生物可降解聚酯类材料为载体的微球制备与结构形态
作者：陈建海 陈志良 侯连兵 刘世霆
单位：陈建海(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)；陈志良(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)；侯连兵(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)；刘世霆(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)
关键词：聚羟基丁酸酯；羟基戊酸酯共聚物；聚己内酯；结构形态；微球；药物载体
第一军医大学学报000408 摘要：目的 探讨药物控制释放载体与组织工程载体的制备方法与结构形态。方法 用新型生物可降解材料聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物[poly(hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) PHBV]、聚己内酯[poly(ε-caprolatone), PCL]及其共混物为基材，用乳化-溶剂蒸发法制备不同结构形态微球。结果 平均粒径为30.5μm，粒径分布较窄(跨距SPAN=1.18)，呈正态曲线分布。扫描电镜观察, PHBV微球表面呈不规则多孔皱缩结构形态; PCL微球表面光滑，无孔洞；PCL/PHBV共混微球呈有规则多孔洞形态结构，随着基材中PCL成分增加，微球孔洞大小与数目也随之增加。结论 通过选择不同生物材料及共混方法，改变微球的结构形态，以满足不同药物释放系统与组织工程对载体性能与形态的不同要求。
, http://www.100md.com
中图分类号：R318.08; R943 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0336-03
Preparation and structural morphology of microspheres based on the biodegradable polyester materials
CHEN Jian-hai, CHEN Zhi-liang, HOU Lian-bing, LIU Shi-ting
(Department of Pharmaceutical Science, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To explore the preparation methods and structural morphology of the carries for drug-controlled release and the tissue engineering. Methods Microspheres (MS) with different structural morphologies were prepared using the emulsion-solvent evaporation technique based on new biodegradable materials poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) (PHBV), poly(ε-caprolactone)(PCL), and their blend. Results The mean diameter of MS was 30.5 μm, The narrow size range was determined (SPAN=1.18). In PHBV microspheres shriveled appearance and irregular micropori on the surface were observed under scanning electron microscope. PCL microspheres had intact wall with a fairly smooth surface, essentially without pores. However, the microspheres with different blend ratios of PCL to PHBV had surface regularly perforated by numerous discrete micropores. The size and number of the pores increased with the proportion of PCL. Conclusion The structural morphology of microspherers could be changed via selecting different biomaterials and using blend methods to offer interesting possibilities for some special purpose of bioactive macromolecules and tissue engineering.
, http://www.100md.com
Key words：hydroxybutyrate; hydroxyvalerate; caprolactone; structural morphology; microspheres
在现代给药系统中，微粒(微球与微囊)工程已占有非常重要的地位[1]。对于控制释放系统而言，最重要的是载体材料及制作方法的选择。随着基因工程日益成熟，大分子类药物即多肽类、蛋白类、疫苗药物比例逐年增大，要解决这一类药物的控制释放问题，首先必需找出适合这一类亲水性大分子释放的基材与相应结构形态的载体。生物可降解材料聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物[poly (hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)，PHBV][2]、聚己内酯[poly(ε-caprolactone), PCL][3]及聚乳酸(D,L-polylactide, D，L-PLA)均为生物相容性较好的材料。本实验用PHBV、PCL、PHBV/D,L-PLA以及PHBV/PCL共混物为基材制备微球，比较它们的结构形态及成分变化对结构形态的影响，从而为活性大分子药物释放与组织工程的载体设计提供理论与实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
PHBV(Mw=630 kD，21% mol HV)购自Sigma公司；PCL(Mw=64 kD)由本实验室合成[3]；D,L-PLA(Mw=345 000)购自德国Gelheim公司；Polyvinyl alcohol (PVA)[Mr= 77 000～79 000，水解度88%]和其他试剂均为分析纯。
1.2 微球制备
采用溶剂蒸发技术[5]，称取不同质量比的PHBV/PCL与PHBV/D,L-PLA，分别溶于有机溶剂CH2Cl2中，边搅拌，边缓慢加入含有乳化剂PVA水相中，搅拌8 h。微球以三叶螺旋桨搅拌，转速800 r/min，样品转移于离心管，高速离心2 000 r/min，离心3 min，分离，用双蒸馏水洗涤3次。最后在液氮下冷冻干燥24 h，直至微球呈滚动粉末状颗粒，储于保干器备用。
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1.3 粒径及其分布测量
微球的平均粒径(VMD)与粒度分布(SPAN)直接用Masterzier MALVERN 2600测定。
1.4 表观形态分析
微球用Balzer Union SCD 030喷镀器于氩气气氛中喷金，表面形态用Philips 505扫描电镜带偏光照相设备进行观察拍照。
2 结果
1.1 共混材料对微球产率与成球率的影响
以PHBV为基本材料，分别与不同质量比例的PCL、D,L-PLA材料共混，按照上述实验制备方法制备微球，得到微球平均粒径范围处于30～40 μm之间，粒径分布为1.18，说明共混材料对微球的粒径影响不明显，但对微球产率与成球水平有明显影响。产率的评价，是指经洗涤的干燥后微球重量占聚合物总投料的百分数；成球水平评价是指每批样品随机在电镜下观察50个微球，其中圆形完整微球占其总数的百分数。不同材料共混对产率与成球率影响见表1。当PHBV与PCL为单一材料制备微球时的产率与成球率达到最高，随着PCL量从10%增至30%(W/W)，产率和成球率与PHBV、PCL单独材料相比都明显下降(P<0.01)。洗涤微球产品时，可见到大量聚合物残渣碎片悬浮于水相中，然后被冲洗掉。D,L-PLA/PHBV共混材料时成球率与使用单独PHBV材料比较无明显差异(P>0.05)，而产率与成球率明显优于同样含量(30%)的PCL/PHBV共混材料(P<0.01)。
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表1 PHBV、PCL及其共混材料制备微球的产率与成球率(
±s)
Tab.1 Yield and sphericity of PHBV，PCL and their blend
(Mean±SD)
Polymer
Blend ratio(w/w)
Yield (%, n=3)
Sphericity (%, n=3)
PHBV
100/0
, 百拇医药
96±2
98±4
PHBV/PCL
90/10
89±2
85±3
PHBV/PCL
80/20
75±2
82±3
PHBV/PCL
70/30
68±6
, 百拇医药
75±4
PHBV/D,L-PLA
70/30
88±4
96±3
PCL
0/100
95±1
99±2
2.2 微球结构形态
经扫描电镜分析表观形态，可看出以单一PHBV制作微球成球性好、表面呈凹凸不平皱缩形态，并伴有少量无规则形状的微孔(图1A)。当加入PCL含量逐渐增大时(10%到30%)，微球表面形态发生明显变化(图1B、C、D)：(1)整体上从皱缩拓朴结构向较为平坦的拓朴结构改变；(2)孔洞从细小孔洞向较大孔洞转变；(3)孔洞从无规则型向规则型转变，孔洞边界从圆滑到呈断裂形态。当全部基材为PCL材料时，微球呈圆形，表面光滑，无孔洞，成球率高(图1F)。如果用D,L-PLA材料替代PCL材料与PHBV共混，此时微球表面拓朴结构变化正好相反，表面皱缩结构形态比PHBV微球明显减轻，微孔数量明显减少(图1E)。
, 百拇医药
图1 PHBV、PCL、PLA及其共混材料制得微球的扫描电镜照片
Fig.1 SEM photograph of microspheres prepared
from PHBV, PCL, D,L-PLA and their blend
A: PHBV; B: PHBV/PCL(90/10); C:PHBV/PCL(80/20);
D: PHBV/PCL(70/30); E:PHBV/D,L-PLA(70/30); F: PCL
3 讨论
在现代给药系统的微粒工程中，微粒的基材(载体)的选择至关重要。在制剂工艺中多种工艺参数对微粒的大小、形态和结构均有影响，但是载体本身的理化性质，如分子量、结晶度、亲疏水性等是最重要的，本研究表明材料特性决定了微球的结构形态。
, 百拇医药
溶剂蒸发过程是高聚物分子从溶液析出固化的过程，它伴随着高聚物分子链的收缩及构型改变的过程。机械性能差的高分子材料无法完全承受这种收缩，导致形态不完整的多孔拓朴结构形成。由于PHBV共聚物材料由“硬段”聚羟基丁酸酯和“软段”的聚羟基戊酸酯构成，前者链段以结晶形态存在，后者链段以无定形态嵌于结晶态链段中。当它们随着溶剂挥发时，先析出的“硬段”形成微球的骨架，后析出“软段”，由于收缩力作用,不能完全填满自己在溶液状态时所占有的全部空间，造成表面与内部皱缩，导致孔洞出现。当PHBV与PCL以二氯甲烷为共溶剂共混时，两种聚合物分子能均匀混合在同一溶剂中。随着溶剂的蒸发，聚合物分子链由“舒展状态”向“自身紧缩无规线团状态”发展，由于PHBV与PCL为两种“微相分离”的不相容材料[4]，当它们形成微球后，两相间收缩力不同，造成两相边界的“断裂”。PCL微相在搅拌与洗涤中，从PHBV相中“脱落”下来，形成了具有“断裂缺口样”的孔洞，该孔洞形状(图1D)完全不同于PHBV材料因溶剂蒸发形成的孔洞(图2)。当D,L-PLA代替PCL材料与PHBV共混时，由于D,L-PLA与PHBV有较好的相容性，随着溶剂的蒸发，呈无定形态的D,L-PLA聚合物分子链正好填补了PHBV微球的皱缩与孔洞，使其表面拓扑结构得到明显改善。PCL是半晶形的均聚物，它由结构相同的链段所组成，每个单体有6个碳原子，疏水性比PHBV、D,L-PLA均强。因此，溶剂挥发时，链段析出基本上是同步与均一的，表面形态完整光滑。
, 百拇医药
图2 PHBV表面形态的SEM照片
Fig.2 SEM photograph of surface morphology of the microspheres
生物可降解材料作为细胞生长依托的骨架，是组织工程的基础与关键。它的组织相容性、表面与内部的结构形态(如多孔性等)都直接影响细胞粘附与生长[5、6]。因此，研究载体的材料选择与结构形态具有重要意义。
致谢 Prof.S S Davis提供部分材料，谨此致谢。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970223，39970876)；军队医药科研基金资助项目(98M065)
作者简介：陈建海(1946-)，男，福建福州人，1982年毕业于北京大学，硕士，教授，电话：85141114-87236
, 百拇医药
参考文献：
[1] Scholes PD, Coombes AG, Davis MC, et al. Particle engineering of biodegradable colloids for site-specific drug delivery, in controlled drug delivery[M]. New York: American Chem. Society, 1997.77-120.
[2] Pouton CW, Akhtar S. Bio-synthetic polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery[J]. Adv drug deliv rev, 1996,18:133-62.
[3] 陈建海，宣为民，姜彩玉. 钛酸丁酯催化ε-已内酯聚合研究[J]. 高分子学报, 1993, 3:356-60.
, http://www.100md.com
[4] Embleton JK, Tighe BJ. Polymer for biodegradable medical devices[J]. J Microencapsul,1993, 10(3):341-52.
[5] 朴东旭，陈晓东，毛立江. 神经细胞生长行为仿生学思考 材料的形貌学作用[J]. 生物医学工程学杂志, 1999, 16(增刊):127-9.
[6] 张胜民，李世普，闫玉华，等. 骨组织工程用聚D,L-乳酸多孔三维结构的制备与表征[J]. 生物医学工程学杂志, 1999，16(增刊):105-6.
收稿日期：2000-01-06, 百拇医药
单位：陈建海(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)；陈志良(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)；侯连兵(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)；刘世霆(第一军医大学南方医院药学部 广东 广州 510515)
关键词：聚羟基丁酸酯；羟基戊酸酯共聚物；聚己内酯；结构形态；微球；药物载体
第一军医大学学报000408 摘要：目的 探讨药物控制释放载体与组织工程载体的制备方法与结构形态。方法 用新型生物可降解材料聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物[poly(hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) PHBV]、聚己内酯[poly(ε-caprolatone), PCL]及其共混物为基材，用乳化-溶剂蒸发法制备不同结构形态微球。结果 平均粒径为30.5μm，粒径分布较窄(跨距SPAN=1.18)，呈正态曲线分布。扫描电镜观察, PHBV微球表面呈不规则多孔皱缩结构形态; PCL微球表面光滑，无孔洞；PCL/PHBV共混微球呈有规则多孔洞形态结构，随着基材中PCL成分增加，微球孔洞大小与数目也随之增加。结论 通过选择不同生物材料及共混方法，改变微球的结构形态，以满足不同药物释放系统与组织工程对载体性能与形态的不同要求。
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中图分类号：R318.08; R943 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0336-03
Preparation and structural morphology of microspheres based on the biodegradable polyester materials
CHEN Jian-hai, CHEN Zhi-liang, HOU Lian-bing, LIU Shi-ting
(Department of Pharmaceutical Science, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
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Abstract: Objective To explore the preparation methods and structural morphology of the carries for drug-controlled release and the tissue engineering. Methods Microspheres (MS) with different structural morphologies were prepared using the emulsion-solvent evaporation technique based on new biodegradable materials poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) (PHBV), poly(ε-caprolactone)(PCL), and their blend. Results The mean diameter of MS was 30.5 μm, The narrow size range was determined (SPAN=1.18). In PHBV microspheres shriveled appearance and irregular micropori on the surface were observed under scanning electron microscope. PCL microspheres had intact wall with a fairly smooth surface, essentially without pores. However, the microspheres with different blend ratios of PCL to PHBV had surface regularly perforated by numerous discrete micropores. The size and number of the pores increased with the proportion of PCL. Conclusion The structural morphology of microspherers could be changed via selecting different biomaterials and using blend methods to offer interesting possibilities for some special purpose of bioactive macromolecules and tissue engineering.
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Key words：hydroxybutyrate; hydroxyvalerate; caprolactone; structural morphology; microspheres
在现代给药系统中，微粒(微球与微囊)工程已占有非常重要的地位[1]。对于控制释放系统而言，最重要的是载体材料及制作方法的选择。随着基因工程日益成熟，大分子类药物即多肽类、蛋白类、疫苗药物比例逐年增大，要解决这一类药物的控制释放问题，首先必需找出适合这一类亲水性大分子释放的基材与相应结构形态的载体。生物可降解材料聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物[poly (hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)，PHBV][2]、聚己内酯[poly(ε-caprolactone), PCL][3]及聚乳酸(D,L-polylactide, D，L-PLA)均为生物相容性较好的材料。本实验用PHBV、PCL、PHBV/D,L-PLA以及PHBV/PCL共混物为基材制备微球，比较它们的结构形态及成分变化对结构形态的影响，从而为活性大分子药物释放与组织工程的载体设计提供理论与实验依据。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂
PHBV(Mw=630 kD，21% mol HV)购自Sigma公司；PCL(Mw=64 kD)由本实验室合成[3]；D,L-PLA(Mw=345 000)购自德国Gelheim公司；Polyvinyl alcohol (PVA)[Mr= 77 000～79 000，水解度88%]和其他试剂均为分析纯。
1.2 微球制备
采用溶剂蒸发技术[5]，称取不同质量比的PHBV/PCL与PHBV/D,L-PLA，分别溶于有机溶剂CH2Cl2中，边搅拌，边缓慢加入含有乳化剂PVA水相中，搅拌8 h。微球以三叶螺旋桨搅拌，转速800 r/min，样品转移于离心管，高速离心2 000 r/min，离心3 min，分离，用双蒸馏水洗涤3次。最后在液氮下冷冻干燥24 h，直至微球呈滚动粉末状颗粒，储于保干器备用。
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1.3 粒径及其分布测量
微球的平均粒径(VMD)与粒度分布(SPAN)直接用Masterzier MALVERN 2600测定。
1.4 表观形态分析
微球用Balzer Union SCD 030喷镀器于氩气气氛中喷金，表面形态用Philips 505扫描电镜带偏光照相设备进行观察拍照。
2 结果
1.1 共混材料对微球产率与成球率的影响
以PHBV为基本材料，分别与不同质量比例的PCL、D,L-PLA材料共混，按照上述实验制备方法制备微球，得到微球平均粒径范围处于30～40 μm之间，粒径分布为1.18，说明共混材料对微球的粒径影响不明显，但对微球产率与成球水平有明显影响。产率的评价，是指经洗涤的干燥后微球重量占聚合物总投料的百分数；成球水平评价是指每批样品随机在电镜下观察50个微球，其中圆形完整微球占其总数的百分数。不同材料共混对产率与成球率影响见表1。当PHBV与PCL为单一材料制备微球时的产率与成球率达到最高，随着PCL量从10%增至30%(W/W)，产率和成球率与PHBV、PCL单独材料相比都明显下降(P<0.01)。洗涤微球产品时，可见到大量聚合物残渣碎片悬浮于水相中，然后被冲洗掉。D,L-PLA/PHBV共混材料时成球率与使用单独PHBV材料比较无明显差异(P>0.05)，而产率与成球率明显优于同样含量(30%)的PCL/PHBV共混材料(P<0.01)。
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表1 PHBV、PCL及其共混材料制备微球的产率与成球率(
±s)Tab.1 Yield and sphericity of PHBV，PCL and their blend
(Mean±SD)
Polymer
Blend ratio(w/w)
Yield (%, n=3)
Sphericity (%, n=3)
PHBV
100/0
, 百拇医药
96±2
98±4
PHBV/PCL
90/10
89±2
85±3
PHBV/PCL
80/20
75±2
82±3
PHBV/PCL
70/30
68±6
, 百拇医药
75±4
PHBV/D,L-PLA
70/30
88±4
96±3
PCL
0/100
95±1
99±2
2.2 微球结构形态
经扫描电镜分析表观形态，可看出以单一PHBV制作微球成球性好、表面呈凹凸不平皱缩形态，并伴有少量无规则形状的微孔(图1A)。当加入PCL含量逐渐增大时(10%到30%)，微球表面形态发生明显变化(图1B、C、D)：(1)整体上从皱缩拓朴结构向较为平坦的拓朴结构改变；(2)孔洞从细小孔洞向较大孔洞转变；(3)孔洞从无规则型向规则型转变，孔洞边界从圆滑到呈断裂形态。当全部基材为PCL材料时，微球呈圆形，表面光滑，无孔洞，成球率高(图1F)。如果用D,L-PLA材料替代PCL材料与PHBV共混，此时微球表面拓朴结构变化正好相反，表面皱缩结构形态比PHBV微球明显减轻，微孔数量明显减少(图1E)。
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图1 PHBV、PCL、PLA及其共混材料制得微球的扫描电镜照片
Fig.1 SEM photograph of microspheres prepared
from PHBV, PCL, D,L-PLA and their blend
A: PHBV; B: PHBV/PCL(90/10); C:PHBV/PCL(80/20);
D: PHBV/PCL(70/30); E:PHBV/D,L-PLA(70/30); F: PCL
3 讨论
在现代给药系统的微粒工程中，微粒的基材(载体)的选择至关重要。在制剂工艺中多种工艺参数对微粒的大小、形态和结构均有影响，但是载体本身的理化性质，如分子量、结晶度、亲疏水性等是最重要的，本研究表明材料特性决定了微球的结构形态。
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溶剂蒸发过程是高聚物分子从溶液析出固化的过程，它伴随着高聚物分子链的收缩及构型改变的过程。机械性能差的高分子材料无法完全承受这种收缩，导致形态不完整的多孔拓朴结构形成。由于PHBV共聚物材料由“硬段”聚羟基丁酸酯和“软段”的聚羟基戊酸酯构成，前者链段以结晶形态存在，后者链段以无定形态嵌于结晶态链段中。当它们随着溶剂挥发时，先析出的“硬段”形成微球的骨架，后析出“软段”，由于收缩力作用,不能完全填满自己在溶液状态时所占有的全部空间，造成表面与内部皱缩，导致孔洞出现。当PHBV与PCL以二氯甲烷为共溶剂共混时，两种聚合物分子能均匀混合在同一溶剂中。随着溶剂的蒸发，聚合物分子链由“舒展状态”向“自身紧缩无规线团状态”发展，由于PHBV与PCL为两种“微相分离”的不相容材料[4]，当它们形成微球后，两相间收缩力不同，造成两相边界的“断裂”。PCL微相在搅拌与洗涤中，从PHBV相中“脱落”下来，形成了具有“断裂缺口样”的孔洞，该孔洞形状(图1D)完全不同于PHBV材料因溶剂蒸发形成的孔洞(图2)。当D,L-PLA代替PCL材料与PHBV共混时，由于D,L-PLA与PHBV有较好的相容性，随着溶剂的蒸发，呈无定形态的D,L-PLA聚合物分子链正好填补了PHBV微球的皱缩与孔洞，使其表面拓扑结构得到明显改善。PCL是半晶形的均聚物，它由结构相同的链段所组成，每个单体有6个碳原子，疏水性比PHBV、D,L-PLA均强。因此，溶剂挥发时，链段析出基本上是同步与均一的，表面形态完整光滑。
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图2 PHBV表面形态的SEM照片
Fig.2 SEM photograph of surface morphology of the microspheres
生物可降解材料作为细胞生长依托的骨架，是组织工程的基础与关键。它的组织相容性、表面与内部的结构形态(如多孔性等)都直接影响细胞粘附与生长[5、6]。因此，研究载体的材料选择与结构形态具有重要意义。
致谢 Prof.S S Davis提供部分材料，谨此致谢。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970223，39970876)；军队医药科研基金资助项目(98M065)
作者简介：陈建海(1946-)，男，福建福州人，1982年毕业于北京大学，硕士，教授，电话：85141114-87236
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参考文献：
[1] Scholes PD, Coombes AG, Davis MC, et al. Particle engineering of biodegradable colloids for site-specific drug delivery, in controlled drug delivery[M]. New York: American Chem. Society, 1997.77-120.
[2] Pouton CW, Akhtar S. Bio-synthetic polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery[J]. Adv drug deliv rev, 1996,18:133-62.
[3] 陈建海，宣为民，姜彩玉. 钛酸丁酯催化ε-已内酯聚合研究[J]. 高分子学报, 1993, 3:356-60.
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[4] Embleton JK, Tighe BJ. Polymer for biodegradable medical devices[J]. J Microencapsul,1993, 10(3):341-52.
[5] 朴东旭，陈晓东，毛立江. 神经细胞生长行为仿生学思考 材料的形貌学作用[J]. 生物医学工程学杂志, 1999, 16(增刊):127-9.
[6] 张胜民，李世普，闫玉华，等. 骨组织工程用聚D,L-乳酸多孔三维结构的制备与表征[J]. 生物医学工程学杂志, 1999，16(增刊):105-6.
收稿日期：2000-01-06, 百拇医药