CD80分子共刺激T细胞联合苯乙酸钠抗肿瘤的实验研究
作者：潘德顺 陈伟强 王迪浔
单位：潘德顺 陈伟强(广东药学院病理生理学教研室，广东 广州 510224)；王迪浔(同济医科大学病理生理学教研室， 湖北 武汉 430030)
关键词：肝细胞瘤； T淋巴细胞； 肿瘤坏死因子
中国病理生理杂志000623
[摘 要] 目的:研究分化诱导剂苯乙酸钠处理肝癌细胞后,其对CD80(B7-1)分子活化的T细胞杀伤敏感性的变化。方法:将CD80共刺激的人T淋巴细胞与苯乙酸钠处理的肝癌细胞共同培养，用噻唑蓝法(MTT)检测T细胞粘附肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞活性，取上清测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)。结果： 苯乙酸钠处理肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721后, T细胞对其杀伤敏感性明显增加(P<0.01)，明显增加T细胞与肿瘤细胞之间的粘附性(P<0.05)和T细胞产生TNF-α的能力(P<0.05)。结论:苯乙酸钠处理肝癌细胞能增加T细胞对其杀伤活性。
, 百拇医药
[中图分类号] R735 [文献标识] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0563-02
[MeSH] Hepatoma; T-lymphocytes; Tumor mecrosis factor
T淋巴细胞的有效活化在肿瘤免疫治疗中占有十分重要的位置,除了需接受来源于抗原提呈细胞表面与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子结合的特异抗原信号外,还必需接受非特异的共刺激信号。B7-1(CD80)是目前已知的、最重要的共刺激分子,在诱导机体的抗肿瘤免疫应答中具有重要的作用。如果缺乏共刺激信号的作用,T细胞受体(T cell receptor, TCR )识别MHC-抗原多肽复合物将导致T细胞特异无反应性[1] 。但是无论是全身还是局部给与这些免疫效应细胞, 治疗肿瘤的效果并没有人们期望的那么好[2] ;苯乙酸钠(NaPA)是人体血浆中天然组分之一,对正常细胞无毒,而又能选择性地作用于肿瘤细胞,是一种较为理想的肿瘤细胞诱导分化剂[3] 。B7-1分子共刺激T细胞联合苯乙酸钠用于治疗肝癌是否有可能增强它们的治疗肿瘤的效果?为此,本文研究了苯乙酸钠处理肝癌细胞后,T细胞对其粘附活性及杀伤敏感性的影响。
, http://www.100md.com
材 料 和 方 法
一、 试剂
主要试剂有: (1) 苯乙酸钠(NaPA,Sigma); (2) RPMI 1640培养基(Gibco); (3) CD80 (B细胞亚群干粉, 法国Immunotech公司);(4)TNF-α检测试剂盒(北京军事医学科学院)。
二、细胞系
人肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721,本室保存,按常规培养。
三、肝癌细胞的苯乙酸钠处理
将肿瘤细胞加入75 mL培养瓶,5×106/瓶。24 h后换液,加入苯乙酸钠10 mmol/L,同时设立不加药对照组。连续作用5 d,中间换液1次。
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四、CD80对T细胞的处理
常规制备正常人外周血T细胞,用RPMI 1640培养液,调细胞数1×106/mL,加 IL-2 200 U/mL,CD80 2 μg/5×106,37℃ 5% CO2培养3 d。
五、T细胞与肿瘤细胞之间粘附活性的分析
将肿瘤细胞加入96孔板,5×104/孔, 2 h后,加入T细胞,104/孔,37℃ 温育1 h,轻轻洗去未粘附的T细胞,以MTT法检测T细胞粘附肿瘤细胞的活性。
六、肿瘤细胞对T细胞杀伤敏感性的分析
将肿瘤细胞加入96孔板,104/孔,同时加T细胞,5×105/孔,使效靶细胞比为50∶1,37℃温育24 h,以MTT法检测T细胞杀伤肿瘤细胞的活性。
, http://www.100md.com
七、TNF-α的检测
用双抗夹心法,严格按试剂盒说明书操作,检测收集的T细胞和肿瘤细胞共同温育24 h上清液中的TNF-α。
结 果
一、苯乙酸钠对活化的T细胞粘附肿瘤细胞活性的影响
表1 苯乙酸钠处理的肝癌细胞与活化的T细胞
(CD80共刺激)之间粘附活性的变化
Tab 1 Effects of NaPA on the binding rates of CD80 activated
T cells to tumor cells(
±s) Group
, http://www.100md.com
n
Binding rates of T cells(%)
BEL-7402
SMMC-7721
Control
10
42.35±5.37
38.62±3.83
NaPA
11
57.64±6.11*
42.75±4.23*
, http://www.100md.com
* P<0.05, vs control
如表1所示:肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721都能在不同程度上与T细胞之间发生粘附;但是两者与T细胞的粘附率不同。经过10 mmol/L苯乙酸钠处理肿瘤细胞5 d后,T细胞与它们的粘附率增加。
二、苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞杀伤敏感性的变化
如表2所示:肝癌细胞 BEL-7402和SMMC-7721对T细胞杀伤敏感性不同。而苯乙酸钠处理肿瘤细胞后,它们对T细胞的杀伤敏感性增加。
表2 苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞(CD80共刺激)
杀伤敏感性的变化
Tab 2 The influences of tumor cells treated by NaPA on the
, 百拇医药
killing effect of T cells co-stimulated by CD80 (±s) Group
n
Killing effect(%)
BEL-7402
SMMC-7721
Control
10
21.37±3.21
33.28±4.56
NaPA
, 百拇医药
9
47.43±6.18**
52.86±5.37**
**P<0.01, vs control
三、 苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞产生TNF-α的影响
结果见表3。CD80分子处理的T细胞(和肿瘤细胞共同温育)能分泌TNF-α;苯乙酸钠处理的肿瘤细胞后,T细胞分泌TNF-α增多。
表3 苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞(CD80共刺激)
产生TNF-α的影响
Tab 3 The effects of tumor cells treated by NaPA on TNF-α
, 百拇医药
production from T cells co-stimulated by CD80(±s) Group
n
Concentration of TNF-α (U/mL)
BEL-7402
SMMC-7721
Control
8
72.18±11.93
68.63±9.38
, 百拇医药 NaPA
9
97.65±12.13*
88.13±8.98*
*P<0.05， vs control 讨 论
为了探索将无毒性的分化诱导剂苯乙酸钠与激活的T细胞等相结合能否增强后者的肿瘤治疗效果,检测了苯乙酸钠处理的肝癌细胞对CD80分子共刺激的T细胞的粘附性及其杀伤敏感性变化。结果显示:苯乙酸钠处理的肝癌细胞能增强T细胞的粘附性及其杀伤敏感。因此,在CD80活化的T细胞治疗肝癌病人的过程中, 同时使用分化诱导剂,有可能增强其治疗的效果。
Boon等报道[4]，机体特异性抗肿瘤CTL的诱导必需有协同刺激分子CD80以及其它的细胞因子参与;Hellstrom等的研究结果显示[2] ,大多数肿瘤细胞CD80的表达没有或很低 ,由于肿瘤细胞本身缺乏足够的协同刺激信号,所以不能在体内建立有效的特异性抗肿瘤免疫; B7分子主要来源于激活的B细胞,可分为三类:B7-1、B7-2 、B7-3,B7-1分子是CD80,CD80分子的天然受体是T细胞上的CD28分子,CD80和T细胞膜上CD28结合,不仅促进抗原呈递细胞与T细胞的直接接触,而且可以产生共刺激信号,活化T细胞,因此CD80-CD28复合物在肿瘤特异性细胞免疫中发挥重要的作用[2] 。具有杀伤作用的效应细胞摧毁靶细胞的过程包括:(1)通过杀伤细胞表面的粘附分子与靶细胞表面的配体形成的联结,使杀伤细胞与靶细胞相结合。(2)激活信号通过粘附分子传递到杀伤细胞。(3)释放溶细胞性的分子,如:TNF 、穿孔素等,导致细胞膜破裂或细胞的DNA片断化 。本实验结果表明:苯乙酸钠处理的肝癌细胞能增强CD80 激活的T细胞对肿瘤细胞的杀伤敏感性和粘附性,其主要机理一方面可能是苯乙酸钠能诱导肿瘤细胞分化,增加肿瘤细胞表面HLAⅠ、Ⅱ和ICAM-1[5] 等分子的表达 ,这些表面分子与T细胞表面的相应的配体发生结合, 亦能增加 T细胞与肿瘤细胞的结合,苯乙酸钠增加活化的T细胞与肝癌细胞的粘附性,有利于效应细胞发生杀伤作用 ;另一方面苯乙酸钠处理的肿瘤细胞能诱导活化的T细胞产生TNF-α增加, 直接增加其杀伤敏感性,因TNF-α对肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。因此,将苯乙酸钠与活化的T细胞结合起来用于治疗肝癌, 可能能够增加其治疗效果。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Gimmi CD,Freeman GJ, Gribben JG， et al.Human T cell clonal anergy if induced by antigen presentation in the absence of B7 co-stimulation[J]. PNAS USA,1993,90:6586～6589.
[2] Hellstrom KK,Hellstrom I,Chen L. Can co-stimulated tumor immunity be therapeutically efficacious[J].Immunol Rev, 1995, 145:123～127.
[3] Liu L,Shack S, Stetler-Stevenson WR,et al. Differentiation of cultured human melanoma cells induced by aromatic fatty acids phenylacetate and phenylbutyrate[J]. J Invest Dermato, 1994,103:335～338.
, 百拇医药
[4] Boon T,Gajewski TE,Renauld JC,et al.Co-stimulation with B7-1 IL-6 and IL-2 is sufficient for primary generation of murine antitumor cytolytic T lymphocytes in vitro[J].J Immunol,1995, 154:5367～5369.
[5] 吉家祥,马宝骊,王利,等.苯乙酸钠增强肿瘤细胞表面分子HLA的表达[J].中国肿瘤生物治疗杂志,1996，3:268～ 271.
[收稿日期] 1999-12-22 [修回日期] 2000-03-22
, http://www.100md.com
单位：潘德顺 陈伟强(广东药学院病理生理学教研室，广东 广州 510224)；王迪浔(同济医科大学病理生理学教研室， 湖北 武汉 430030)
关键词：肝细胞瘤； T淋巴细胞； 肿瘤坏死因子
中国病理生理杂志000623
[摘 要] 目的:研究分化诱导剂苯乙酸钠处理肝癌细胞后,其对CD80(B7-1)分子活化的T细胞杀伤敏感性的变化。方法:将CD80共刺激的人T淋巴细胞与苯乙酸钠处理的肝癌细胞共同培养，用噻唑蓝法(MTT)检测T细胞粘附肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞活性，取上清测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)。结果： 苯乙酸钠处理肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721后, T细胞对其杀伤敏感性明显增加(P<0.01)，明显增加T细胞与肿瘤细胞之间的粘附性(P<0.05)和T细胞产生TNF-α的能力(P<0.05)。结论:苯乙酸钠处理肝癌细胞能增加T细胞对其杀伤活性。
, 百拇医药
[中图分类号] R735 [文献标识] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0563-02
[MeSH] Hepatoma; T-lymphocytes; Tumor mecrosis factor
T淋巴细胞的有效活化在肿瘤免疫治疗中占有十分重要的位置,除了需接受来源于抗原提呈细胞表面与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子结合的特异抗原信号外,还必需接受非特异的共刺激信号。B7-1(CD80)是目前已知的、最重要的共刺激分子,在诱导机体的抗肿瘤免疫应答中具有重要的作用。如果缺乏共刺激信号的作用,T细胞受体(T cell receptor, TCR )识别MHC-抗原多肽复合物将导致T细胞特异无反应性[1] 。但是无论是全身还是局部给与这些免疫效应细胞, 治疗肿瘤的效果并没有人们期望的那么好[2] ;苯乙酸钠(NaPA)是人体血浆中天然组分之一,对正常细胞无毒,而又能选择性地作用于肿瘤细胞,是一种较为理想的肿瘤细胞诱导分化剂[3] 。B7-1分子共刺激T细胞联合苯乙酸钠用于治疗肝癌是否有可能增强它们的治疗肿瘤的效果?为此,本文研究了苯乙酸钠处理肝癌细胞后,T细胞对其粘附活性及杀伤敏感性的影响。
, http://www.100md.com
材 料 和 方 法
一、 试剂
主要试剂有: (1) 苯乙酸钠(NaPA,Sigma); (2) RPMI 1640培养基(Gibco); (3) CD80 (B细胞亚群干粉, 法国Immunotech公司);(4)TNF-α检测试剂盒(北京军事医学科学院)。
二、细胞系
人肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721,本室保存,按常规培养。
三、肝癌细胞的苯乙酸钠处理
将肿瘤细胞加入75 mL培养瓶,5×106/瓶。24 h后换液,加入苯乙酸钠10 mmol/L,同时设立不加药对照组。连续作用5 d,中间换液1次。
, http://www.100md.com
四、CD80对T细胞的处理
常规制备正常人外周血T细胞,用RPMI 1640培养液,调细胞数1×106/mL,加 IL-2 200 U/mL,CD80 2 μg/5×106,37℃ 5% CO2培养3 d。
五、T细胞与肿瘤细胞之间粘附活性的分析
将肿瘤细胞加入96孔板,5×104/孔, 2 h后,加入T细胞,104/孔,37℃ 温育1 h,轻轻洗去未粘附的T细胞,以MTT法检测T细胞粘附肿瘤细胞的活性。
六、肿瘤细胞对T细胞杀伤敏感性的分析
将肿瘤细胞加入96孔板,104/孔,同时加T细胞,5×105/孔,使效靶细胞比为50∶1,37℃温育24 h,以MTT法检测T细胞杀伤肿瘤细胞的活性。
, http://www.100md.com
七、TNF-α的检测
用双抗夹心法,严格按试剂盒说明书操作,检测收集的T细胞和肿瘤细胞共同温育24 h上清液中的TNF-α。
结 果
一、苯乙酸钠对活化的T细胞粘附肿瘤细胞活性的影响
表1 苯乙酸钠处理的肝癌细胞与活化的T细胞
(CD80共刺激)之间粘附活性的变化
Tab 1 Effects of NaPA on the binding rates of CD80 activated
T cells to tumor cells(
±s) Group, http://www.100md.com
n
Binding rates of T cells(%)
BEL-7402
SMMC-7721
Control
10
42.35±5.37
38.62±3.83
NaPA
11
57.64±6.11*
42.75±4.23*
, http://www.100md.com
* P<0.05, vs control
如表1所示:肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721都能在不同程度上与T细胞之间发生粘附;但是两者与T细胞的粘附率不同。经过10 mmol/L苯乙酸钠处理肿瘤细胞5 d后,T细胞与它们的粘附率增加。
二、苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞杀伤敏感性的变化
如表2所示:肝癌细胞 BEL-7402和SMMC-7721对T细胞杀伤敏感性不同。而苯乙酸钠处理肿瘤细胞后,它们对T细胞的杀伤敏感性增加。
表2 苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞(CD80共刺激)
杀伤敏感性的变化
Tab 2 The influences of tumor cells treated by NaPA on the
, 百拇医药
killing effect of T cells co-stimulated by CD80 (
±s) Groupn
Killing effect(%)
BEL-7402
SMMC-7721
Control
10
21.37±3.21
33.28±4.56
NaPA
, 百拇医药
9
47.43±6.18**
52.86±5.37**
**P<0.01, vs control
三、 苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞产生TNF-α的影响
结果见表3。CD80分子处理的T细胞(和肿瘤细胞共同温育)能分泌TNF-α;苯乙酸钠处理的肿瘤细胞后,T细胞分泌TNF-α增多。
表3 苯乙酸钠处理的肿瘤细胞对T细胞(CD80共刺激)
产生TNF-α的影响
Tab 3 The effects of tumor cells treated by NaPA on TNF-α
, 百拇医药
production from T cells co-stimulated by CD80(
±s) Groupn
Concentration of TNF-α (U/mL)
BEL-7402
SMMC-7721
Control
8
72.18±11.93
68.63±9.38
, 百拇医药 NaPA
9
97.65±12.13*
88.13±8.98*
*P<0.05， vs control 讨 论
为了探索将无毒性的分化诱导剂苯乙酸钠与激活的T细胞等相结合能否增强后者的肿瘤治疗效果,检测了苯乙酸钠处理的肝癌细胞对CD80分子共刺激的T细胞的粘附性及其杀伤敏感性变化。结果显示:苯乙酸钠处理的肝癌细胞能增强T细胞的粘附性及其杀伤敏感。因此,在CD80活化的T细胞治疗肝癌病人的过程中, 同时使用分化诱导剂,有可能增强其治疗的效果。
Boon等报道[4]，机体特异性抗肿瘤CTL的诱导必需有协同刺激分子CD80以及其它的细胞因子参与;Hellstrom等的研究结果显示[2] ,大多数肿瘤细胞CD80的表达没有或很低 ,由于肿瘤细胞本身缺乏足够的协同刺激信号,所以不能在体内建立有效的特异性抗肿瘤免疫; B7分子主要来源于激活的B细胞,可分为三类:B7-1、B7-2 、B7-3,B7-1分子是CD80,CD80分子的天然受体是T细胞上的CD28分子,CD80和T细胞膜上CD28结合,不仅促进抗原呈递细胞与T细胞的直接接触,而且可以产生共刺激信号,活化T细胞,因此CD80-CD28复合物在肿瘤特异性细胞免疫中发挥重要的作用[2] 。具有杀伤作用的效应细胞摧毁靶细胞的过程包括:(1)通过杀伤细胞表面的粘附分子与靶细胞表面的配体形成的联结,使杀伤细胞与靶细胞相结合。(2)激活信号通过粘附分子传递到杀伤细胞。(3)释放溶细胞性的分子,如:TNF 、穿孔素等,导致细胞膜破裂或细胞的DNA片断化 。本实验结果表明:苯乙酸钠处理的肝癌细胞能增强CD80 激活的T细胞对肿瘤细胞的杀伤敏感性和粘附性,其主要机理一方面可能是苯乙酸钠能诱导肿瘤细胞分化,增加肿瘤细胞表面HLAⅠ、Ⅱ和ICAM-1[5] 等分子的表达 ,这些表面分子与T细胞表面的相应的配体发生结合, 亦能增加 T细胞与肿瘤细胞的结合,苯乙酸钠增加活化的T细胞与肝癌细胞的粘附性,有利于效应细胞发生杀伤作用 ;另一方面苯乙酸钠处理的肿瘤细胞能诱导活化的T细胞产生TNF-α增加, 直接增加其杀伤敏感性,因TNF-α对肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。因此,将苯乙酸钠与活化的T细胞结合起来用于治疗肝癌, 可能能够增加其治疗效果。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Gimmi CD,Freeman GJ, Gribben JG， et al.Human T cell clonal anergy if induced by antigen presentation in the absence of B7 co-stimulation[J]. PNAS USA,1993,90:6586～6589.
[2] Hellstrom KK,Hellstrom I,Chen L. Can co-stimulated tumor immunity be therapeutically efficacious[J].Immunol Rev, 1995, 145:123～127.
[3] Liu L,Shack S, Stetler-Stevenson WR,et al. Differentiation of cultured human melanoma cells induced by aromatic fatty acids phenylacetate and phenylbutyrate[J]. J Invest Dermato, 1994,103:335～338.
, 百拇医药
[4] Boon T,Gajewski TE,Renauld JC,et al.Co-stimulation with B7-1 IL-6 and IL-2 is sufficient for primary generation of murine antitumor cytolytic T lymphocytes in vitro[J].J Immunol,1995, 154:5367～5369.
[5] 吉家祥,马宝骊,王利,等.苯乙酸钠增强肿瘤细胞表面分子HLA的表达[J].中国肿瘤生物治疗杂志,1996，3:268～ 271.
[收稿日期] 1999-12-22 [修回日期] 2000-03-22
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