放线菌酮和硫酸锌对儿茶素诱导大肠癌细胞凋亡的拮抗作用
作者：谭晓华 张亚历 姜 泊 周殿元
单位：第一军医大学南方医院消化内科研究所(广州，510515)
关键词：儿茶素；放线菌酮；大肠癌细胞株；凋亡作用；拮抗作用
癌症990306
【摘要】目的：探讨儿茶素诱导体外培养的LoVo大肠癌细胞株凋亡及放线菌酮和硫酸锌对儿茶素诱导细胞凋亡的拮抗作用。方法：用儿茶素处理LoVo细胞，加或不加放线菌酮和硫酸锌，用琼脂糖凝胶电泳、荧光显微镜和流式细胞仪方法，观察LoVo细胞生化和形态学方面的改变。结果：荧光显微镜下可见LoVo细胞在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂等凋亡细胞的形态学改变；琼脂糖凝胶电泳呈典型的“梯状”(DNAladder)带，在同时加于放线菌酮或硫酸锌时，“梯状”带消失；PI染色的流式细胞仪直方图上出现亚二倍体峰，并具有明显的时间和剂量效应关系。结论：儿茶素能诱导大肠癌LoVo细胞的凋亡，这种凋亡作用能被放线菌酮或硫酸锌所拮抗。
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中图号：R73534 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0256-04
Antagonism of cycloheximide and zinc sulfate on
catechins-induced apoptosis of LoVo cells
TAN Xiao-hua,ZHANG Ya-li，JIANG Bo,et al.
Institute For Digestive Diseases,Nan Fang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515,China
【Abstract】 Objective：To investigate the apoptosis and its antagonism is induced by catechines in a colon cell line,LoVo,in culture.Methods：After treatment of LoVo cells with catethines,in the presence or the absence of cycloheximide and zinc sulfate,the apoptosis was detected by gel electrophoresis,fluorescent light microscope and flow cytometry.Results：After the LoVo cells were treated by catechines,it was shown that： 1).Typical nuclear condensation and fragmentation were observed by fluorescent light microscop.2).“ DNA ladder”appeared on a 2% agarose gel.However,the DNA ladder disappeared in the presence of cycloheximide or zinc sulfate.3).Hypodiploid peak appeared on the histogram of flow cytometry with PI staining.Moreover,there are concentration-dependent and time-dependent effects on the apoptosis of LoVo cells induced by catechines.Conclusion：Catechines have an effect of inducing apoptosis of LoVo cells,which is antagonized by cycloheximide and zinc sulfate.
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Key words：Catechins；Cycloheximide;Colon cancer cell line;Apoptosis； Antagonism
已经证实，绿茶水提取物能诱导体外培养的大肠癌LoVo细胞的凋亡〔1〕，为了进一步探讨绿茶诱导肿瘤细胞凋亡的有效成分，我们用绿茶的主要组份儿茶素处理LoVo细胞，发现其同样能诱导该细胞的凋亡。并且，儿茶素诱导LoVo细胞凋亡的作用能被放线菌酮和硫酸锌所拮抗。
1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 儿茶素的配制：儿茶素由湖南农业大学茶叶研究所王增盛教授惠赠，用不含血清的RPMI1640培养液配制成浓度为10mg/ml的储存液，用时根据需要稀释成不同浓度。
1.1.2 放线菌酮(Sigma)溶液：用三蒸水配成1mg/ml的储存液，0.22μm的滤器过滤除菌，4℃保存。
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1.1.3 硫酸锌(Sigma)溶液：用三蒸水配成1mol/L的储存液，0.22μm的滤器过滤除菌，4℃保存。
1.2 细胞系
LoVo细胞(我所保存)体外用RPMI1640(Gibco)培养液(内含15%小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml的青链霉素)，置5%CO2孵箱中培养。
1.3 方法
1.3.1 琼脂糖凝胶电泳：将儿茶素(终浓度为200～400μg/ml)加入对数生长期的LoVo细胞中，继续培养24h收集细胞；另一组实验中，细胞中同时加儿茶素及放线菌酮(1.0～2.0μg/ml)或硫酸锌(10～50mmol/L)，作用24h后收集细胞。按文献〔1〕介绍的方法进行。
1.3.2 荧光显微镜观察：将LoVo细胞接种在放有盖玻片的六孔板中，让细胞在盖玻片上生长至对数生长期，换液加入儿茶素(终浓度为300μg/ml)，在5%CO2培养箱继续培养24h后，加Hoechst 33342(Sigma)(终浓度为15μg/ml)避光孵育30分钟，取出盖玻片用1%多聚甲醛固定10分钟后，用PBS洗一次，中性树胶封片。荧光显微镜(OlympusBH2,Japan)下观察，有3个或以上的染色体片段可认为是凋亡细胞〔2〕。
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1.3.3 流式细胞仪检测：LoVo细胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶(Serva)消化传代至50ml的培养瓶，细胞数为1×105/ml。待生长至对数生长期，换液；有或没有放线菌酮或硫酸锌存在时加不同浓度的儿茶素并分别在处理12和24小时收集细胞。对照为不加儿茶素。参照文献〔3〕介绍的方法进行染色，在我校中心实验室流式细胞仪(EPICSELITE，CoulterCorporation,U.S.A)分析。
2 结果
2.1 儿茶素诱导LoVo细胞凋亡
在倒置显微镜下，人结肠癌细胞株LoVo细胞呈梭形，或多角形生长，加入不同浓度的儿茶素后，两株细胞生长受到抑制，增殖速度明显减慢；细胞逐渐由梭状或多角形变成圆形，细胞透明度下降，细胞体积变小(图1A)。上述现象随儿茶素浓度的增大愈加明显，显现时间和剂量效应关系。在荧光显微镜下，可见典型的凋亡细胞形态学改变：核固缩和核碎裂(图2)。
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图1 倒置显微镜显示：A.正常LoVo细胞；B.儿茶素(300μg/ml)处理LoVo细胞后24h；
C.儿茶素(300μ/ml)加放线菌酮(10μg/ml)处理LoVo细胞后24h
图2 荧光显微镜：A.对照LoVo细胞；B.儿茶素(300μg/ml)处理LoVo细胞后24h，示凋亡细胞核固缩、碎裂(箭头所指)。(×400)
流式细胞仪结果显示儿茶素诱导LoVo细胞凋亡在用PI染色的流式细胞仪直方图上，出现亚二倍体峰，并具有明显的剂量和时间效应关系。没处理的LoVo细胞自然凋亡率为2.2%，而在用50、200、400μg/ml三种浓度的儿茶素作用24h的凋亡率分别为：16.8%、27.6%和43.4%；在用200μg/ml的浓度作用12h时，凋亡率为12.1%(图3)。
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图3 流式细胞仪结果
A.对照LoVo细胞；B.儿茶素50μg/ml处理24h,C.200μg/ml处理24h,D.400μg/ml处理24h；E.200μg/ml处理12h;F.放线菌酮(1.0μg/ml)
加儿茶素(200μg/ml)处理24小时；G.硫酸锌(50mmol/L)加儿茶素(200μg/ml)处理24小时。
琼脂糖凝胶电泳显示，200～400μg/ml浓度的儿茶素处理24小时后，呈现凋亡细胞特征性的“梯状”带(图4)。
图4 琼脂糖凝电泳：A.Marker；B.非处理细胞基因组带；
C、D.儿茶素(浓度分别为200和400μg/ml)处理LoVo细胞后24h示‘梯形’带
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2.2 放线菌酮和硫酸锌对儿茶素诱导的LoVo细胞凋亡的拮抗作用
用1.0～2.0μg/ml的放线菌酮或50mmol/L硫酸锌与儿茶素共同作用于LoVo细胞，倒置显微镜下细胞形态学上的改变远不如单独用儿茶素处理的LoVo细胞变化明显，具有凋亡细胞较特征的形态学改变如细胞变圆、细胞浆固缩、细胞体积变小的细胞明显减少(图1B)；琼脂糖凝胶电泳结果显示放线菌酮或硫酸锌均能抑制儿茶素对两株肿瘤细胞所致的“梯状”带形成(图5)；用10μg/ml的放线菌酮或50mmol/L的硫酸锌与200μg/ml儿茶素共同加入细胞中培养24小时，流式细胞仪显示LoVo细胞的凋亡率从27.6%分别降至5.2%和6.7%，可见放线菌酮或硫酸西辛对儿茶素诱导L0V0细胞有明显的拮抗作用(图2)。
图5 琼脂糖凝胶电泳：A.儿茶素(400μg/ml);B.儿茶素(400μg/ml)加放线菌酮(2.0μg/ml)；
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C.儿茶素(400μg/ml)加硫酸锌(50mmol/L)；均处理LoVo细胞后24h
3 讨论
茶叶的抗癌机理尚不完全明了。近年来，有报道茶叶的一些成分诱导体外培养的肿瘤细胞的凋亡。我们用绿茶水提取物直接处理LoVo细胞诱导其凋亡〔1〕，而Hibasami等首先证实几种儿茶素单体如EGC、EGCG和ECG能诱发人淋巴性白血病Molt4B细胞的凋亡〔4〕，随后又证明了茶多酚及其单体可诱导多种肿瘤细胞包括肺癌〔5〕，结肠癌〔5〕，胃癌〔6，7〕和上皮细胞癌〔8〕细胞等的凋亡，说明茶叶诱导细胞凋亡是其抗癌的重要机制之一。这一机制在一定程度上可以解释流行病学研究中多饮茶的人群其大肠癌的发病率较低的现象。
儿茶素诱导肿瘤细胞凋亡机理尚不明了，蛋白合成抑制剂放线菌酮能拮抗儿茶素诱导的LoVo细胞的凋亡，说明儿茶素诱导该细胞凋亡时需要新的蛋白质合成〔9〕；而内原性核酸酶抑制剂Zn2+也能拮抗儿茶素所致的“梯状”带形成，说明儿茶素作用于LoVo细胞时，激活了内原性核酸酶〔10〕，将DNA裂解成180～200bp的寡核苷酸片段或其多聚体形成特征性的“梯状”带。对其机理的进一步研究，将有助于阐明茶叶的抗癌机理，并为开发茶叶组分用于临床治疗提供理论依据。
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基金项目：由军队“95”大肠癌攻关课题基金资助项目 (No.962028)
参考文献
1 谭晓华，张亚历，姜泊，等.绿茶水提取物诱导体外培养的大肠癌LoVo细胞的凋亡〔J〕.癌症，1998，17(3)：11.
2 Bose R,Verheij M,Haimovitz Friedman A,et al.Ceramide synthase mediates daunorubicin-induced apoptosis： an alternative mechanism for generating death signals〔J〕.Cell,1995,82：405.
3 张亚历，姜泊，周殿元.程序化细胞死亡常用研究方法〔A〕.见：姜泊等主编：分子生物学用3验方法〔M〕.北京.人民军医出版社，1996：170.
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4 Hibasami H,Achiwa Y,Fujikawa T,et al.Induction of programmed cell death(apoptosis)in human lymphoid leukemia cells by catechin compounds〔J〕 .Anticancer Res,1996,16：1943.
5 Yang GY,Liao J,Kim K,et al.Inhibition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols〔J〕.Carcinogenesis,1998,19：611.
6 Hibasami H,Komiya T,Achiwa Y,et al.Induction of apoptosis in human stomach cancer cells by green tea catechins 〔J〕.Oncol.Rep,1998,5：527.
, 百拇医药
7 赵燕，曹进.茶多酚诱导人胃癌细胞凋亡〔J〕.湖南医科大学学报，1997，22(5)：384.
8 Ahmad N,Feyes DK,Nieminen AL,et al.Green tea consituent epigallocatechin-3-gallate and induction of apoptosis and cell cycle arrest in human carcinoma cells〔J〕.J Natl Cancer Inst,1997,89：1881.
9 Gong J,Li X,Darzynkiewicz Z.Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin〔J〕.J Cell Physiol,1993,157：263.
10 Ribeiro JM,Carson DA.Ca2+/Mg(2+)-dependent endonuclease from human spleen： purification,properties,and role in apoptosis〔J〕.Biochemistry,1993,32：9129.
收稿日期：1998-08-03；修回日期：1999-01-18, 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院消化内科研究所(广州，510515)
关键词：儿茶素；放线菌酮；大肠癌细胞株；凋亡作用；拮抗作用
癌症990306
【摘要】目的：探讨儿茶素诱导体外培养的LoVo大肠癌细胞株凋亡及放线菌酮和硫酸锌对儿茶素诱导细胞凋亡的拮抗作用。方法：用儿茶素处理LoVo细胞，加或不加放线菌酮和硫酸锌，用琼脂糖凝胶电泳、荧光显微镜和流式细胞仪方法，观察LoVo细胞生化和形态学方面的改变。结果：荧光显微镜下可见LoVo细胞在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂等凋亡细胞的形态学改变；琼脂糖凝胶电泳呈典型的“梯状”(DNAladder)带，在同时加于放线菌酮或硫酸锌时，“梯状”带消失；PI染色的流式细胞仪直方图上出现亚二倍体峰，并具有明显的时间和剂量效应关系。结论：儿茶素能诱导大肠癌LoVo细胞的凋亡，这种凋亡作用能被放线菌酮或硫酸锌所拮抗。
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中图号：R73534 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0256-04
Antagonism of cycloheximide and zinc sulfate on
catechins-induced apoptosis of LoVo cells
TAN Xiao-hua,ZHANG Ya-li，JIANG Bo,et al.
Institute For Digestive Diseases,Nan Fang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515,China
【Abstract】 Objective：To investigate the apoptosis and its antagonism is induced by catechines in a colon cell line,LoVo,in culture.Methods：After treatment of LoVo cells with catethines,in the presence or the absence of cycloheximide and zinc sulfate,the apoptosis was detected by gel electrophoresis,fluorescent light microscope and flow cytometry.Results：After the LoVo cells were treated by catechines,it was shown that： 1).Typical nuclear condensation and fragmentation were observed by fluorescent light microscop.2).“ DNA ladder”appeared on a 2% agarose gel.However,the DNA ladder disappeared in the presence of cycloheximide or zinc sulfate.3).Hypodiploid peak appeared on the histogram of flow cytometry with PI staining.Moreover,there are concentration-dependent and time-dependent effects on the apoptosis of LoVo cells induced by catechines.Conclusion：Catechines have an effect of inducing apoptosis of LoVo cells,which is antagonized by cycloheximide and zinc sulfate.
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Key words：Catechins；Cycloheximide;Colon cancer cell line;Apoptosis； Antagonism
已经证实，绿茶水提取物能诱导体外培养的大肠癌LoVo细胞的凋亡〔1〕，为了进一步探讨绿茶诱导肿瘤细胞凋亡的有效成分，我们用绿茶的主要组份儿茶素处理LoVo细胞，发现其同样能诱导该细胞的凋亡。并且，儿茶素诱导LoVo细胞凋亡的作用能被放线菌酮和硫酸锌所拮抗。
1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 儿茶素的配制：儿茶素由湖南农业大学茶叶研究所王增盛教授惠赠，用不含血清的RPMI1640培养液配制成浓度为10mg/ml的储存液，用时根据需要稀释成不同浓度。
1.1.2 放线菌酮(Sigma)溶液：用三蒸水配成1mg/ml的储存液，0.22μm的滤器过滤除菌，4℃保存。
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1.1.3 硫酸锌(Sigma)溶液：用三蒸水配成1mol/L的储存液，0.22μm的滤器过滤除菌，4℃保存。
1.2 细胞系
LoVo细胞(我所保存)体外用RPMI1640(Gibco)培养液(内含15%小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml的青链霉素)，置5%CO2孵箱中培养。
1.3 方法
1.3.1 琼脂糖凝胶电泳：将儿茶素(终浓度为200～400μg/ml)加入对数生长期的LoVo细胞中，继续培养24h收集细胞；另一组实验中，细胞中同时加儿茶素及放线菌酮(1.0～2.0μg/ml)或硫酸锌(10～50mmol/L)，作用24h后收集细胞。按文献〔1〕介绍的方法进行。
1.3.2 荧光显微镜观察：将LoVo细胞接种在放有盖玻片的六孔板中，让细胞在盖玻片上生长至对数生长期，换液加入儿茶素(终浓度为300μg/ml)，在5%CO2培养箱继续培养24h后，加Hoechst 33342(Sigma)(终浓度为15μg/ml)避光孵育30分钟，取出盖玻片用1%多聚甲醛固定10分钟后，用PBS洗一次，中性树胶封片。荧光显微镜(OlympusBH2,Japan)下观察，有3个或以上的染色体片段可认为是凋亡细胞〔2〕。
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1.3.3 流式细胞仪检测：LoVo细胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶(Serva)消化传代至50ml的培养瓶，细胞数为1×105/ml。待生长至对数生长期，换液；有或没有放线菌酮或硫酸锌存在时加不同浓度的儿茶素并分别在处理12和24小时收集细胞。对照为不加儿茶素。参照文献〔3〕介绍的方法进行染色，在我校中心实验室流式细胞仪(EPICSELITE，CoulterCorporation,U.S.A)分析。
2 结果
2.1 儿茶素诱导LoVo细胞凋亡
在倒置显微镜下，人结肠癌细胞株LoVo细胞呈梭形，或多角形生长，加入不同浓度的儿茶素后，两株细胞生长受到抑制，增殖速度明显减慢；细胞逐渐由梭状或多角形变成圆形，细胞透明度下降，细胞体积变小(图1A)。上述现象随儿茶素浓度的增大愈加明显，显现时间和剂量效应关系。在荧光显微镜下，可见典型的凋亡细胞形态学改变：核固缩和核碎裂(图2)。
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图1 倒置显微镜显示：A.正常LoVo细胞；B.儿茶素(300μg/ml)处理LoVo细胞后24h；
C.儿茶素(300μ/ml)加放线菌酮(10μg/ml)处理LoVo细胞后24h
图2 荧光显微镜：A.对照LoVo细胞；B.儿茶素(300μg/ml)处理LoVo细胞后24h，示凋亡细胞核固缩、碎裂(箭头所指)。(×400)
流式细胞仪结果显示儿茶素诱导LoVo细胞凋亡在用PI染色的流式细胞仪直方图上，出现亚二倍体峰，并具有明显的剂量和时间效应关系。没处理的LoVo细胞自然凋亡率为2.2%，而在用50、200、400μg/ml三种浓度的儿茶素作用24h的凋亡率分别为：16.8%、27.6%和43.4%；在用200μg/ml的浓度作用12h时，凋亡率为12.1%(图3)。
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图3 流式细胞仪结果
A.对照LoVo细胞；B.儿茶素50μg/ml处理24h,C.200μg/ml处理24h,D.400μg/ml处理24h；E.200μg/ml处理12h;F.放线菌酮(1.0μg/ml)
加儿茶素(200μg/ml)处理24小时；G.硫酸锌(50mmol/L)加儿茶素(200μg/ml)处理24小时。
琼脂糖凝胶电泳显示，200～400μg/ml浓度的儿茶素处理24小时后，呈现凋亡细胞特征性的“梯状”带(图4)。
图4 琼脂糖凝电泳：A.Marker；B.非处理细胞基因组带；
C、D.儿茶素(浓度分别为200和400μg/ml)处理LoVo细胞后24h示‘梯形’带
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2.2 放线菌酮和硫酸锌对儿茶素诱导的LoVo细胞凋亡的拮抗作用
用1.0～2.0μg/ml的放线菌酮或50mmol/L硫酸锌与儿茶素共同作用于LoVo细胞，倒置显微镜下细胞形态学上的改变远不如单独用儿茶素处理的LoVo细胞变化明显，具有凋亡细胞较特征的形态学改变如细胞变圆、细胞浆固缩、细胞体积变小的细胞明显减少(图1B)；琼脂糖凝胶电泳结果显示放线菌酮或硫酸锌均能抑制儿茶素对两株肿瘤细胞所致的“梯状”带形成(图5)；用10μg/ml的放线菌酮或50mmol/L的硫酸锌与200μg/ml儿茶素共同加入细胞中培养24小时，流式细胞仪显示LoVo细胞的凋亡率从27.6%分别降至5.2%和6.7%，可见放线菌酮或硫酸西辛对儿茶素诱导L0V0细胞有明显的拮抗作用(图2)。
图5 琼脂糖凝胶电泳：A.儿茶素(400μg/ml);B.儿茶素(400μg/ml)加放线菌酮(2.0μg/ml)；
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C.儿茶素(400μg/ml)加硫酸锌(50mmol/L)；均处理LoVo细胞后24h
3 讨论
茶叶的抗癌机理尚不完全明了。近年来，有报道茶叶的一些成分诱导体外培养的肿瘤细胞的凋亡。我们用绿茶水提取物直接处理LoVo细胞诱导其凋亡〔1〕，而Hibasami等首先证实几种儿茶素单体如EGC、EGCG和ECG能诱发人淋巴性白血病Molt4B细胞的凋亡〔4〕，随后又证明了茶多酚及其单体可诱导多种肿瘤细胞包括肺癌〔5〕，结肠癌〔5〕，胃癌〔6，7〕和上皮细胞癌〔8〕细胞等的凋亡，说明茶叶诱导细胞凋亡是其抗癌的重要机制之一。这一机制在一定程度上可以解释流行病学研究中多饮茶的人群其大肠癌的发病率较低的现象。
儿茶素诱导肿瘤细胞凋亡机理尚不明了，蛋白合成抑制剂放线菌酮能拮抗儿茶素诱导的LoVo细胞的凋亡，说明儿茶素诱导该细胞凋亡时需要新的蛋白质合成〔9〕；而内原性核酸酶抑制剂Zn2+也能拮抗儿茶素所致的“梯状”带形成，说明儿茶素作用于LoVo细胞时，激活了内原性核酸酶〔10〕，将DNA裂解成180～200bp的寡核苷酸片段或其多聚体形成特征性的“梯状”带。对其机理的进一步研究，将有助于阐明茶叶的抗癌机理，并为开发茶叶组分用于临床治疗提供理论依据。
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参考文献
1 谭晓华，张亚历，姜泊，等.绿茶水提取物诱导体外培养的大肠癌LoVo细胞的凋亡〔J〕.癌症，1998，17(3)：11.
2 Bose R,Verheij M,Haimovitz Friedman A,et al.Ceramide synthase mediates daunorubicin-induced apoptosis： an alternative mechanism for generating death signals〔J〕.Cell,1995,82：405.
3 张亚历，姜泊，周殿元.程序化细胞死亡常用研究方法〔A〕.见：姜泊等主编：分子生物学用3验方法〔M〕.北京.人民军医出版社，1996：170.
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4 Hibasami H,Achiwa Y,Fujikawa T,et al.Induction of programmed cell death(apoptosis)in human lymphoid leukemia cells by catechin compounds〔J〕 .Anticancer Res,1996,16：1943.
5 Yang GY,Liao J,Kim K,et al.Inhibition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols〔J〕.Carcinogenesis,1998,19：611.
6 Hibasami H,Komiya T,Achiwa Y,et al.Induction of apoptosis in human stomach cancer cells by green tea catechins 〔J〕.Oncol.Rep,1998,5：527.
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7 赵燕，曹进.茶多酚诱导人胃癌细胞凋亡〔J〕.湖南医科大学学报，1997，22(5)：384.
8 Ahmad N,Feyes DK,Nieminen AL,et al.Green tea consituent epigallocatechin-3-gallate and induction of apoptosis and cell cycle arrest in human carcinoma cells〔J〕.J Natl Cancer Inst,1997,89：1881.
9 Gong J,Li X,Darzynkiewicz Z.Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin〔J〕.J Cell Physiol,1993,157：263.
10 Ribeiro JM,Carson DA.Ca2+/Mg(2+)-dependent endonuclease from human spleen： purification,properties,and role in apoptosis〔J〕.Biochemistry,1993,32：9129.
收稿日期：1998-08-03；修回日期：1999-01-18, 百拇医药