色氨酸酶基因工程菌的活力及其与表达关系研究
作者：韦平和 吴梧桐 余方兵
单位：中国药科大学生物制药学院，南京 210009
关键词：色氨酸酶基因工程菌；L-色氨酸；吲哚；活力；表达
摘 要 选择并改进了以L 摘 要 选择并改进了以L-色氨酸为底物测定吲哚的生成量作为色氨酸酶活力测定方法，应用改进的方法测定了7株工程菌色氨酸酶的活力，也对不同诱导时间色氨酸酶的表达与活力关系进行了比较。结果表明工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高，其中11号工程菌比宿主菌高16倍。诱导表达1h时酶活最高，但酶活高低并不与其表达量呈平行关系。
Study on the Activity of Tryptophanase in
Genet ic Engineering Strains and Relationship
, http://www.100md.com
between It and Expression
Wei Pinghe, Wu Wutong , Yu Fangbing
(School of biopharmaceut ics, China Pharmacetical University,Nanjing 210009)
Abstract The enzyme asssay method based on production of indole from L-try ptophan was selected and improved to measure activities of tryptophanase from s even genetic engineering strains. The relationship between expression and activ ity of tryptophanase after different induction time is also compared. The resul ts showed that the activities of tryptophanase from genetic engineering strains are greater than that of host strain, and the enzyme activity of No.11 was of 1 6 times as high as that of the host. The enzyme activity reached maximum after one hour induction, but it was not parallel to enzyme expression.
, 百拇医药
Key Words Tryptophanase genetic engineering strain, L-Tryptophan, Indole, Ac tivity, Expression
L-色氨酸是人体内的重要必需氨基酸,主要用于制造复方氨基酸营养输液,并可单独作为抗抑郁剂和催眠剂。色氨酸酶(EC4.1.99.1)在正常情况下催化L-色氨酸降解生成丙酮酸、吲哚和氨，但在高浓度的丙酮酸和氨条件下，它也能有效地催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸[1]。色氨酸酶的活力测定方法主要有三种：一是Wood等[2]提出的以色氨酸为底物测定吲哚的生成量,该法缺点是吲哚对色氨酸酶有一定的抑制及操作较繁;二是Nakazawa[3]等采用的以丙酮酸、吲哚和氨为底物测定色氨酸的合成量,该法生成的色氨酸可用纸层析或HPLC测定,但前者费时、后者费用较高；三是Suelter[4]发明的以S-O-硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)为底物生成O-硝基苯硫酚的直接分光光度法，该法虽然简便、灵敏，但底物SOPC需自行合成，且前体邻硝基苯胺不易购得，合成收率偏低。本文对上述第一种酶活测定方法进行了改进，并用改进的方法测定了色氨酸酶基因工程菌的活力，同时也探讨了工程菌在不同诱导时间下其表达与酶活的关系，旨在筛选出高活力的色氨酸酶工程菌，为工业化酶法生产L-色氨酸提供材料上的保证。
, http://www.100md.com
1 材 料
1.1 菌株和培养基
E.coliBL21(DE3)由南京军区医学研究所李光富惠赠,色氨酸酶基因工程菌由本室构建,LB培养基。
1.2 试剂
异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Promega公司,磷酸吡哆醛(PLP)购自Sigma公司,L-色氨酸、吲哚、还原型谷胱甘肽(GSH)和对二甲氨基苯甲醛(PDAB)分别购自上海伯奥生物技术公司、上海双喜香料助剂厂、中国新兴医药保健品科技开发公司和上海试剂三厂,其它试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
Beckman高速冷冻离心机,CS-900薄层扫描仪(日本岛津公司),JY88-II型超声波细胞粉碎机(浙江宁波新芝科器研究所),721型分光光度计(上海第三分析仪器厂),DYY-III4型稳压稳流高压电泳仪(北京六一仪器厂)。
, 百拇医药
2 方 法
2.1 色氨酸酶的诱导表达
取工程菌株一个单菌落接种于LB培养基，37℃培养过夜以获得饱和培养物，将饱和培养物以1%接种于含Amp(100μg/ml)的LB培养基中，37℃继续培养2h后，添加IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达色氨酸酶。
2.2 粗提酶液的获得
将诱导一定时间后的培养液于5000r/min离心10min，收集的沉淀用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)悬浮,并以15KHz或最大功率超声波处理3min，经超声破碎后的细胞悬液离心15min，上清用作粗提色氨酸酶液。
2.3 酶活测定方法的建立
2.3.1 标准曲线的制作 精密称取吲哚5mg，用甲苯定容至50ml，配制100μg/ml的吲哚标准溶液,分别取吲哚标准溶液10，20，30，40和50μl加入带塞试管,用甲苯补足至1.0ml,再加0.4ml蒸馏水和3ml5%PDAB和5%硫酸正丁醇混合显色液,摇匀,静置30min后于570nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，吲哚浓度为横坐标得标准曲线回归方程A570＝0.03900+0.08278C，相关系数r＝0.9997，在0～6μg/ml范围内呈良好线性关系(n＝5)。
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2.3.2 测活反应体系的确立 在10ml三角瓶中按顺序分别添加20μl0.20mg/mlPLP溶液，10μl0.005mol/LGSH溶液，270μl粗提色氨酸酶液(pH8.0，约100mg湿菌体所含酶量)，上述0.3ml溶液用1.0ml甲苯覆盖,37℃保温5min后加入100μl5.0mg/mlL-色氨酸溶液，置37℃摇床轻缓振荡使反应进行10min，然后添加3ml5%PDAB和5%硫酸正丁醇混合显色液中止反应,且形成不同深浅的玫瑰红色，30min后于570nm处进行吸光度定量测定。色氨酸酶活力定义:在上述反应条件下，37℃、10min催化形成0.01μmol吲哚所需要的酶量为一个活力单位。
3 结 果
3.1 色氨酸酶工程菌的活力测定
色氨酸酶工程菌4，9，11，20，26，36和53号以及宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导1h后酶活测定结果见表1。由表1可知:工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高，其中11号比宿主菌高16倍。
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Tab 1 Comparison of genetic engineering strains
and host strain in activity of tryptophanase
No.
4
9
11
20
26
36
53
Host
, http://www.100md.com
A570
0.375*
0.465**
0.427*
0.288*
0.455
0.340
0.338*
0.141
Indole
16.24
, 百拇医药
11.30
18.75
12.04
5.03
3.64
14.44
1.23
Units
13.9
9.6
16.0
10.3
4.3
, http://www.100md.com
3.1
12.3
1.0
* dilutedfourfolds ** diluted two folds
3.2 不同诱导时间色氨酸酶表达与活力的关系
将分别诱导0.5，1，2，3h的培养物,经适当处理后取上清20μl进行SDS-PAGE检测,电泳结果见图1。薄层扫描显示：诱导0.5，1、2，3h的色氨酸酶表达量分别占菌体总蛋白的45.0%，69.4%，76.9%和77.4%。同样，将分别诱导0.5，1，2，3，4h的培养物,经超声波破碎细胞处理后进行酶活测定，结果见表2。从图1和薄层扫描结果可知:在0～3h诱导时间内色氨酸酶的表达量随诱导时间的延长而增加，并逐步趋于稳定。由表2可知：色氨酸酶的活力并不随诱导时间的延长而增加，而是在诱导1h左右呈现最高活力。不同诱导时间下，色氨酸酶表达与活力的关系见图2。
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Lane 1:without induction by IPTG; Lane 2,3,4,5: 0.5, 1,2,3h after induction respectively
Fig 1 The SDS-PAGE results of crude extracts after different induction time
Tab 2 Effect of different induction time on the activity of tryptophanase
Induction time(h)
0.5
1
2
, 百拇医药
3
4
Units(No.4)
2.38
13.9
11.28
5.66
4.64
Units(No.53)
1.87
12.3
9 .61
5.42
, 百拇医药
5.31
◆ enzyme expression; ■ enzyme activity
Fig 2 The relationship between the expression and activity of
tryptophanase after different induction time.
4 讨 论
4.1 本文在比较、分析了三种色氨酸酶活力测定方法的基础上，选择以色氨酸为底物测定吲哚的生成量作为活力测定方法，并加以改进,基本克服了这一经典方法的主要缺点即吲哚对色氨酸酶的抑制作用和操作繁琐[4]。在改进的测活方法中，测活体系采用两相(水相和甲苯相)反应系统，PLP，GSH，L-色氨酸和色氨酸酶处于水相，而反应中产生的吲哚难溶于水，易溶于甲苯，这样就及时地转移了对色氨酸酶有一定抑制作用的吲哚，从而能较真实的反映工程菌色氨酸酶的活力高低.。
, 百拇医药
4.2 在建立测活方法时,除了确定了该方法的线性范围和回归方程外,还考察了测定波长、显色时间、显色剂用量和稳定性等因素。将显色后的反应液在500～600nm范围内扫描,最大吸收波长为570nm。在显色剂用量为3ml的情况下，按10、20、30、40、50和60min分次测定吸光度，30min后显色稳定。在显色时间为30min的情况下，按2、2.5、3、3.5和4ml显色剂用量分次测定吸光度，显色剂用量为3～3.5ml显色稳定。因此，选择570nm为测定波长、30min为显色时间、3ml为显色剂用量。这与Wood等报道的560nm、20min和3.5ml稍有不同。本实验未作具吲哚核的色氨酸干扰实验，有待补充和完善。超声波破碎细胞的强度、时间以及超声时所产生的热量，是影响本测活方法精确性、可重复性的重要因素，也需经一步优化和完善。
4.3 SDS-PAGE和薄层扫描结果表明,工程菌色氨酸酶表达量占菌体总蛋白的60%以上,与Studier和Moffatt[5]报道的利用T7RNA聚合酶可指导靶蛋白高水平表达(诱导3h左右表达量在50%以上)相一致，从而进一步证明了T7噬菌体RNA聚合酶-启动了表达系统在克隆化基因高效表达方面的可行性和有效性。酶活测定结果同样表明，7株色氨酸酶工程菌的活力比宿主菌都有不同程度的提高，有的可高达16倍。就表达量和活力大小而言，本文的研究结果比Shibatani[6]、Tani等[7]和张玉彬等[8]报道的均有明显提高。另外，在一定诱导时间范围内，工程菌酶活大小与表达量并不呈平行关系。当表达量为69.4%时酶活最高,76.9%时有所下降,77.4%时则显著降低。究其原因，可能是当色氨酸酶大量表达时，酶分子之间的离子键、疏水键或二硫键等因素发生作用，导致其空间结构发生变化，从而影响酶活；再是当色氨酸酶过量表达时，细菌σ因子的蛋白水解能力达到饱和，表达产物积累形成多聚体，进而形成包涵体，使得酶活显著降低。
, 百拇医药
参考文献
1 Watanabe T,Snell E. Reversibility of the trptophanase reaction: synthesis of tryptophan from indole ,pyruvate and ammonia. Proc Natl Acad Sci,1972,69(5)∶1086
2 Wood W,Gunsalus I,Umbreit W. Function of pyridoxal phosphate:resolutio n and purification of the tryptophanase enzyme of E coli. J Biol Chem,1 947,170∶313
3 Nakazawa H,Enei H,Okumura S,et al. Synthesis of L-tryptophan from pyruvate,ammonia and indole. Agr Biol Chem,1972,36(13)∶2523
, 百拇医药
4 Suelter C,Wang J,Snell E. Direct spectrophotometric assay of tryptophanase . FEBS Letters,1976,66(2)∶230
5 Studier F,Moffatt A . Use of Bacteiophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level express ion of cloned genes. J Mol Biol,1986,189∶113
6 Shibatani T,Omori k,Tosa T. Cloning of tryptophanase gene of Alcaligen es fecalis for effective production of L-tryptophan. American Society Micr obiology Annual Meeting,1987,March 1～8, Poster presentation
7 Tani S,Ts ujimoto N,kawata Y, et al.Overproduction and crystallization of tryptophanase from recombinant cellls of E coli.Biotechnology and Applied Biochemistry,1990,12∶28
8 张玉彬,王旻,吴梧桐，等.L-色氨酸酶 基因工程菌的构建.中国药科大学学报,1996,27(10) ∶624
收稿日期:1998-10-14, http://www.100md.com
单位：中国药科大学生物制药学院，南京 210009
关键词：色氨酸酶基因工程菌；L-色氨酸；吲哚；活力；表达
摘 要 选择并改进了以L 摘 要 选择并改进了以L-色氨酸为底物测定吲哚的生成量作为色氨酸酶活力测定方法，应用改进的方法测定了7株工程菌色氨酸酶的活力，也对不同诱导时间色氨酸酶的表达与活力关系进行了比较。结果表明工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高，其中11号工程菌比宿主菌高16倍。诱导表达1h时酶活最高，但酶活高低并不与其表达量呈平行关系。
Study on the Activity of Tryptophanase in
Genet ic Engineering Strains and Relationship
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between It and Expression
Wei Pinghe, Wu Wutong , Yu Fangbing
(School of biopharmaceut ics, China Pharmacetical University,Nanjing 210009)
Abstract The enzyme asssay method based on production of indole from L-try ptophan was selected and improved to measure activities of tryptophanase from s even genetic engineering strains. The relationship between expression and activ ity of tryptophanase after different induction time is also compared. The resul ts showed that the activities of tryptophanase from genetic engineering strains are greater than that of host strain, and the enzyme activity of No.11 was of 1 6 times as high as that of the host. The enzyme activity reached maximum after one hour induction, but it was not parallel to enzyme expression.
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Key Words Tryptophanase genetic engineering strain, L-Tryptophan, Indole, Ac tivity, Expression
L-色氨酸是人体内的重要必需氨基酸,主要用于制造复方氨基酸营养输液,并可单独作为抗抑郁剂和催眠剂。色氨酸酶(EC4.1.99.1)在正常情况下催化L-色氨酸降解生成丙酮酸、吲哚和氨，但在高浓度的丙酮酸和氨条件下，它也能有效地催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸[1]。色氨酸酶的活力测定方法主要有三种：一是Wood等[2]提出的以色氨酸为底物测定吲哚的生成量,该法缺点是吲哚对色氨酸酶有一定的抑制及操作较繁;二是Nakazawa[3]等采用的以丙酮酸、吲哚和氨为底物测定色氨酸的合成量,该法生成的色氨酸可用纸层析或HPLC测定,但前者费时、后者费用较高；三是Suelter[4]发明的以S-O-硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)为底物生成O-硝基苯硫酚的直接分光光度法，该法虽然简便、灵敏，但底物SOPC需自行合成，且前体邻硝基苯胺不易购得，合成收率偏低。本文对上述第一种酶活测定方法进行了改进，并用改进的方法测定了色氨酸酶基因工程菌的活力，同时也探讨了工程菌在不同诱导时间下其表达与酶活的关系，旨在筛选出高活力的色氨酸酶工程菌，为工业化酶法生产L-色氨酸提供材料上的保证。
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1 材 料
1.1 菌株和培养基
E.coliBL21(DE3)由南京军区医学研究所李光富惠赠,色氨酸酶基因工程菌由本室构建,LB培养基。
1.2 试剂
异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Promega公司,磷酸吡哆醛(PLP)购自Sigma公司,L-色氨酸、吲哚、还原型谷胱甘肽(GSH)和对二甲氨基苯甲醛(PDAB)分别购自上海伯奥生物技术公司、上海双喜香料助剂厂、中国新兴医药保健品科技开发公司和上海试剂三厂,其它试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
Beckman高速冷冻离心机,CS-900薄层扫描仪(日本岛津公司),JY88-II型超声波细胞粉碎机(浙江宁波新芝科器研究所),721型分光光度计(上海第三分析仪器厂),DYY-III4型稳压稳流高压电泳仪(北京六一仪器厂)。
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2 方 法
2.1 色氨酸酶的诱导表达
取工程菌株一个单菌落接种于LB培养基，37℃培养过夜以获得饱和培养物，将饱和培养物以1%接种于含Amp(100μg/ml)的LB培养基中，37℃继续培养2h后，添加IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达色氨酸酶。
2.2 粗提酶液的获得
将诱导一定时间后的培养液于5000r/min离心10min，收集的沉淀用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)悬浮,并以15KHz或最大功率超声波处理3min，经超声破碎后的细胞悬液离心15min，上清用作粗提色氨酸酶液。
2.3 酶活测定方法的建立
2.3.1 标准曲线的制作 精密称取吲哚5mg，用甲苯定容至50ml，配制100μg/ml的吲哚标准溶液,分别取吲哚标准溶液10，20，30，40和50μl加入带塞试管,用甲苯补足至1.0ml,再加0.4ml蒸馏水和3ml5%PDAB和5%硫酸正丁醇混合显色液,摇匀,静置30min后于570nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，吲哚浓度为横坐标得标准曲线回归方程A570＝0.03900+0.08278C，相关系数r＝0.9997，在0～6μg/ml范围内呈良好线性关系(n＝5)。
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2.3.2 测活反应体系的确立 在10ml三角瓶中按顺序分别添加20μl0.20mg/mlPLP溶液，10μl0.005mol/LGSH溶液，270μl粗提色氨酸酶液(pH8.0，约100mg湿菌体所含酶量)，上述0.3ml溶液用1.0ml甲苯覆盖,37℃保温5min后加入100μl5.0mg/mlL-色氨酸溶液，置37℃摇床轻缓振荡使反应进行10min，然后添加3ml5%PDAB和5%硫酸正丁醇混合显色液中止反应,且形成不同深浅的玫瑰红色，30min后于570nm处进行吸光度定量测定。色氨酸酶活力定义:在上述反应条件下，37℃、10min催化形成0.01μmol吲哚所需要的酶量为一个活力单位。
3 结 果
3.1 色氨酸酶工程菌的活力测定
色氨酸酶工程菌4，9，11，20，26，36和53号以及宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导1h后酶活测定结果见表1。由表1可知:工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高，其中11号比宿主菌高16倍。
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Tab 1 Comparison of genetic engineering strains
and host strain in activity of tryptophanase
No.
4
9
11
20
26
36
53
Host
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A570
0.375*
0.465**
0.427*
0.288*
0.455
0.340
0.338*
0.141
Indole
16.24
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11.30
18.75
12.04
5.03
3.64
14.44
1.23
Units
13.9
9.6
16.0
10.3
4.3
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3.1
12.3
1.0
* dilutedfourfolds ** diluted two folds
3.2 不同诱导时间色氨酸酶表达与活力的关系
将分别诱导0.5，1，2，3h的培养物,经适当处理后取上清20μl进行SDS-PAGE检测,电泳结果见图1。薄层扫描显示：诱导0.5，1、2，3h的色氨酸酶表达量分别占菌体总蛋白的45.0%，69.4%，76.9%和77.4%。同样，将分别诱导0.5，1，2，3，4h的培养物,经超声波破碎细胞处理后进行酶活测定，结果见表2。从图1和薄层扫描结果可知:在0～3h诱导时间内色氨酸酶的表达量随诱导时间的延长而增加，并逐步趋于稳定。由表2可知：色氨酸酶的活力并不随诱导时间的延长而增加，而是在诱导1h左右呈现最高活力。不同诱导时间下，色氨酸酶表达与活力的关系见图2。
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Lane 1:without induction by IPTG; Lane 2,3,4,5: 0.5, 1,2,3h after induction respectively
Fig 1 The SDS-PAGE results of crude extracts after different induction time
Tab 2 Effect of different induction time on the activity of tryptophanase
Induction time(h)
0.5
1
2
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3
4
Units(No.4)
2.38
13.9
11.28
5.66
4.64
Units(No.53)
1.87
12.3
9 .61
5.42
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5.31
◆ enzyme expression; ■ enzyme activity
Fig 2 The relationship between the expression and activity of
tryptophanase after different induction time.
4 讨 论
4.1 本文在比较、分析了三种色氨酸酶活力测定方法的基础上，选择以色氨酸为底物测定吲哚的生成量作为活力测定方法，并加以改进,基本克服了这一经典方法的主要缺点即吲哚对色氨酸酶的抑制作用和操作繁琐[4]。在改进的测活方法中，测活体系采用两相(水相和甲苯相)反应系统，PLP，GSH，L-色氨酸和色氨酸酶处于水相，而反应中产生的吲哚难溶于水，易溶于甲苯，这样就及时地转移了对色氨酸酶有一定抑制作用的吲哚，从而能较真实的反映工程菌色氨酸酶的活力高低.。
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4.2 在建立测活方法时,除了确定了该方法的线性范围和回归方程外,还考察了测定波长、显色时间、显色剂用量和稳定性等因素。将显色后的反应液在500～600nm范围内扫描,最大吸收波长为570nm。在显色剂用量为3ml的情况下，按10、20、30、40、50和60min分次测定吸光度，30min后显色稳定。在显色时间为30min的情况下，按2、2.5、3、3.5和4ml显色剂用量分次测定吸光度，显色剂用量为3～3.5ml显色稳定。因此，选择570nm为测定波长、30min为显色时间、3ml为显色剂用量。这与Wood等报道的560nm、20min和3.5ml稍有不同。本实验未作具吲哚核的色氨酸干扰实验，有待补充和完善。超声波破碎细胞的强度、时间以及超声时所产生的热量，是影响本测活方法精确性、可重复性的重要因素，也需经一步优化和完善。
4.3 SDS-PAGE和薄层扫描结果表明,工程菌色氨酸酶表达量占菌体总蛋白的60%以上,与Studier和Moffatt[5]报道的利用T7RNA聚合酶可指导靶蛋白高水平表达(诱导3h左右表达量在50%以上)相一致，从而进一步证明了T7噬菌体RNA聚合酶-启动了表达系统在克隆化基因高效表达方面的可行性和有效性。酶活测定结果同样表明，7株色氨酸酶工程菌的活力比宿主菌都有不同程度的提高，有的可高达16倍。就表达量和活力大小而言，本文的研究结果比Shibatani[6]、Tani等[7]和张玉彬等[8]报道的均有明显提高。另外，在一定诱导时间范围内，工程菌酶活大小与表达量并不呈平行关系。当表达量为69.4%时酶活最高,76.9%时有所下降,77.4%时则显著降低。究其原因，可能是当色氨酸酶大量表达时，酶分子之间的离子键、疏水键或二硫键等因素发生作用，导致其空间结构发生变化，从而影响酶活；再是当色氨酸酶过量表达时，细菌σ因子的蛋白水解能力达到饱和，表达产物积累形成多聚体，进而形成包涵体，使得酶活显著降低。
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参考文献
1 Watanabe T,Snell E. Reversibility of the trptophanase reaction: synthesis of tryptophan from indole ,pyruvate and ammonia. Proc Natl Acad Sci,1972,69(5)∶1086
2 Wood W,Gunsalus I,Umbreit W. Function of pyridoxal phosphate:resolutio n and purification of the tryptophanase enzyme of E coli. J Biol Chem,1 947,170∶313
3 Nakazawa H,Enei H,Okumura S,et al. Synthesis of L-tryptophan from pyruvate,ammonia and indole. Agr Biol Chem,1972,36(13)∶2523
, 百拇医药
4 Suelter C,Wang J,Snell E. Direct spectrophotometric assay of tryptophanase . FEBS Letters,1976,66(2)∶230
5 Studier F,Moffatt A . Use of Bacteiophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level express ion of cloned genes. J Mol Biol,1986,189∶113
6 Shibatani T,Omori k,Tosa T. Cloning of tryptophanase gene of Alcaligen es fecalis for effective production of L-tryptophan. American Society Micr obiology Annual Meeting,1987,March 1～8, Poster presentation
7 Tani S,Ts ujimoto N,kawata Y, et al.Overproduction and crystallization of tryptophanase from recombinant cellls of E coli.Biotechnology and Applied Biochemistry,1990,12∶28
8 张玉彬,王旻,吴梧桐，等.L-色氨酸酶 基因工程菌的构建.中国药科大学学报,1996,27(10) ∶624
收稿日期:1998-10-14, http://www.100md.com