对NPC组织的连续切片观察发现，部分凋亡细胞周围的癌细胞出现VEGF的高表达，说明在肿瘤组织中，血管形成不足会导致局部组织缺氧，一方面诱导VEGF的表达以刺激新的血管生成，另一方面导致癌细胞凋亡的增加。但同时也发现，某些VEGF表达很高的NPC组织中却很少发现凋亡细胞，说明癌细胞对组织缺氧会产生耐受，而正是这些耐缺氧的细胞使得临床上治疗出现困难，亦是复发转移的根源。因此，我们认为在NPC组织中，局部组织缺氧是诱导VEGF高表达的重要因素，同时，NPC出现自发的癌细胞凋亡现象，也与细胞缺氧有关，缺氧与凋亡调控基因的共同作用使癌细胞发生凋亡，而不是淋巴细胞的免疫诱导作用所致。至于凋亡细胞周围出现的淋巴细胞浸润现象，推测为细胞凋亡后所出现的免疫反应。
, 百拇医药
我们发现，NPC中AR，MVD及VEGF与病灶大小及预后相关。本组病例随访3年，经治疗后NPC复发或转移死亡者的MVD及VEGF明显高于无复发转移组(P<0.05)，而AR则明显低于无复发转移组(P<0.05)，说明AR高的患者，对治疗亦较敏感，疗效亦好，可以作为判断疗效及预后的指标。
[参考文献]
1，Bosari S,lee AK,Delellis RA,et al. Microvessel guantitation and prognosis in invasive breast carcinoma [J]. Hum Pathol,1992,23:755～ 761.
2，Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease [J]. Science,1995,267:1465～ 1471.
, 百拇医药
3，Cerard Even, Trevor Littlewood. A matter of life and cell death [J]. Science,1998,281:1317～ 1321.
4，张帆，朱红霞，全兰萍,等.IgM诱导人B淋巴瘤Daudi细胞凋亡[J].癌症，1999，18(2)：121～125.
5，李智，傅茂福，宗永生.鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤中癌细胞的凋亡[J].癌症，1999，18：172～175.
6，Henderson S, Rowe M,Gregory C， et al. Induction of bcl-2 expression by Epstein-Bair virus latent membrane protein 1 protects infected B cells from programmed cell death [J]. Cell， 1991,65(7):1107～ 1115.
收稿日期：1999-06-07；修回日期：1999-08-17, http://www.100md.com
单位：黄光武 李杰恩 徐志文(广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科,广西南宁530021)；邝国乾韦敏怡(广西医科大学第一附属医院病理科,广西南宁530021)
关键词：鼻咽肿癌；凋亡；TUNEL；血管生成
癌症000522
【摘要】目的：探讨鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞凋亡及瘤内血管生成与患者预后的关系。方法：采用TdT酶介导的生物素化dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)和免疫组化S-P法，分别检测20例正常鼻咽粘膜组织及73例NPC组织的细胞凋亡率(apoptosis rate，AR)、瘤内微血管密度(microvessel density,MVD)及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。NPC复发转移组24人，未复发组49人。结果：正常鼻咽粘膜AR显著高于NPC组织(P<0.01);NPC复发转移组的MVD及VEGF显著高于未复发组(P<0.05)，而AR则显著低于未复发组(P<0.05)；MVD与VEGF、MVD与AR呈正相关(P<0.05)。结论：在NPC发展过程中，细胞凋亡明显受到抑制；VEGF是血管生成的重要因子,并通过促进血管生成影响患者的预后；细胞凋亡与NPC患者的预后有关。
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中图分类号：R739.4文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0468-03
Relationship between apoptosis and angiogenesis in nasopharyngeal carcinoma
HUANG Guang-wu， LI Jie-en， XU Zhi-wen, et al.
(Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021,P.R.China)
【Abstract】 Objective： To investigate the relationship among apoptosis, intratumoral microvessel density (MVD) and prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC) patient. Methods： Using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP biotin nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry S-P method, the apoptotic rate (AR) (number of apoptotic cells/total number of tumor cells), MVD and VEGF expression were examined in normal nasopharyngeal mucosa (20 cases) and NPC tissues (73 cases including 24 recurrent metastatic cases and 49 nonrecurrent cases). Results： Few apoptotic cells were found in NPC. The AR of normal tissues was significantly higher than that of NPC(P<0.01). MVD and VEGF of recurrent nasopharyngeal carcinoma (R-NPC) were higher than that of nonrecurrent nasopharyngeal carcinoma (NR-NPC) (P< 0.05) , while AR was lower in R-NPC than in NR-NPC. Expression of VEGF significantly correlated with MVD, and AR with VEGF (P< 0.05). Conclusions： Apoptosis is inhibited during the process of nasopharyngeal carcinogenesis. VEGF is involved in the angiogenesis of NPC, and angiogenesis influences the prognosis of the patient. Angiogenesis and apoptosis may be useful to predict the prognosis of NPC patients.
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Key words： Nasopharyngeal neoplasms; Apoptosis; TUNEL; Angiogenesis
近来研究表明，细胞凋亡(apoptosis)及肿瘤内微血管密度(microvesseldensity,MVD)与肿瘤的发生、发展、治疗及预后关系密切，因而成为肿瘤研究的新热点。为探讨细胞凋亡及MVD在鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)发生发展中的作用及其与患者预后的关系，我们采用TUNEL原位末端标记技术和免疫组化S-P法对福尔马林固定、石蜡包埋的NPC组织
1材料与方法
1.1临床资料
收集广西医科大学第一附院1995年～1996年收治的73例NPC患者的临床资料及石蜡标本，男54例，女19例，年龄17～73岁，平均42岁。随访3年，其中19人因复发转移死亡，5人失访。另取20例鼻咽粘膜慢性炎组织作对照组。
, 百拇医药
1.2试剂
采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒。F8-RA(第八因子相关抗原)、VEGF单抗及免疫组化试剂盒等购自北京中山生物公司。
1.3染色
组织连续切片,采用TUNEL法检测NPC及鼻咽粘膜慢性炎症组织的细胞凋亡率(apoptosisrate,AR)、MVD及血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表达，严格按凋亡检测试剂盒说明书操作，并作阳性及阴性对照。阴性对照为省去TUNEL液；阳性对照用DNA酶I消化组织(20分钟，室温)。VEGF及MVD检测则采用免疫组化S-P法，F8-RA、VEGF工作浓度均为1∶50。苏木素复染。
1.4数据处理
使用PEMS(华西医科大学统计学教研室)统计软件包对数据进行统计学处理，t,t’检验及等级相关分析。
, 百拇医药
2结果
2.1结果判断
TUNEL标记的阳性细胞判断按试剂盒说明，即光镜下散在的细胞核被标记成红色的细胞即为凋亡细胞。AR以光镜下计算1000个细胞中的阳性细胞数来表示。VEGF阳性细胞的细胞浆呈棕黄色。在同一NPC组织的连续切片中，可见凋亡的癌细胞被坚固红染成红色，散在分布于癌细胞中；VEGF除癌细胞阳性外，亦可出现在间质淋巴细胞；血管内皮细胞被F8-RA染成棕黄色，癌组织中微血管分布不均，主要分布于癌巢间质内，而癌巢内血管分布很少(图1～3)。MVD计数方法参照文献[1]。结果表明：NPC组织的MVD、VEGF的表达明显高于正常鼻咽粘膜组织，而AR则明显低于正常鼻咽粘膜组织(P<0.01)。见表1。
表1正常鼻咽粘膜及癌组织的AR,MVD
和VEGF表达(
±S) 组别, 百拇医药
n
AR
MVD
VEGF
P值
正常鼻咽粘膜
20
3.17±1.63
2.63±0.96
1 0.33±0.48
<0.01
NPC
73
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1.72±1.21
4.58±4.78
1.95±0.79
2.2AR及MVD、VEGF表达与临床相关性
NPC细胞凋亡与病灶大小有关；复发或转移死亡患者(19例)的AR明显低于无复发转移者(P<0.05)。MVD、VEGF表达与NPC临床分期相关，进展期(45例)较早期高 ,复发或转移死亡患者的MVD、VEGF明显高于未复发转移者(P<0.05)。
图1 红色为坚固红衬染的NPC凋亡细胞，散在分布于癌细胞中TUNEL×400
, 百拇医药
图2 NPC细胞VEGF蛋白阳性的细胞浆及细胞核呈棕黄色S-P×200
图3 NPC中的MVD，多分布于癌间质S-P×200
2.3 AR及MVD、VEGF之间的相关性AR与VEGF(R=0.45、P<0.05)，MVD与VEGF( R="0."73，P<0.01)均呈正相关(等级相关分析)。
3讨论
细胞凋亡是细胞死亡的基本形式之一，不仅在正常的生理状态具有重要作用，而且与多种疾病的发生发展有密切关系[2]。近年来研究认为细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生，是由于细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结果[3],细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以阻碍肿瘤迅速增长。我们采用原位细胞凋亡染色技术(TUNEL)发现在NPC组织中出现自发的癌细胞凋亡，且多见于癌间质，周围常有淋巴细胞浸润。尽管其凋亡率明显低于正常鼻咽粘膜组织，但说明NPC患者肿瘤内细胞凋亡机制仍然存在，NPC的发生可能为细胞过度增殖，细胞凋亡减少的结果。并推测其细胞凋亡的发生可能与淋巴细胞的免疫诱导作用有关。张帆等[4]证实IgM可诱导B淋巴瘤Daudi细胞凋亡。但在免疫缺陷的鼻咽癌荷瘤裸鼠的移植瘤组织中却发现大量的凋亡细胞[5],这种瘤细胞凋亡不可能是细胞免疫的结果，而认为为凋亡调控分子参与的结果[6]。
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血管生成是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。它受到血管生成因子的调控，以VEGF的促血管生成作用最强。VEGF表达的调控较为复杂，雌激素、腺苷酸环化酶激活剂、蛋白激酶C以及缺氧等因素均可诱导VEGF的表达，此外，某些癌基因如ras基因、p53基因亦可诱导VEGF的表达。本研究发现，NPC组织的VEGF及MVD明显高于正常鼻咽粘膜组织，而进展期较早期高，VEGF与MVD呈正相关，说明VEGF是NPC血管生成的重要因子，并通过促进血管生成影响患者的预后。
通过对NPC组织的连续切片观察发现，部分凋亡细胞周围的癌细胞出现VEGF的高表达，说明在肿瘤组织中，血管形成不足会导致局部组织缺氧，一方面诱导VEGF的表达以刺激新的血管生成，另一方面导致癌细胞凋亡的增加。但同时也发现，某些VEGF表达很高的NPC组织中却很少发现凋亡细胞，说明癌细胞对组织缺氧会产生耐受，而正是这些耐缺氧的细胞使得临床上治疗出现困难，亦是复发转移的根源。因此，我们认为在NPC组织中，局部组织缺氧是诱导VEGF高表达的重要因素，同时，NPC出现自发的癌细胞凋亡现象，也与细胞缺氧有关，缺氧与凋亡调控基因的共同作用使癌细胞发生凋亡，而不是淋巴细胞的免疫诱导作用所致。至于凋亡细胞周围出现的淋巴细胞浸润现象，推测为细胞凋亡后所出现的免疫反应。
, 百拇医药
我们发现，NPC中AR，MVD及VEGF与病灶大小及预后相关。本组病例随访3年，经治疗后NPC复发或转移死亡者的MVD及VEGF明显高于无复发转移组(P<0.05)，而AR则明显低于无复发转移组(P<0.05)，说明AR高的患者，对治疗亦较敏感，疗效亦好，可以作为判断疗效及预后的指标。
[参考文献]
1，Bosari S,lee AK,Delellis RA,et al. Microvessel guantitation and prognosis in invasive breast carcinoma [J]. Hum Pathol,1992,23:755～ 761.
2，Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease [J]. Science,1995,267:1465～ 1471.
, 百拇医药
3，Cerard Even, Trevor Littlewood. A matter of life and cell death [J]. Science,1998,281:1317～ 1321.
4，张帆，朱红霞，全兰萍,等.IgM诱导人B淋巴瘤Daudi细胞凋亡[J].癌症，1999，18(2)：121～125.
5，李智，傅茂福，宗永生.鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤中癌细胞的凋亡[J].癌症，1999，18：172～175.
6，Henderson S, Rowe M,Gregory C， et al. Induction of bcl-2 expression by Epstein-Bair virus latent membrane protein 1 protects infected B cells from programmed cell death [J]. Cell， 1991,65(7):1107～ 1115.
收稿日期：1999-06-07；修回日期：1999-08-17, http://www.100md.com