白血病WT1基因表达及其临床意义
http://www.100md.com
南京医科大学学报 2000年第1期第20卷 论著
作者：钱思轩 朱广荣 夏薇 盛瑞兰
单位：南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029
关键词：白血病；WT1基因；微小残留病
南京医科大学学报000106
摘 要 目的 探讨WT1基因mRNA表达与白血病的关系及其意义。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定68例不同类型白血病及其处于不同疾病阶段的患者WT1基因的表达。结果 65%初治和复发急性白血病者WT1表达阳性，而治疗缓解期12例中仅1例(8%)表达为阳性。16例慢性粒细胞白血病(CML)中的7例(44%)WT1表达阳性，其中4例急变者全部为阳性，10名正常人及10例非血液病患者的WT1表达阴性。结论 WT1基因在各类型白血病中均能表达，表达水平与体内白血病细胞的数量有关，亦与白血病的病程进展等相关。因此，RT-PCR可作为化疗和骨髓移植后微小残留病(MRD)检测的敏感指标，也是研究白血病发生、发展和预测预后的手段。
, 百拇医药
中图号 R557
Expression of the Wilms′ Tumor Gene (WT1) in Leukemia Patients and Its Clinical Significance
Qian Sixuan Zhu Guangrong Xia Wei
(Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To evaluate the relationship between WT1 gene expression and leukemia, as well as its significance. Methods Expression of WT1 gene was measured with RT-PCR in 68 cases of leukemia at different disease-developing stage. Results Expression of WT1 gene was revealed in 65% newly diagnosed and relapsed acute leukemia and 44% chronic myelogenous leukemia (CML). All of 4 patients with CML at blast crisis stage had positive expresion of WT1. As contrast, neither 10 volunteers, nor 10 patients with no-hematological disease were WT1 positive. Conclusion Expression of WT1 gene was revealed in all kinds of leukemia patients and associated with quantity of leukemic cells. RT-PCR was so far the most sensitive method for minimum residual disease (MRD) detection after chemotherapy and bone marrow transplantation. And it was also useful in pathogenesis study and prognotic evaluation in leukemia.
, 百拇医药
Key words leukemia; WT1 gene; minimal residual disease
WT1基因(Wilms tumor gene)是首先从Wilms瘤分离出来的肿瘤抑制基因，位于染色体11p13[1，2]，该基因除了调节胚胎肾、生殖系统组织的繁殖、分化作用外，近年来研究发现，其对白血病的发生、发展及预后有一定作用，为此，我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了不同种类白血病患者WT1基因表达水平，以探讨其在白血病发生发展中的作用及临床意义。
1 对象和方法
1.1 对象
68例白血病患者均符合FAB协作组诊断标准。其中男40例，女28例，年龄3～74岁，中位年龄42岁。急性髓系白血病(AML)39例[初治22例，复发5例，缓解期(CR期，缓解时间2个月～5年)11例，骨髓增生异常综合征(MDS)转化型1例]，急性淋巴细胞白血病(ALL)13例(初治11例，复发1例，缓解期1例)，慢性粒细胞白血病(CML)17例(其中加速期1例，急变期4例)。10名正常人外周血及10例非血液病患者骨髓作为正常对照，K562(慢粒急性白血病细胞系)细胞作为阳性对照。
, 百拇医药
1.2 方法
单个核细胞(MNC)的分离及总RNA的提取：患者或正常人骨髓2 ml或外周血5～8 ml，肝素抗凝。
经淋巴细胞分离液(Ficoll，相对密度1.077)分离，1 500 r/min离心20 min，取界面层MNC，PBS洗2次，直接提取RNA或-80℃保存备用。
RNA的提取：采用美国GIBCO公司的TNZOL一步法提取细胞总RNA。紫外分光光度仪测定RNA的量。
cDNA合成及PCR扩增[3～5]：引物由美国GIBCO公司合成。WT1引物包括7～10个外显子编码的锌指结构区域[3]。上游引物：5′-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3′；下游引物：5′-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3′。扩增产物的长度为481 bp。逆转录反应：取1 μg总RNA，65℃加热5 min，加入5×RT缓冲液10 μl, RNasin 80U,4种dNTP(三磷酸去氧核酸核苷)(10 mmol/L)混和液10 μl,3′端引物1 μl,AMV10U，总体积50 μl。42℃反应60 min，96℃ 5 min，迅速置-20℃备用。PCR：取cDNA 5 μl依次加入10×缓冲液2.5 μl，4种dNTP 2 μl, 20 pmol的WT1引物，Taq酶1U，25 mmol/L MgCl2 2 ml，总体积25 μl。扩增条件：94℃变性1 min，64℃退火1 min, 72℃延伸2 min，共34个周期。
, 百拇医药
PCR产物分析：取PCR产物5 μl，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(含0.5 μg/ml溴化乙锭)50 min，紫外透射仪下观察结果并照相。
2 结 果
2.1 正常人及白血病WT1 mRNA的基础表达
68例白血病患者中，34例WT1 mRNA表达阳性；39例AML中19例(49%)表达阳性，28例初治和复发AML中有18例(64%)表达阳性，而11例CR期患者只有1例(9%)表达阳性；13例ALL中8例(62%)表达阳性，12例初治和复发ALL中有8例(67%)表达阳性，1例CR期者表达为阴性；16例CML中7例(44%)表达阳性，其中4例急变期均表达阳性。10例正常人外周血及10例非血液病患者骨髓细胞中均未检测WT1 mRNA的表达。阴性和阳性结果判断如图1。
, http://www.100md.com
M：Marker PGEM72f(+)DNA/HaeⅢ; 1:阳性对照；2～4：白血病患者；5：正常人的阴性对照。
图1 WT1基因在正常人和白血病患者中的表达
2.2 WT1与AML亚型的关系
WT1在AML各亚型中都能表达，在28例初治和复发AML中3/5(60%)M1\,8/11(73%)M2\,3/7(43%)M3 WT1表达阳性。而1例M4\,1/2M5\,1/2M6 WT1表达阳性。
2.3 WT1与白血病转归的关系
7例急性白血病治疗前WT1表达阳性的患者，在治疗达CR后4例WT1表达阴性，1例明显降低。1例治疗前后WT1表达均阴性。2例缓解者WT1持续阴性。4例CR期WT1阴性患者复发后WT1表达阳性；1例ALL WT1表达阳性，而此时临床、骨髓尚处于CR期，2周后该患者临床、骨髓才提示复发；1例CML在加速期WT1表达阴性，急变时WT1表达阳性。
, 百拇医药
2.4 RT-PCR检测WT1的灵敏性
取表达阳性的K562细胞与正常人外周血MNC按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106倍比稀释，然后用RT-PCR测定WT1 mRNA，结果显示测定的灵敏性为10-3～10-4(图2)。
图2 WT1基因表达检测的灵敏性(K562细胞)
3 讨 论
WT1基因是从Wilms瘤细胞的染色体11p13位分离出来的Wilms瘤基因，但近年来国内外研究均表明WT1在人类白血病细胞中有高度表达，并对白血病细胞增殖、分化起重要作用，并与白血病的发生、发展及预后有一定关系[3]。本文研究表明，10例正常人及10例非血液病患者均未检测到WT1基因；68例白血病患者中，有19/39(49%)AML WT1表达阳性，其中18/28(64%)为初治与复发；8/13(62%)ALL WT1表达阳性，其中8/12(67%)为初治与复发，急性白血病CR者WT1呈低表达1/12(8%);7/16(44%)CML WT1表达阳性，其中4例慢粒急变期全部为阳性。上述结果与国内外文献报道相一致[4～6]。有学者认为在AML中，M0\,M1\,M2\,M3 WT1高表达，而M4、M5表达较低；我们的研究也发现，WT1在M1、M2、M3尤其M1、M2有较高表达。其余类型AML因例数相对较少而需进一步研究探讨。这些研究结果表明WT1在白血病各类型中均能表达。
, 百拇医药
白血病患者化疗及骨髓移植治疗的关键在于不能确定体内白血病细胞的数量，因此，准确、敏感地检测微小残留病(MRD)对于进一步治疗具有重要价值[7～9]。有学者指出，利用WT1进行MRD检测可以比临床提前4～32周预测复发，对指导临床治疗有重要意义[8，9]。RT-PCR技术为检测MRD最灵敏手段。我们将K562细胞和正常细胞分别倍比稀释，然后应用RT-PCR检测WT1基因表达，其检出率达10-4水平，与测定白血病细胞的其他特异性基因标记相似。由于检测其他特异性基因标记的应用范围很窄，如bcr/abl基因及PML/RARα基因，只限于CML和M3型白血病，而WT1在各类白血病中均有表达，测定WT1的表达以监测残留白血病细胞的方法几乎适用于所有的白血病患者。故WT1可用来监测白血病患者MRD，作为判断预后及监测MRD的敏感指标。本文对8例白血病患者治疗前后WT1基因表达进行观察，发现治疗前7例WT1阳性者中，完全缓解后有4例WT1表达转为阴性，1例表达有明显下降。同时我们还观察到，5例CR期WT1阴性的患者，复发后其WT1表达转为阳性；2例缓解者WT1表达持续阴性；1例临床、骨髓提示缓解而WT1表达阴性的患者，2周后临床、骨髓提示复发；1例CML加速期WT1表达阴性，急变期转为阳性。这些结果提示，WT1的表达可以反映白血病的发生、发展，从而指导临床治疗；而在慢性与加速期WT1表达阳性者更需要密切观察其疾病的演变。
, 百拇医药
综上所述，检测WT1表达对研究白血病的发生、发展及监测MRD和判断白血病病人预后、早期预测复发、制定个体化治疗方案及其化疗与骨髓移植治疗后疗效的随访观察等均有重要作用。
参 考 文 献
1，Call KM, Glaser T, Ito CY, et al. Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosom 11 Wilms′ tumor locus. Cell, 1990,60:509
2，Gessler M, Poustka A, Cavenee W, et al. Homozygous deletion in Wilms tumors of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature, 1990,343:774
, http://www.100md.com
3，Fraizer GC, Patmasiriwat P, Zhang X, et al. Expression of the tumor suppressor gene WT1 in both human and mouse marrow. Blood, 1995,86:4704
4，Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994,84:3071
5，郭晓楠，徐世荣，董作仁，等.白血病患者WT1基因的表达及其与预后及多药耐药的关系.中华血液学杂志，1999，20：69
6，Miwa H, Beran M, Saunders GF, et al. Expression of the Wilms′ tumor gene (WT1) in human leukemias. Leukemia, 1992,6:405
, http://www.100md.com
7，Patmasiriwat P, Fraizer GC, Claxton D, et al. Expression pattern of WT1 and GATA-1 in AML with chromosome 16q22 abnormalities. Leukemia, 1996,10:1127
8，Inoue K, Ogawa H, Yamagami T, et al. Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 expression levels. Blood, 1996,88:2267
9，Miething C, Weidmann E, Maurer U, et al. Relevance of WT1 messenger-RNA expression concerning prognosis and clinical monitoring of acute myeloid leukemia. Blood, 1996,88(10，Suppl 1):564
10，Miyagi, T, Ahuja H, Kubota T, et al. Expression of the condidate Wilms′ tumor gene, WT1, in human leukemia cells. Leukemia, 1993,7:970
(1999-06-11收稿), 百拇医药
单位：南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029
关键词：白血病；WT1基因；微小残留病
南京医科大学学报000106
摘 要 目的 探讨WT1基因mRNA表达与白血病的关系及其意义。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定68例不同类型白血病及其处于不同疾病阶段的患者WT1基因的表达。结果 65%初治和复发急性白血病者WT1表达阳性，而治疗缓解期12例中仅1例(8%)表达为阳性。16例慢性粒细胞白血病(CML)中的7例(44%)WT1表达阳性，其中4例急变者全部为阳性，10名正常人及10例非血液病患者的WT1表达阴性。结论 WT1基因在各类型白血病中均能表达，表达水平与体内白血病细胞的数量有关，亦与白血病的病程进展等相关。因此，RT-PCR可作为化疗和骨髓移植后微小残留病(MRD)检测的敏感指标，也是研究白血病发生、发展和预测预后的手段。
, 百拇医药
中图号 R557
Expression of the Wilms′ Tumor Gene (WT1) in Leukemia Patients and Its Clinical Significance
Qian Sixuan Zhu Guangrong Xia Wei
(Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To evaluate the relationship between WT1 gene expression and leukemia, as well as its significance. Methods Expression of WT1 gene was measured with RT-PCR in 68 cases of leukemia at different disease-developing stage. Results Expression of WT1 gene was revealed in 65% newly diagnosed and relapsed acute leukemia and 44% chronic myelogenous leukemia (CML). All of 4 patients with CML at blast crisis stage had positive expresion of WT1. As contrast, neither 10 volunteers, nor 10 patients with no-hematological disease were WT1 positive. Conclusion Expression of WT1 gene was revealed in all kinds of leukemia patients and associated with quantity of leukemic cells. RT-PCR was so far the most sensitive method for minimum residual disease (MRD) detection after chemotherapy and bone marrow transplantation. And it was also useful in pathogenesis study and prognotic evaluation in leukemia.
, 百拇医药
Key words leukemia; WT1 gene; minimal residual disease
WT1基因(Wilms tumor gene)是首先从Wilms瘤分离出来的肿瘤抑制基因，位于染色体11p13[1，2]，该基因除了调节胚胎肾、生殖系统组织的繁殖、分化作用外，近年来研究发现，其对白血病的发生、发展及预后有一定作用，为此，我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了不同种类白血病患者WT1基因表达水平，以探讨其在白血病发生发展中的作用及临床意义。
1 对象和方法
1.1 对象
68例白血病患者均符合FAB协作组诊断标准。其中男40例，女28例，年龄3～74岁，中位年龄42岁。急性髓系白血病(AML)39例[初治22例，复发5例，缓解期(CR期，缓解时间2个月～5年)11例，骨髓增生异常综合征(MDS)转化型1例]，急性淋巴细胞白血病(ALL)13例(初治11例，复发1例，缓解期1例)，慢性粒细胞白血病(CML)17例(其中加速期1例，急变期4例)。10名正常人外周血及10例非血液病患者骨髓作为正常对照，K562(慢粒急性白血病细胞系)细胞作为阳性对照。
, 百拇医药
1.2 方法
单个核细胞(MNC)的分离及总RNA的提取：患者或正常人骨髓2 ml或外周血5～8 ml，肝素抗凝。
经淋巴细胞分离液(Ficoll，相对密度1.077)分离，1 500 r/min离心20 min，取界面层MNC，PBS洗2次，直接提取RNA或-80℃保存备用。
RNA的提取：采用美国GIBCO公司的TNZOL一步法提取细胞总RNA。紫外分光光度仪测定RNA的量。
cDNA合成及PCR扩增[3～5]：引物由美国GIBCO公司合成。WT1引物包括7～10个外显子编码的锌指结构区域[3]。上游引物：5′-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3′；下游引物：5′-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3′。扩增产物的长度为481 bp。逆转录反应：取1 μg总RNA，65℃加热5 min，加入5×RT缓冲液10 μl, RNasin 80U,4种dNTP(三磷酸去氧核酸核苷)(10 mmol/L)混和液10 μl,3′端引物1 μl,AMV10U，总体积50 μl。42℃反应60 min，96℃ 5 min，迅速置-20℃备用。PCR：取cDNA 5 μl依次加入10×缓冲液2.5 μl，4种dNTP 2 μl, 20 pmol的WT1引物，Taq酶1U，25 mmol/L MgCl2 2 ml，总体积25 μl。扩增条件：94℃变性1 min，64℃退火1 min, 72℃延伸2 min，共34个周期。
, 百拇医药
PCR产物分析：取PCR产物5 μl，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(含0.5 μg/ml溴化乙锭)50 min，紫外透射仪下观察结果并照相。
2 结 果
2.1 正常人及白血病WT1 mRNA的基础表达
68例白血病患者中，34例WT1 mRNA表达阳性；39例AML中19例(49%)表达阳性，28例初治和复发AML中有18例(64%)表达阳性，而11例CR期患者只有1例(9%)表达阳性；13例ALL中8例(62%)表达阳性，12例初治和复发ALL中有8例(67%)表达阳性，1例CR期者表达为阴性；16例CML中7例(44%)表达阳性，其中4例急变期均表达阳性。10例正常人外周血及10例非血液病患者骨髓细胞中均未检测WT1 mRNA的表达。阴性和阳性结果判断如图1。
, http://www.100md.com
M：Marker PGEM72f(+)DNA/HaeⅢ; 1:阳性对照；2～4：白血病患者；5：正常人的阴性对照。
图1 WT1基因在正常人和白血病患者中的表达
2.2 WT1与AML亚型的关系
WT1在AML各亚型中都能表达，在28例初治和复发AML中3/5(60%)M1\,8/11(73%)M2\,3/7(43%)M3 WT1表达阳性。而1例M4\,1/2M5\,1/2M6 WT1表达阳性。
2.3 WT1与白血病转归的关系
7例急性白血病治疗前WT1表达阳性的患者，在治疗达CR后4例WT1表达阴性，1例明显降低。1例治疗前后WT1表达均阴性。2例缓解者WT1持续阴性。4例CR期WT1阴性患者复发后WT1表达阳性；1例ALL WT1表达阳性，而此时临床、骨髓尚处于CR期，2周后该患者临床、骨髓才提示复发；1例CML在加速期WT1表达阴性，急变时WT1表达阳性。
, 百拇医药
2.4 RT-PCR检测WT1的灵敏性
取表达阳性的K562细胞与正常人外周血MNC按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106倍比稀释，然后用RT-PCR测定WT1 mRNA，结果显示测定的灵敏性为10-3～10-4(图2)。
图2 WT1基因表达检测的灵敏性(K562细胞)
3 讨 论
WT1基因是从Wilms瘤细胞的染色体11p13位分离出来的Wilms瘤基因，但近年来国内外研究均表明WT1在人类白血病细胞中有高度表达，并对白血病细胞增殖、分化起重要作用，并与白血病的发生、发展及预后有一定关系[3]。本文研究表明，10例正常人及10例非血液病患者均未检测到WT1基因；68例白血病患者中，有19/39(49%)AML WT1表达阳性，其中18/28(64%)为初治与复发；8/13(62%)ALL WT1表达阳性，其中8/12(67%)为初治与复发，急性白血病CR者WT1呈低表达1/12(8%);7/16(44%)CML WT1表达阳性，其中4例慢粒急变期全部为阳性。上述结果与国内外文献报道相一致[4～6]。有学者认为在AML中，M0\,M1\,M2\,M3 WT1高表达，而M4、M5表达较低；我们的研究也发现，WT1在M1、M2、M3尤其M1、M2有较高表达。其余类型AML因例数相对较少而需进一步研究探讨。这些研究结果表明WT1在白血病各类型中均能表达。
, 百拇医药
白血病患者化疗及骨髓移植治疗的关键在于不能确定体内白血病细胞的数量，因此，准确、敏感地检测微小残留病(MRD)对于进一步治疗具有重要价值[7～9]。有学者指出，利用WT1进行MRD检测可以比临床提前4～32周预测复发，对指导临床治疗有重要意义[8，9]。RT-PCR技术为检测MRD最灵敏手段。我们将K562细胞和正常细胞分别倍比稀释，然后应用RT-PCR检测WT1基因表达，其检出率达10-4水平，与测定白血病细胞的其他特异性基因标记相似。由于检测其他特异性基因标记的应用范围很窄，如bcr/abl基因及PML/RARα基因，只限于CML和M3型白血病，而WT1在各类白血病中均有表达，测定WT1的表达以监测残留白血病细胞的方法几乎适用于所有的白血病患者。故WT1可用来监测白血病患者MRD，作为判断预后及监测MRD的敏感指标。本文对8例白血病患者治疗前后WT1基因表达进行观察，发现治疗前7例WT1阳性者中，完全缓解后有4例WT1表达转为阴性，1例表达有明显下降。同时我们还观察到，5例CR期WT1阴性的患者，复发后其WT1表达转为阳性；2例缓解者WT1表达持续阴性；1例临床、骨髓提示缓解而WT1表达阴性的患者，2周后临床、骨髓提示复发；1例CML加速期WT1表达阴性，急变期转为阳性。这些结果提示，WT1的表达可以反映白血病的发生、发展，从而指导临床治疗；而在慢性与加速期WT1表达阳性者更需要密切观察其疾病的演变。
, 百拇医药
综上所述，检测WT1表达对研究白血病的发生、发展及监测MRD和判断白血病病人预后、早期预测复发、制定个体化治疗方案及其化疗与骨髓移植治疗后疗效的随访观察等均有重要作用。
参 考 文 献
1，Call KM, Glaser T, Ito CY, et al. Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosom 11 Wilms′ tumor locus. Cell, 1990,60:509
2，Gessler M, Poustka A, Cavenee W, et al. Homozygous deletion in Wilms tumors of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature, 1990,343:774
, http://www.100md.com
3，Fraizer GC, Patmasiriwat P, Zhang X, et al. Expression of the tumor suppressor gene WT1 in both human and mouse marrow. Blood, 1995,86:4704
4，Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994,84:3071
5，郭晓楠，徐世荣，董作仁，等.白血病患者WT1基因的表达及其与预后及多药耐药的关系.中华血液学杂志，1999，20：69
6，Miwa H, Beran M, Saunders GF, et al. Expression of the Wilms′ tumor gene (WT1) in human leukemias. Leukemia, 1992,6:405
, http://www.100md.com
7，Patmasiriwat P, Fraizer GC, Claxton D, et al. Expression pattern of WT1 and GATA-1 in AML with chromosome 16q22 abnormalities. Leukemia, 1996,10:1127
8，Inoue K, Ogawa H, Yamagami T, et al. Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 expression levels. Blood, 1996,88:2267
9，Miething C, Weidmann E, Maurer U, et al. Relevance of WT1 messenger-RNA expression concerning prognosis and clinical monitoring of acute myeloid leukemia. Blood, 1996,88(10，Suppl 1):564
10，Miyagi, T, Ahuja H, Kubota T, et al. Expression of the condidate Wilms′ tumor gene, WT1, in human leukemia cells. Leukemia, 1993,7:970
(1999-06-11收稿), 百拇医药