人红细胞摄取1,2-环己二胺.柠檬酸合铂(Ⅱ)配合物的手性选择性和摄入机制*
作者：高愈希△ 李荣昌
单位：北京医科大学生物无机及无机药物化学系，北京 100083
关键词：红细胞；代谢；1，2-环己二胺·柠檬酸合铂(Ⅱ)☆；铂；药代动力学；药物载体
990325 摘 要 目的：研究酵母RAD24L基因功能，克隆人类同源物。方法：分离RAD24基因区域rad24L突变株，以人的cDNA表达文库转化突变株，筛选回复表型；大剂量X线照射观察细胞周期。结果：rad24L对紫外线敏感，从转化文库后的回复表型中克隆出人类hR24L全长cDNA 。结论：克隆的人类DNA修复基因hR24L，它能校正rad24L的突变表型，参与细胞周期检定点调控。
中国图书资料分类法分类号 Q343.12
hR24L, a functional human homologue of S.cerevisiae RAD24L
, http://www.100md.com
gene,is involved in cell cycle checkpoint control
ZHU Ying-Bao， HAN Yun
(The Laboratory of Molecular Biology, the Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Saccharomyces, cerevisiae/genet Gene library DNA mutational analysis Cell cycle
Genetic complementation test
ABSTRACT Objective：To study the function of RAD24L of S.cerevisiae and clone human functional homologue. Methods：The UV-sensitive mutant rad24L was isolated by plasmid shuffling. Then, transformation of rad24L was performed with human cDNA expression library to screen for reversion phenotype. The cell cycle was studied by X-ray irradiation. Results：The mutant rad24L was obtained and a full length cDNA was cloned from reversion phenotype by transformation with human expression library. Conclusion：Human functional homologue of RAD24L was cloned. The hR24L which corrected the phenotype of rad24L mutant is involved in cell cycle checkpoint control.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:269-273)
人类基因组计划(HGP)的实施极大地推动了模式生物基因组的研究。啤酒酵母(S.cerevisiae)作为人类基因组计划的重要模式生物，其全基因组序列测定已于1996年完成，由于它是单细胞真核生物，基因组简单，突变株相对易于分离，因而被广泛用作研究DNA损伤修复与细胞周期的理想材料。对紫外线和电离辐射敏感的酵母细胞突变株称为rad突变株(RAD表示野生型)。根据单突变和双突变的敏感特征所得出的上位关系(epistatic relations)可将其分为3个上位显性组[1，2]，(1)RAD3组：该组成员参与核苷酸的切除修复，其突变株对紫外线敏感。(2)RAD6组：该组成员参与复制后修复，其突变株对化学诱变剂敏感。(3)RAD52组：该组成员参与重组修复(包括链断裂修复)，其突变株对电离辐射(包括X线、γ射线等)敏感。RAD24基因是切除修复上位显性组的成员，兼有其他上位显性组的某些特性。我们继克隆出该基因区域DNA片段后，对照酵母基因组测序结果发现该基因区域存在两个开放阅读框架。为此，我们分离左侧的阅读框基因(RAD24L)突变株，观察其表型，继而用功能互补法克隆人类同源物并推及其功能。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酵母细胞HY684，本室保存，其营养表型为MATa、his3-△200、trp1-△、ura3-52、leu2人胎肝cDNA文库购自CLONTECH公司。
质粒pDel24L为His3基因的BamHⅠ片段插入到含RAD24L开放阅读框架基因内部的BamHⅠ位点，用于RAD24L基因敲除，本室构建。
5-FOA购自Sigma公司。酵母含氮碱(无氨基酸、无硫酸铵)为Difco公司产品。各种工具酶购自Biolab公司和华美生物工程公司。Plasmid premier基因分析软件购自CLONTECH公司。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 基因组信息学及计算机分析 在Internet下进入SGD网址，下载啤酒酵母第Ⅴ号染色体RAD24基因区域约10 kb的DNA序列用Plasmid premier程序进行分析。
1.2.2 RAD24L PCR扩增 根据Plasmid premier分析的结果，将RAD24L开放阅读框基因用PCR方法克隆至pRB363(带Ura3标志基因)[3]的SalⅠ位点。用于PCR扩增的上游引物为：5′-AGGAGTCGAC-
ATATGGATAGTACGAATTTGAACAAA-3′；下游引物为：5′-GGAGGTCGACTTAGAGTATTTCCAT-TTCCAGATCT-
GAAT-3′。
1.2.3 RAD24L突变株的分离 先将含RAD24L基因的质粒备份(带Ura3标志基因)转化HY684，在-Ura的合成培养基上筛选阳性克隆，将pDel24L质粒用XbaⅠ线性化后转化上述阳性克隆，用一步基因中断法使基因组中的RAD24L中断，在-Ura、-His的培养基上筛选阳性克隆，再将用HA处理的RAD24L突变库(含Trp1标志基因)转化上一步的阳性克隆，在-Ura、-His、-Trp的培养基上筛选阳性克隆，并把阳性克隆放在含5-FOA的-His、-Trp、+Ura的培养基上筛选阳性克隆[3，4]，最后用平皿复制法(影印法)分离紫外线敏感突变株。
, 百拇医药
1.2.4 功能互补试验 将人cDNA表达文库转化突变株，筛选回复生长表型的克隆。酵母转化方法按文献[3]的方法进行。
1.2.5 质粒回收测序 酵母阳性克隆质粒的回收按文献[5]方法进行。序列测定在ABI377测序仪上完成。
1.2.6 细胞周期分析 分别接种10ml的rad24L、RAD24L及经hR24L转化的酵母30 ℃培养过夜，次日转移至100ml培养液中继续培养5h，然后加入α因子使细胞周期同步化。X线照射后于不同时间点收集等份试样进行流式细胞学检查，计数经过分裂期的细胞。
2 结果
2.1 RAD24L基因Plasmid premier分析
Plasmid premier分析结果见图1，由图可见RAD24L框架长为1.98 kb，编码659个氨基酸的蛋白质。在编码区内部有一个BamHⅠ位点，这为我们用His3基因的BamHⅠ片段中断该基因提供了便利。
, 百拇医药
图1 RAD24L基因Plasmid premier分析
Figure 1 Analysis of RAD24L gene by Plasmid premier
2.2 RAD24L突变株分离
为分离RAD24L突变株rad24L，首先必须将基因中的RAD24L基因敲除(中断)，一步基因中断法的示意图见图2。
图2 RAD24L一步基因中断法
Figure 2 One step gene disruption of RAD24L
, http://www.100md.com
用Plasmid shuffling分离到一个紫外线敏感表型rad24L。
2.3 文库转化
将人cDNA表达文库转化rad24L后，获得3个紫外抗性克隆，从阳性克隆回收质粒，酶切鉴定证实为同一质粒。完成测序后进行数据库检查证实为新基因，登录到Genbank，登记号为AF126424。
2.4 细胞周期分析
X线照射引起的细胞周期变化结果见图3，由图3可以看出rad24L突变株丧失了G2阻滞表型，其G2阻滞表型的抑制可被hR24L校正，校正后的表型与野生型相似。
图3 X线照射诱导的细胞周期阻滞互补分析
, http://www.100md.com
Figure 3 Complementation test of cell cycle
arrest induced by X-ray irradiation
2.5 Plasmid premier分析
将克隆的人类 RAD24L 同源基因 cDNA 用 Plasmid premier 分析，揭示其编码的蛋白质为670个氨基酸，含有一般认定的解旋酶结构域GKT，见图4。
, 百拇医药
图4 hR24L基因cDNA序列及其预测的氨基酸序列
Figure 4 DNA sequence of hR24L cDNA and predicted amino sequence
3 讨论
DNA损伤修复涉及医学诸多领域，是生命科学的重大课题。在基因水平研究DNA修复不仅对揭示遗传与进化等生物学基本问题具有重大的理论意义，而且对某些遗传病及肿瘤的发病与基因治疗均具有广阔的应用前景。人们对DNA损伤修复认识的不断加深，得益于对酵母细胞辐射敏感突变株的研究。由于啤酒酵母是研究高等生物和人类基因的理想材料，因而被正式列为人类基因组计划重要的模式生物。我们曾用Gap repair方法克隆出啤酒酵母RAD24基因区域的DNA片段后，根据该片段在基因组中的位置将其和第Ⅴ号染色体的DNA序列进行对比分析，发现在我们以前曾报道的编码区左侧尚存在一个开放阅读框，将其命名为RAD24L(L表示左侧)，而在我们报道的编码区内部出现了一个移码突变。为此我们对该区域进行了再测序，结果证实我们以前曾报道的序列少了一个碱基。为探讨RAD24L的功能及克隆人类同源基因，我们用一步基因中断法并结合Plasmid shuffling[3]技术分离了该基因紫外线敏感突变株rad24L，该突变株的生长呈现出G2阻滞抑制表型，与我们分离到的温度敏感突变株rad24LR具有某些相似的遗传表型(将另文发表)。进而，我们以人的cDNA表达文库转化突变株，用功能互补法(又称质粒拯救技术)克隆了人类同源基因hR24L，其cDNA全长3 075 bp，开放阅读框在538～2 550之间，编码的氨基酸含有一般认定的解旋酶结构域GKT，提示该基因产物尚参与DNA或/和RNA的解旋过程。hR24L基因能校正rad24L的G2阻滞抑制表型，说明它参与细胞周期检定点调控。该基因的表达及功能的进一步鉴定工作目前正在进行中。
, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金(39670235，39770409)及国家高技术发展计划青年基金资助课题。
参考文献
1 Heoijmakers J, Bootsma D. Molecular genetics of eukaryotic DNA excision repair. Cancer Cells,1990,2:311-320
2 Broomfield S, Chow BL, Xiao W. MMS2, encoding an ubiquitin-conjugating-enzyme-like protein, is a member of the yeast error-free postreplication repair pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:5678-5683
, 百拇医药
3 朱应葆，韩 云，傅 欣，等.啤酒酵母DNA 修复基因RAD24 温度敏感突变株的分离及其特性的初步研究.中国生物化学与分子生物学报，1998，14：222-227
4 Robert S, Boeke J. In vitro mutagenesis and plasmid shuffling: from cloned gene to mutant yeast. Methods Enzymol, 1991，194：281-301
5 Frederick MA. Rapid isolation of plasmid DNA from yeast. In: Short protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc, 1995.13.45
(1999-02-25收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学生物无机及无机药物化学系，北京 100083
关键词：红细胞；代谢；1，2-环己二胺·柠檬酸合铂(Ⅱ)☆；铂；药代动力学；药物载体
990325 摘 要 目的：研究酵母RAD24L基因功能，克隆人类同源物。方法：分离RAD24基因区域rad24L突变株，以人的cDNA表达文库转化突变株，筛选回复表型；大剂量X线照射观察细胞周期。结果：rad24L对紫外线敏感，从转化文库后的回复表型中克隆出人类hR24L全长cDNA 。结论：克隆的人类DNA修复基因hR24L，它能校正rad24L的突变表型，参与细胞周期检定点调控。
中国图书资料分类法分类号 Q343.12
hR24L, a functional human homologue of S.cerevisiae RAD24L
, http://www.100md.com
gene,is involved in cell cycle checkpoint control
ZHU Ying-Bao， HAN Yun
(The Laboratory of Molecular Biology, the Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Saccharomyces, cerevisiae/genet Gene library DNA mutational analysis Cell cycle
Genetic complementation test
ABSTRACT Objective：To study the function of RAD24L of S.cerevisiae and clone human functional homologue. Methods：The UV-sensitive mutant rad24L was isolated by plasmid shuffling. Then, transformation of rad24L was performed with human cDNA expression library to screen for reversion phenotype. The cell cycle was studied by X-ray irradiation. Results：The mutant rad24L was obtained and a full length cDNA was cloned from reversion phenotype by transformation with human expression library. Conclusion：Human functional homologue of RAD24L was cloned. The hR24L which corrected the phenotype of rad24L mutant is involved in cell cycle checkpoint control.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:269-273)
人类基因组计划(HGP)的实施极大地推动了模式生物基因组的研究。啤酒酵母(S.cerevisiae)作为人类基因组计划的重要模式生物，其全基因组序列测定已于1996年完成，由于它是单细胞真核生物，基因组简单，突变株相对易于分离，因而被广泛用作研究DNA损伤修复与细胞周期的理想材料。对紫外线和电离辐射敏感的酵母细胞突变株称为rad突变株(RAD表示野生型)。根据单突变和双突变的敏感特征所得出的上位关系(epistatic relations)可将其分为3个上位显性组[1，2]，(1)RAD3组：该组成员参与核苷酸的切除修复，其突变株对紫外线敏感。(2)RAD6组：该组成员参与复制后修复，其突变株对化学诱变剂敏感。(3)RAD52组：该组成员参与重组修复(包括链断裂修复)，其突变株对电离辐射(包括X线、γ射线等)敏感。RAD24基因是切除修复上位显性组的成员，兼有其他上位显性组的某些特性。我们继克隆出该基因区域DNA片段后，对照酵母基因组测序结果发现该基因区域存在两个开放阅读框架。为此，我们分离左侧的阅读框基因(RAD24L)突变株，观察其表型，继而用功能互补法克隆人类同源物并推及其功能。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酵母细胞HY684，本室保存，其营养表型为MATa、his3-△200、trp1-△、ura3-52、leu2人胎肝cDNA文库购自CLONTECH公司。
质粒pDel24L为His3基因的BamHⅠ片段插入到含RAD24L开放阅读框架基因内部的BamHⅠ位点，用于RAD24L基因敲除，本室构建。
5-FOA购自Sigma公司。酵母含氮碱(无氨基酸、无硫酸铵)为Difco公司产品。各种工具酶购自Biolab公司和华美生物工程公司。Plasmid premier基因分析软件购自CLONTECH公司。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 基因组信息学及计算机分析 在Internet下进入SGD网址，下载啤酒酵母第Ⅴ号染色体RAD24基因区域约10 kb的DNA序列用Plasmid premier程序进行分析。
1.2.2 RAD24L PCR扩增 根据Plasmid premier分析的结果，将RAD24L开放阅读框基因用PCR方法克隆至pRB363(带Ura3标志基因)[3]的SalⅠ位点。用于PCR扩增的上游引物为：5′-AGGAGTCGAC-
ATATGGATAGTACGAATTTGAACAAA-3′；下游引物为：5′-GGAGGTCGACTTAGAGTATTTCCAT-TTCCAGATCT-
GAAT-3′。
1.2.3 RAD24L突变株的分离 先将含RAD24L基因的质粒备份(带Ura3标志基因)转化HY684，在-Ura的合成培养基上筛选阳性克隆，将pDel24L质粒用XbaⅠ线性化后转化上述阳性克隆，用一步基因中断法使基因组中的RAD24L中断，在-Ura、-His的培养基上筛选阳性克隆，再将用HA处理的RAD24L突变库(含Trp1标志基因)转化上一步的阳性克隆，在-Ura、-His、-Trp的培养基上筛选阳性克隆，并把阳性克隆放在含5-FOA的-His、-Trp、+Ura的培养基上筛选阳性克隆[3，4]，最后用平皿复制法(影印法)分离紫外线敏感突变株。
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1.2.4 功能互补试验 将人cDNA表达文库转化突变株，筛选回复生长表型的克隆。酵母转化方法按文献[3]的方法进行。
1.2.5 质粒回收测序 酵母阳性克隆质粒的回收按文献[5]方法进行。序列测定在ABI377测序仪上完成。
1.2.6 细胞周期分析 分别接种10ml的rad24L、RAD24L及经hR24L转化的酵母30 ℃培养过夜，次日转移至100ml培养液中继续培养5h，然后加入α因子使细胞周期同步化。X线照射后于不同时间点收集等份试样进行流式细胞学检查，计数经过分裂期的细胞。
2 结果
2.1 RAD24L基因Plasmid premier分析
Plasmid premier分析结果见图1，由图可见RAD24L框架长为1.98 kb，编码659个氨基酸的蛋白质。在编码区内部有一个BamHⅠ位点，这为我们用His3基因的BamHⅠ片段中断该基因提供了便利。
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图1 RAD24L基因Plasmid premier分析
Figure 1 Analysis of RAD24L gene by Plasmid premier
2.2 RAD24L突变株分离
为分离RAD24L突变株rad24L，首先必须将基因中的RAD24L基因敲除(中断)，一步基因中断法的示意图见图2。
图2 RAD24L一步基因中断法
Figure 2 One step gene disruption of RAD24L
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用Plasmid shuffling分离到一个紫外线敏感表型rad24L。
2.3 文库转化
将人cDNA表达文库转化rad24L后，获得3个紫外抗性克隆，从阳性克隆回收质粒，酶切鉴定证实为同一质粒。完成测序后进行数据库检查证实为新基因，登录到Genbank，登记号为AF126424。
2.4 细胞周期分析
X线照射引起的细胞周期变化结果见图3，由图3可以看出rad24L突变株丧失了G2阻滞表型，其G2阻滞表型的抑制可被hR24L校正，校正后的表型与野生型相似。
图3 X线照射诱导的细胞周期阻滞互补分析
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Figure 3 Complementation test of cell cycle
arrest induced by X-ray irradiation
2.5 Plasmid premier分析
将克隆的人类 RAD24L 同源基因 cDNA 用 Plasmid premier 分析，揭示其编码的蛋白质为670个氨基酸，含有一般认定的解旋酶结构域GKT，见图4。
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图4 hR24L基因cDNA序列及其预测的氨基酸序列
Figure 4 DNA sequence of hR24L cDNA and predicted amino sequence
3 讨论
DNA损伤修复涉及医学诸多领域，是生命科学的重大课题。在基因水平研究DNA修复不仅对揭示遗传与进化等生物学基本问题具有重大的理论意义，而且对某些遗传病及肿瘤的发病与基因治疗均具有广阔的应用前景。人们对DNA损伤修复认识的不断加深，得益于对酵母细胞辐射敏感突变株的研究。由于啤酒酵母是研究高等生物和人类基因的理想材料，因而被正式列为人类基因组计划重要的模式生物。我们曾用Gap repair方法克隆出啤酒酵母RAD24基因区域的DNA片段后，根据该片段在基因组中的位置将其和第Ⅴ号染色体的DNA序列进行对比分析，发现在我们以前曾报道的编码区左侧尚存在一个开放阅读框，将其命名为RAD24L(L表示左侧)，而在我们报道的编码区内部出现了一个移码突变。为此我们对该区域进行了再测序，结果证实我们以前曾报道的序列少了一个碱基。为探讨RAD24L的功能及克隆人类同源基因，我们用一步基因中断法并结合Plasmid shuffling[3]技术分离了该基因紫外线敏感突变株rad24L，该突变株的生长呈现出G2阻滞抑制表型，与我们分离到的温度敏感突变株rad24LR具有某些相似的遗传表型(将另文发表)。进而，我们以人的cDNA表达文库转化突变株，用功能互补法(又称质粒拯救技术)克隆了人类同源基因hR24L，其cDNA全长3 075 bp，开放阅读框在538～2 550之间，编码的氨基酸含有一般认定的解旋酶结构域GKT，提示该基因产物尚参与DNA或/和RNA的解旋过程。hR24L基因能校正rad24L的G2阻滞抑制表型，说明它参与细胞周期检定点调控。该基因的表达及功能的进一步鉴定工作目前正在进行中。
, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金(39670235，39770409)及国家高技术发展计划青年基金资助课题。
参考文献
1 Heoijmakers J, Bootsma D. Molecular genetics of eukaryotic DNA excision repair. Cancer Cells,1990,2:311-320
2 Broomfield S, Chow BL, Xiao W. MMS2, encoding an ubiquitin-conjugating-enzyme-like protein, is a member of the yeast error-free postreplication repair pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:5678-5683
, 百拇医药
3 朱应葆，韩 云，傅 欣，等.啤酒酵母DNA 修复基因RAD24 温度敏感突变株的分离及其特性的初步研究.中国生物化学与分子生物学报，1998，14：222-227
4 Robert S, Boeke J. In vitro mutagenesis and plasmid shuffling: from cloned gene to mutant yeast. Methods Enzymol, 1991，194：281-301
5 Frederick MA. Rapid isolation of plasmid DNA from yeast. In: Short protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc, 1995.13.45
(1999-02-25收稿), 百拇医药