分子修饰的重组百日咳毒素S1亚单位的生物学和免疫学特性
作者：于康震 Burnette W N Kaslow H R Yilma T D
单位：于康震(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001)； Burnette W N Kaslow H R Yilma T D (美国加利福尼亚大学兽医学院，Davis, CA 95616 USA)
关键词：百日咳毒素；S1亚单位；生物学特性；免疫应答
中国免疫学杂志990403 中国图书分类号 R378.4 Q784
摘 要 目的：对重组杆状病毒表达的经多种信号序列修饰的天然和变异百日咳毒素(PT)S1亚单位(rS1)的生物学及免疫学特性作出评价。方法：应用生物化学和免疫学技术与方法对这些rS1的酶活性、分泌性和免疫原性等做了系统鉴定。结果：rS1变异子无可检出的酶活性；所有rS1均不能由细胞分泌，可从细胞膜组分中大量检出，但不能从可溶性胞浆蛋白组分或细胞培养上清中检出；rS1分子内部含有3个疏水性区域；rS1虽不能与B寡聚体结合形成PT全毒素，但均能诱导抗PT免疫应答。结论：这些rS1极可能以膜蛋白形式存在，其非分泌性与分子内部的疏水性区域有关；所有rS1均保持其免疫原性。
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Biological and immunological characterization of genetically altered S1 subunits of pertussis toxin expressed in recombinant baculoviruses
YU Kang-Zhen.Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001
Burnette W N, Kaslow H R, Yilma T D.International Laboratory of Molecular Biology for Tropical Disease Agents, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, CA 95616 USA
, 百拇医药
Abstract Objective:To make a further study on the biological and immunological aspects of the molecularly modified native and mutant rS1 subunits abundantly expressed by recombinant baculoviruses in insect cells and larvae. Methods:Biochemical and immunological techniques were used for characterization of enzyme activity, secretion and immunogenicity of the rS1. Results:The mutant rS1 analogs had no detectable enzymatic activity. None of the rS1 subunits were secreted from the eukaryotic cells. These rS1 proteins were found in membrane fractions, but not in either the soluble cytoplasmic or culture supernatant fractions. Furthermore, 3 hydrophobic domains were found within the rS1 molecules. Although none of the rS1 subunits were capable of associating with authentic B oligomer to form PT holotoxin, they induced an immune response to PT in Balb/c mice. Conclusion:Those rS1 subunits appeared to be integrated into the cell membrane,and their none-secretion might be contributed by the hydrophobic domains. The immunogenicity of the all rS1 subunits was still maintained.
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Key words Pertussis toxin S1 subunit Biological characterization Immune response
百日咳是一种在婴儿中具有很高死亡率的呼吸系统疾病，其病原为百日咳杆菌，该菌能产生包括百日咳毒素(PT)在内的十多种毒性因子。PT既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是百日咳疫苗的主要保护性抗原。S1亚单位是PT中最大的一个亚单位，PT的ADP-核糖转移酶活性和主要保护性决定簇即位于该亚单位上。传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。
Burnette及其同事通过单一氨基酸替换(R9→K)技术构建了一种S1变异子，其酶活性降至阴性对照水平，但仍保持主要的保护性决定簇[1]。这一突破为有效和安全的新型百日咳疫苗的研制开辟了新途径。在先前的研究中，我们对天然及变异S1编码基因进行了一系列分子修饰，并应用重组杆状病毒(rBV)技术实现了这些亚单位在昆虫细胞中的高水平表达。本研究中，我们进一步对这些重组S1亚单位(rS1)的生物学及免疫学特性作了鉴定，为评价其作为安全免疫原的潜能提供了分子生物学依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞系、病毒 昆虫细胞系Sf21用于rS1亚单位的表达，中国地鼠卵(CHO)细胞、Vero细胞及牛水疱性口炎病毒(VSV-NJ株)用于rS1亚单位生物学特性的鉴定。
1.2 S1亚单位基因片段的修饰和表达 8种S1亚单位编码基因片段的遗传学修饰如图1所示，其在rBV中的高效表达见文献[2]。
图1 S1亚单位编码基因的分子修饰
Fig.1 Modification of S1 DNA molecules
1.3 ADP-核糖转移酶活性分析 用于评价各rS1亚单位的酶活性，具体方法参照文献[3]进行，以牛的Transducin作为ADP-核糖转移酶的底物。
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1.4 rBV感染培养物各组分的制备 细胞膜及其它亚细胞成分的制备按报道的方法进行[4]。用各rBV感染Sf21细胞[2]，低速离心(280×g)收集细胞沉淀后进行匀浆。全细胞裂解物(组分1)经离心(110 000×g)后形成两部分，一为上清液(组分2，可溶性胞浆蛋白)，将其用Centricon-10滤膜(截留分子量为10 kD，Amicon)超滤浓缩10倍；另一部分为沉淀(组分3，不溶性蛋白)，将其重悬于1.42mol/L STE(1.42 mol/L蔗糖，5mmol/L Tris和1mmol/L EDTA)并离心(110000×g),离心后形成新的沉淀(组分4，亚细胞成分)和一条含膜组分(组分6)的条带。对最初低速离心所获得的上清再进行超速离心(110000×g)，新上清用Centriprep-10(截留分子量为10kD，Amicon)滤膜浓缩100倍(组分5)。同时用各rBV感染昆虫幼虫[2]，收获其血淋巴(组分7)。用免疫印迹技术检测以上各组分中的rS1蛋白。
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1.5 全毒素组装分析 即测定这些rS1与PT的B寡聚体结合能力[5]。组装的全毒素用免疫印迹技术检测，同时对反应混合物作CHO聚集效应分析[6]。
1.6 rS1亚单位免疫学特性试验
1.6.1 动物免疫 为检测rS1的免疫原性及佐剂活性，以rVSV-G(rBV表达的VSV糖蛋白)和下列各rS1的混合物经腹腔免疫：带有天然信号序列的天然rS1(rS1/1组)，带有天然信号序列的变异rS1(rS1/1-4组)，带有流感病毒信号序列的变异rS1(rS1/3-4组)，纯化的PT(PT组)，纯化的S1(S1组，阳性对照)和磷酸盐缓冲液(rVSV-G组，阴性对照)。每只鼠免疫剂量为rS1 30 μg(据SDS-PAGE凝胶扫描结果估算)，PT或S1亚单位1 μg。
小鼠在免疫前经眶后静脉采血1次，免疫后每周以相同的途径采血，并进行白细胞(WBC)计数。
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1.6.2 ELISA试验 用以评价免疫鼠的抗PT或VSV-G的免疫应答。简言之，以含1 μg/ml PT或VSV-G的碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被96孔酶标板，然后以含5%脱脂奶粉的TBS(pH7.4)封闭，再将不同稀释度的鼠血清样品加入各孔,然后加入碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG,按常规显色和测定。
1.6.3 CHO细胞聚集抑制试验 用以检测抗PT的中和性抗体。试验在96孔组织培养板上按文献[6]报道的方法进行。PT的血清中和(SN)价以可完全抑制CHO细胞聚集的血清终点稀释度的倒数表示。
1.6.4 VSV蚀斑减少试验 用以分析rS1能否增强小鼠对VSV的体液免疫应答。免疫鼠血清与VSV-NJ在96孔板上混合后作用1 h，然后用该血清/病毒混合物感染Vero细胞单层，VSV蚀斑用结晶紫染色后计数。VSV SN滴度以无病毒蚀斑形成时的终点血清稀释度的倒数表示。
1.7 疏水性分析 为探讨rS1亚单位不能分泌的可能原因，我们利用计算机辅助分析技术和GCG程序(Wisconsin package)对本研究中具有代表性的rS1/3-4亚单位分子的疏水性作了分析。
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2 结果
2.1 rS1亚单位的酶活性 ADP-核糖转移酶试验表明，所有天然序列的rS1亚单位均具有酶活性，而所有变异的rS1亚单位均无可检出的酶活性。
2.2 rS1蛋白的亚细胞分布及其分泌性 对8种rBV感染的细胞培养物的不同组分进行了检测，结果是一致的(图 2)：在昆虫血淋巴、高度浓缩的培养上清及胞浆可溶性蛋白组分中未检出任何rS1亚单位，而在膜组分中检出了大量的rS1蛋白。结果表明，所有rS1亚单位(无论有无信号序列)均不能分泌，而是膜结合性的。
图2 rS1蛋白在昆虫细胞培养物中的亚细胞分布
Fig.2 Subcellular distribution of rS1 proteins in different fractions of insect cell cultures
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Note：subcellular fractions are indicated as 1～7, see 1.4 in methods for detail
2.3 全毒素装配分析 未能从含rS1的全毒素组装反应混合物中检出PT全毒素，而从含天然S1的反应混合物中检出了PT。CHO细胞聚集试验表明，25%～50%的天然S1可与B寡聚体组装成PT全毒素，而rS1亚单位的全毒素装配均处于本底水平(<0.4%)。因此，所有rS1亚单位均缺乏与B寡聚体结合的能力。
2.4 rS1亚单位的白细胞增多活性 WBC计数表明，注射天然PT 1 w后的小鼠具有很高的WBC刺激指数(高达18.34)，而各种rS1和天然S1组以及阴性对照组小鼠的该指数仅为1.05～2.62,这表明所有rS1亚单位均无诱导白细胞增多的活性。
2.5 rS1亚单位的免疫原性 在PT ELISA和CHO细胞聚集抑制试验中，rS1试验组和阳性对照组的抗PT抗体和中和抗体滴度在免疫后第2周开始升高，这种持续性升高呈时间依赖性。天然S1和各rS1免疫鼠的抗PT抗体应答相似，但PT组的抗体应答更强。同样，SN滴度在天然S1和rS1免疫鼠为16，而在PT免疫组则高达256以上。试验中还观察到低稀释的鼠血清(<1∶8)对CHO细胞的毒性作用。
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对6组鼠血清的抗VSV总抗体(VSV ELISA)及中和抗体(VSV蚀斑减少试验)分析表明，仅天然PT具有增强抗VSV免疫应答的活性(免疫后第2周SN滴度达320以上)，而各rS1、天然S1和阴性对照组则无此活性(SN滴度为40～80)，这表明所有rS1亚单位均无天然PT全毒素的佐剂活性。
2.6 rS1亚单位的疏水性 计算机辅助分析表明，rS1/3-4分子中至少存在4个疏水性区域：1个位于病毒信号肽内，1个在分子中间，2个位于羧基端(图3)。其中区域2和3分别含有19(201～219)和14(239～252)个氨基酸残基，其长度与疏水性强度足以将rS1分子嵌在细胞膜中。
图3 rS1/3-4的亲水性和疏水性分析
Fig.3 Hydrophilicity and hydrophobicity of rS1/3-4 sequence
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3 讨论
为便于大量制备S1亚单位，我们将流感病毒信号序列插在天然和变异S1基因上游(rS1/3、rS1/1-4)，以期得到分泌性的rS1蛋白。此外，带有细菌天然信号者(rS1/1和rS1/1-4)也有可能分泌，携带嵌膜序列的rS1/3A和rS1/3-4A可望进入膜内，而无信号序列的rS1/2及rS1/2-4应作为胞浆蛋白存在。然而，虽然流感病毒信号肽可被正确有效地切割[2]，但在高度浓缩的培养上清及昆虫幼虫血淋巴中均未检出任何rS1蛋白(图2)。为阐明这些rS1亚单位的亚细胞分布，我们检测了感染细胞培养物的不同组分，结果发现rS1存在于每种沉淀和膜组分中，而不存在于胞浆可溶性蛋白成分中(图2)。计算机辅助分析表明，疏水性区域2和3分别含有19(201～219)和14(239～252)个氨基酸残基，其长度与疏水性强度足以将rS1分子嵌在细胞膜中(图3)。为进一步阐明这一嵌膜机制，我们已构建一种缺失羧基端疏水区2和3的rS1/3-4(结果另报)。考虑到rS1蛋白的疏水性以及其在膜组分中的存在和在可溶性胞浆蛋白中的缺乏，我们认为rS1亚单位可能以膜结合蛋白的形式存在于细胞内。这与rS1在组分4中的存在并不矛盾，因为该组分中仍然含有大量的细胞膜成分。我们的推论在带有流感病毒信号肽的rS1/3、rS1/3-4、rS1/3A及rS1/3-4A是比较容易理解的：在信号肽引导下，rS1蛋白被运送至内质网(ER)，信号肽切除后，这些蛋白便由ER转运至高尔基体，最后到达细胞膜，通过疏水区或/和嵌膜序列而定位于细胞膜上。按蛋白质的经典分泌途径难以理解不含信号肽的rS1/2和rS1/2-4是如何被转运到细胞膜的[7]。许多研究表明，原核及真核细胞均可产生缺乏疏水性信号肽的分泌性蛋白，这些蛋白的运送是通过一种叫作ABC(ATP-binding cassette)转运系统实现的[8]，这可能有助于解释我们的结果。
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本研究中rS1缺乏与B寡聚体结合的能力，这可能是rBV表达系统产生的rS1蛋白的膜结合性导致了其折叠方式的变化，从而引起rS1与B寡聚体体外结合能力的丧失。
我们还对rS1亚单位的免疫学特性作了鉴定，本试验表明rS1亚单位均具有免疫原性。rS1蛋白所诱导的抗PT抗体及中和性抗体水平与天然S1诱导的相似，但低于PT诱导的抗体水平。这可能是由于在PT免疫动物的同时存在抗S1及抗B寡聚体的2种免疫应答的缘故。同时发现rS1亚单位均无免疫增强或白细胞增多活性，再次验证了只有PT全毒素才具有此类活性。有研究表明，枯草杆菌产生的重组S1亚单位(Bac S1)可激发小鼠的保护性免疫应答[9]。我们将开展进一步的动物实验来评价这些rS1亚单位的免疫保护性。
Burnette W N Amgen Inc.Thousand Oaks, CA 91320 USA
Kaslow H R School of Medicine, Universtiy of Southern California, Los Angeles, CA 90033 USA
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作者简介：于康震，男，37岁，研究员，博士生导师
4 参考文献
[1] Burnette W N, Cieplak W, Mar V L. Pertussis toxin S1 mutant with reduced enzyme activity and a conserved protective epitope. Science, 1988;242:72
[2] 于康震，Burnette W N, Kaslow H R. 百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及其在重组杆状病毒中的表达.中国免疫学杂志，1999；15(2)：52
[3] Kaslow H R, Lim L K, Moss J. Structure-activity analysis of the activation of petussis toxin. Biochem, 1987；26:123
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[4] Ozols J. Preparation of membrane fractions. Methods Enzymol, 1990;182:225
[5] Bartly T D, Whiteley D W, Mar V L. Pertussis holotoxin formed in vitro with a genetically deactivated S1 subunit. Proc Natl Acad Sci USA, 1989;86:8353
[6] Gillenius P, Jaatmaa E, Askelof M. The standardization of an assay for pertussis toxin and antitoxin in microplate culture of Chinese hamster ovary cells. J Biol Standard, 1985;13:61
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[7] Barinaga M. Secrets of secretion revealed. Science, 1993;260:487
[8] Hyde S C, Emsley P, Hartshorn M J. Structural model of ATP-binding proteins associated with cystic fibrosis, multidrug resistance and bacterial transport. Nature, 1990;346:362
[9] Olander R M, Muotiala A, Himanen J P. Immunogenicity and protective efficacy of pertussis toxin subunit S1 produced by Bacillus subtilis. Microbial Pathogenesis, 1991;10:159
〔收稿1998-04-15 修回1998-06-19〕, 百拇医药
单位：于康震(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001)； Burnette W N Kaslow H R Yilma T D (美国加利福尼亚大学兽医学院，Davis, CA 95616 USA)
关键词：百日咳毒素；S1亚单位；生物学特性；免疫应答
中国免疫学杂志990403 中国图书分类号 R378.4 Q784
摘 要 目的：对重组杆状病毒表达的经多种信号序列修饰的天然和变异百日咳毒素(PT)S1亚单位(rS1)的生物学及免疫学特性作出评价。方法：应用生物化学和免疫学技术与方法对这些rS1的酶活性、分泌性和免疫原性等做了系统鉴定。结果：rS1变异子无可检出的酶活性；所有rS1均不能由细胞分泌，可从细胞膜组分中大量检出，但不能从可溶性胞浆蛋白组分或细胞培养上清中检出；rS1分子内部含有3个疏水性区域；rS1虽不能与B寡聚体结合形成PT全毒素，但均能诱导抗PT免疫应答。结论：这些rS1极可能以膜蛋白形式存在，其非分泌性与分子内部的疏水性区域有关；所有rS1均保持其免疫原性。
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Biological and immunological characterization of genetically altered S1 subunits of pertussis toxin expressed in recombinant baculoviruses
YU Kang-Zhen.Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001
Burnette W N, Kaslow H R, Yilma T D.International Laboratory of Molecular Biology for Tropical Disease Agents, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, CA 95616 USA
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Abstract Objective:To make a further study on the biological and immunological aspects of the molecularly modified native and mutant rS1 subunits abundantly expressed by recombinant baculoviruses in insect cells and larvae. Methods:Biochemical and immunological techniques were used for characterization of enzyme activity, secretion and immunogenicity of the rS1. Results:The mutant rS1 analogs had no detectable enzymatic activity. None of the rS1 subunits were secreted from the eukaryotic cells. These rS1 proteins were found in membrane fractions, but not in either the soluble cytoplasmic or culture supernatant fractions. Furthermore, 3 hydrophobic domains were found within the rS1 molecules. Although none of the rS1 subunits were capable of associating with authentic B oligomer to form PT holotoxin, they induced an immune response to PT in Balb/c mice. Conclusion:Those rS1 subunits appeared to be integrated into the cell membrane,and their none-secretion might be contributed by the hydrophobic domains. The immunogenicity of the all rS1 subunits was still maintained.
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Key words Pertussis toxin S1 subunit Biological characterization Immune response
百日咳是一种在婴儿中具有很高死亡率的呼吸系统疾病，其病原为百日咳杆菌，该菌能产生包括百日咳毒素(PT)在内的十多种毒性因子。PT既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是百日咳疫苗的主要保护性抗原。S1亚单位是PT中最大的一个亚单位，PT的ADP-核糖转移酶活性和主要保护性决定簇即位于该亚单位上。传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。
Burnette及其同事通过单一氨基酸替换(R9→K)技术构建了一种S1变异子，其酶活性降至阴性对照水平，但仍保持主要的保护性决定簇[1]。这一突破为有效和安全的新型百日咳疫苗的研制开辟了新途径。在先前的研究中，我们对天然及变异S1编码基因进行了一系列分子修饰，并应用重组杆状病毒(rBV)技术实现了这些亚单位在昆虫细胞中的高水平表达。本研究中，我们进一步对这些重组S1亚单位(rS1)的生物学及免疫学特性作了鉴定，为评价其作为安全免疫原的潜能提供了分子生物学依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞系、病毒 昆虫细胞系Sf21用于rS1亚单位的表达，中国地鼠卵(CHO)细胞、Vero细胞及牛水疱性口炎病毒(VSV-NJ株)用于rS1亚单位生物学特性的鉴定。
1.2 S1亚单位基因片段的修饰和表达 8种S1亚单位编码基因片段的遗传学修饰如图1所示，其在rBV中的高效表达见文献[2]。
图1 S1亚单位编码基因的分子修饰
Fig.1 Modification of S1 DNA molecules
1.3 ADP-核糖转移酶活性分析 用于评价各rS1亚单位的酶活性，具体方法参照文献[3]进行，以牛的Transducin作为ADP-核糖转移酶的底物。
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1.4 rBV感染培养物各组分的制备 细胞膜及其它亚细胞成分的制备按报道的方法进行[4]。用各rBV感染Sf21细胞[2]，低速离心(280×g)收集细胞沉淀后进行匀浆。全细胞裂解物(组分1)经离心(110 000×g)后形成两部分，一为上清液(组分2，可溶性胞浆蛋白)，将其用Centricon-10滤膜(截留分子量为10 kD，Amicon)超滤浓缩10倍；另一部分为沉淀(组分3，不溶性蛋白)，将其重悬于1.42mol/L STE(1.42 mol/L蔗糖，5mmol/L Tris和1mmol/L EDTA)并离心(110000×g),离心后形成新的沉淀(组分4，亚细胞成分)和一条含膜组分(组分6)的条带。对最初低速离心所获得的上清再进行超速离心(110000×g)，新上清用Centriprep-10(截留分子量为10kD，Amicon)滤膜浓缩100倍(组分5)。同时用各rBV感染昆虫幼虫[2]，收获其血淋巴(组分7)。用免疫印迹技术检测以上各组分中的rS1蛋白。
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1.5 全毒素组装分析 即测定这些rS1与PT的B寡聚体结合能力[5]。组装的全毒素用免疫印迹技术检测，同时对反应混合物作CHO聚集效应分析[6]。
1.6 rS1亚单位免疫学特性试验
1.6.1 动物免疫 为检测rS1的免疫原性及佐剂活性，以rVSV-G(rBV表达的VSV糖蛋白)和下列各rS1的混合物经腹腔免疫：带有天然信号序列的天然rS1(rS1/1组)，带有天然信号序列的变异rS1(rS1/1-4组)，带有流感病毒信号序列的变异rS1(rS1/3-4组)，纯化的PT(PT组)，纯化的S1(S1组，阳性对照)和磷酸盐缓冲液(rVSV-G组，阴性对照)。每只鼠免疫剂量为rS1 30 μg(据SDS-PAGE凝胶扫描结果估算)，PT或S1亚单位1 μg。
小鼠在免疫前经眶后静脉采血1次，免疫后每周以相同的途径采血，并进行白细胞(WBC)计数。
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1.6.2 ELISA试验 用以评价免疫鼠的抗PT或VSV-G的免疫应答。简言之，以含1 μg/ml PT或VSV-G的碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被96孔酶标板，然后以含5%脱脂奶粉的TBS(pH7.4)封闭，再将不同稀释度的鼠血清样品加入各孔,然后加入碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG,按常规显色和测定。
1.6.3 CHO细胞聚集抑制试验 用以检测抗PT的中和性抗体。试验在96孔组织培养板上按文献[6]报道的方法进行。PT的血清中和(SN)价以可完全抑制CHO细胞聚集的血清终点稀释度的倒数表示。
1.6.4 VSV蚀斑减少试验 用以分析rS1能否增强小鼠对VSV的体液免疫应答。免疫鼠血清与VSV-NJ在96孔板上混合后作用1 h，然后用该血清/病毒混合物感染Vero细胞单层，VSV蚀斑用结晶紫染色后计数。VSV SN滴度以无病毒蚀斑形成时的终点血清稀释度的倒数表示。
1.7 疏水性分析 为探讨rS1亚单位不能分泌的可能原因，我们利用计算机辅助分析技术和GCG程序(Wisconsin package)对本研究中具有代表性的rS1/3-4亚单位分子的疏水性作了分析。
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2 结果
2.1 rS1亚单位的酶活性 ADP-核糖转移酶试验表明，所有天然序列的rS1亚单位均具有酶活性，而所有变异的rS1亚单位均无可检出的酶活性。
2.2 rS1蛋白的亚细胞分布及其分泌性 对8种rBV感染的细胞培养物的不同组分进行了检测，结果是一致的(图 2)：在昆虫血淋巴、高度浓缩的培养上清及胞浆可溶性蛋白组分中未检出任何rS1亚单位，而在膜组分中检出了大量的rS1蛋白。结果表明，所有rS1亚单位(无论有无信号序列)均不能分泌，而是膜结合性的。
图2 rS1蛋白在昆虫细胞培养物中的亚细胞分布
Fig.2 Subcellular distribution of rS1 proteins in different fractions of insect cell cultures
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Note：subcellular fractions are indicated as 1～7, see 1.4 in methods for detail
2.3 全毒素装配分析 未能从含rS1的全毒素组装反应混合物中检出PT全毒素，而从含天然S1的反应混合物中检出了PT。CHO细胞聚集试验表明，25%～50%的天然S1可与B寡聚体组装成PT全毒素，而rS1亚单位的全毒素装配均处于本底水平(<0.4%)。因此，所有rS1亚单位均缺乏与B寡聚体结合的能力。
2.4 rS1亚单位的白细胞增多活性 WBC计数表明，注射天然PT 1 w后的小鼠具有很高的WBC刺激指数(高达18.34)，而各种rS1和天然S1组以及阴性对照组小鼠的该指数仅为1.05～2.62,这表明所有rS1亚单位均无诱导白细胞增多的活性。
2.5 rS1亚单位的免疫原性 在PT ELISA和CHO细胞聚集抑制试验中，rS1试验组和阳性对照组的抗PT抗体和中和抗体滴度在免疫后第2周开始升高，这种持续性升高呈时间依赖性。天然S1和各rS1免疫鼠的抗PT抗体应答相似，但PT组的抗体应答更强。同样，SN滴度在天然S1和rS1免疫鼠为16，而在PT免疫组则高达256以上。试验中还观察到低稀释的鼠血清(<1∶8)对CHO细胞的毒性作用。
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对6组鼠血清的抗VSV总抗体(VSV ELISA)及中和抗体(VSV蚀斑减少试验)分析表明，仅天然PT具有增强抗VSV免疫应答的活性(免疫后第2周SN滴度达320以上)，而各rS1、天然S1和阴性对照组则无此活性(SN滴度为40～80)，这表明所有rS1亚单位均无天然PT全毒素的佐剂活性。
2.6 rS1亚单位的疏水性 计算机辅助分析表明，rS1/3-4分子中至少存在4个疏水性区域：1个位于病毒信号肽内，1个在分子中间，2个位于羧基端(图3)。其中区域2和3分别含有19(201～219)和14(239～252)个氨基酸残基，其长度与疏水性强度足以将rS1分子嵌在细胞膜中。
图3 rS1/3-4的亲水性和疏水性分析
Fig.3 Hydrophilicity and hydrophobicity of rS1/3-4 sequence
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3 讨论
为便于大量制备S1亚单位，我们将流感病毒信号序列插在天然和变异S1基因上游(rS1/3、rS1/1-4)，以期得到分泌性的rS1蛋白。此外，带有细菌天然信号者(rS1/1和rS1/1-4)也有可能分泌，携带嵌膜序列的rS1/3A和rS1/3-4A可望进入膜内，而无信号序列的rS1/2及rS1/2-4应作为胞浆蛋白存在。然而，虽然流感病毒信号肽可被正确有效地切割[2]，但在高度浓缩的培养上清及昆虫幼虫血淋巴中均未检出任何rS1蛋白(图2)。为阐明这些rS1亚单位的亚细胞分布，我们检测了感染细胞培养物的不同组分，结果发现rS1存在于每种沉淀和膜组分中，而不存在于胞浆可溶性蛋白成分中(图2)。计算机辅助分析表明，疏水性区域2和3分别含有19(201～219)和14(239～252)个氨基酸残基，其长度与疏水性强度足以将rS1分子嵌在细胞膜中(图3)。为进一步阐明这一嵌膜机制，我们已构建一种缺失羧基端疏水区2和3的rS1/3-4(结果另报)。考虑到rS1蛋白的疏水性以及其在膜组分中的存在和在可溶性胞浆蛋白中的缺乏，我们认为rS1亚单位可能以膜结合蛋白的形式存在于细胞内。这与rS1在组分4中的存在并不矛盾，因为该组分中仍然含有大量的细胞膜成分。我们的推论在带有流感病毒信号肽的rS1/3、rS1/3-4、rS1/3A及rS1/3-4A是比较容易理解的：在信号肽引导下，rS1蛋白被运送至内质网(ER)，信号肽切除后，这些蛋白便由ER转运至高尔基体，最后到达细胞膜，通过疏水区或/和嵌膜序列而定位于细胞膜上。按蛋白质的经典分泌途径难以理解不含信号肽的rS1/2和rS1/2-4是如何被转运到细胞膜的[7]。许多研究表明，原核及真核细胞均可产生缺乏疏水性信号肽的分泌性蛋白，这些蛋白的运送是通过一种叫作ABC(ATP-binding cassette)转运系统实现的[8]，这可能有助于解释我们的结果。
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本研究中rS1缺乏与B寡聚体结合的能力，这可能是rBV表达系统产生的rS1蛋白的膜结合性导致了其折叠方式的变化，从而引起rS1与B寡聚体体外结合能力的丧失。
我们还对rS1亚单位的免疫学特性作了鉴定，本试验表明rS1亚单位均具有免疫原性。rS1蛋白所诱导的抗PT抗体及中和性抗体水平与天然S1诱导的相似，但低于PT诱导的抗体水平。这可能是由于在PT免疫动物的同时存在抗S1及抗B寡聚体的2种免疫应答的缘故。同时发现rS1亚单位均无免疫增强或白细胞增多活性，再次验证了只有PT全毒素才具有此类活性。有研究表明，枯草杆菌产生的重组S1亚单位(Bac S1)可激发小鼠的保护性免疫应答[9]。我们将开展进一步的动物实验来评价这些rS1亚单位的免疫保护性。
Burnette W N Amgen Inc.Thousand Oaks, CA 91320 USA
Kaslow H R School of Medicine, Universtiy of Southern California, Los Angeles, CA 90033 USA
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作者简介：于康震，男，37岁，研究员，博士生导师
4 参考文献
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[2] 于康震，Burnette W N, Kaslow H R. 百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及其在重组杆状病毒中的表达.中国免疫学杂志，1999；15(2)：52
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〔收稿1998-04-15 修回1998-06-19〕, 百拇医药