活化淋巴细胞及其染色质诱导IgG1亚类抗双链DNA抗体生成①
作者：吴厚生 奚华国 卢 琳 王美英
单位：上海医科大学免疫学教研室，上海200032
关键词：活化淋巴细胞；染色质；双链DNA抗体；IgG1亚类
中国免疫学杂志990702 中国图书分类号 R392.3
摘 要 目的：抗双链DNA(dsDNA)抗体的诱生机理不明，试图研究诱导该自身抗体产生的相应自身抗原。方法：取体外活化的Balb/c小鼠脾细胞及其染色质免疫同系小鼠，用ELISA方法检测IgG类抗双链DNA抗体及其IgG亚类。结果：不同原因活化的脾细胞及其染色质均可诱导IgG类抗双链DNA抗体产生，且抗体均为IgG1亚类。结论：活化淋巴细胞及其活性染色质是诱导双链DNA抗体生成的自身免疫原。
Induction of anti-dsDNA IgG1 antibody by immunization with activated lymphocytes and their active chromatin
, http://www.100md.com
WU Hou-Sheng,XI Hua-Guo,LU Lin et al.
Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032
Abstract Objective:The relevant primary autoantigen which induced anti-dsDNA antibodies was still enigmatic.Attempted to investigate the primary autoantigens driving the productiorn of these autoantibodies.Methods:Immunized Balb/c mice with activated syngenic spleen cells primed by ConA or LPS or rIL-2 in vitro and the chromatin isolated from activated spleen cells.Anti-dsDNA IgG antibodies and its subclass were determined by ELISA.Results:The activated lymphocytes and its chromatin all induced anti-dsDNA antibodies and these autoantibodies belong to IgG1 subclass.Conclusion:The results indicated that activated lymphocytes and their active chromatin can be the autoimmunogenes driving the production of anti-dsDNA antibodies.
, 百拇医药
Key words Activated lymphocytes Chromatin Anti-dsDNA antibody IgG1 subclass
哺乳类抗dsDNA抗体是系统性红斑狼疮(SLE)特征性标志和血清学诊断指标之一，与SLE的肾小球肾炎发病密切相关，亦是SLE重要致病性抗体[1]。尽管抗dsDNA抗体的IgG类型转换、VH体突变及抗DNA抗体B细胞克隆的特异增殖都提示这种自身抗体是经抗原特异性激活产生的[2，3]，但是用相应的抗原(天然DNA)免疫不能诱导该抗体产生[4]，至今人们尚不知该自身抗原是何种物质。
我们在用T细胞疫苗(TCV)预防和治疗SLE的过程中发现，空肠弯曲菌活化的小鼠淋巴细胞作为自身抗原免疫同系小鼠能诱导抗dsDNA抗体的生成[5]，ConA以及细菌脂多糖(LPS)活化的脾细胞也能诱导抗dsDNA抗体的生成[6]。本文用不同来源的活化淋巴细胞及其染色质作为抗原，进一步探讨抗dsDNA抗体的生成机理。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 6～8岁周龄Balb/c(H-2d)雌性小鼠购自中英合资西普尔-毕凯实验动物有限公司；ConA、LPS，HRP-羊抗鼠IgG亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)抗体均购自Sigma公司；IL-2购自上海第二军医大学；小牛胸腺DNA、HRP-羊抗鼠IgG抗体、FITC-羊抗鼠IgG抗体均购自上海华美生物制品公司。
1.2 方法
1.2.1 活化淋巴细胞的制备及免疫 无菌操作取脾脏和肠系膜淋巴结，用Tris-NH4Cl破坏红细胞，用完全1640培养液调整细胞浓度为2×106ml-1，分别加ConA(终浓度10 μg/ml)及LPS(终浓度10 μg/ml)或IL-2(终浓度1 000 U/ml)，于37℃ 5%CO2培养72 h，分别经或不经0.3%戊二醛处理，按2×107 cells/只皮下注射，1次/w，共3次。
, 百拇医药
1.2.2 活性细胞核及其染色质的提取和免疫 按何开玲教授改良Chiu法[7]，从ConA活化的和未活化的脾细胞中提取活性和非活性细胞核及染色质，分别按细胞核2×107个/只、染色质50 μg/只皮下注射，1次/w，共3次。3次免疫后眼眶后静脉丛采血，并分离血清。
1.2.3 IgG类抗双链DNA抗体检测[8] 用ELISA方法检测IgG类抗dsDNA抗体生成，酶标板用0.5%硫酸鱼精蛋白预处理。S1核酸酶处理小牛胸腺DNA按50 μg/ml作为包被抗原。检测血清除特别注明外均取免疫后第21天血清，血清样品按1∶50稀释。
2 结果
2.1 活化的淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成 如表1所示，正常鼠和未活化淋巴细胞免疫的小鼠没有一例出现IgG类抗dsDNA抗体；而经ConA激活的T淋巴细胞、经LPS激活的B淋巴细胞及IL-2 活化的LAK细胞免疫的小鼠均检测到高滴度IgG类抗dsDNA抗体生成。按OD≥OD正常+3s为阳性，则阳性率为100%(52/52)。
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表1 活化的淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成
Tab.1 Induction of anti-dsDNA IgG antibody by immunization with activated lymphocytes Immunized mice
n
Anti-dsDNA anti-
bodies(OD,x±s)
Anti-dsDNA antibodies
positive rate
Control
15
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0.057±0.028
—
Resting spleen cells
12
0.081±0.039
0/12
Activated spleen
20
1.018±0.263
20/20
cells with ConA
Activated spleen
, 百拇医药
20
0.945±0.283
20/20
cells with LPS
Activated spleen
12
0.722±0.309
12/12
cells with IL-2
Note:control mice are normal animal without immunization, —.no positive rate
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2.2 戊二醛处理对活化淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成的影响 实验过程中，通常用戊二醛固定淋巴细胞，使其丧失生物活性而保留免疫原性。为了解戊二醛处理对抗原性的影响，我们分别观察了T、B活化淋巴细胞免疫前经戊二醛处理与不处理对诱导IgG类抗dsDNA抗体生成情况的影响。结果经戊二醛处理与不经处理的活化淋巴细胞均能诱导IgG类抗dsDNA抗体生成，两者比较没有显著差异(P>0.5，数据未列出)，提示淋巴细胞的活化才是诱导IgG类抗dsDNA抗体生成的关键。
2.3 活性细胞核及活性染色质诱导IgG类抗dsDNA抗体生成及其动态变化 免疫前小鼠血清中检测不到dsDNA抗体，活性细胞核或活性染色质3次免疫后7 d，即可测出抗dsDNA抗体，抗体滴度于免疫后14 d时到高峰，而后逐渐降低，至少可持续8 w。与免疫后14 d血清比较，按OD≥OD免疫前+3s为阳性，则活性细胞核或活性染色质免疫组的阳性率为100%(10/10)。静止细胞核和静止染色质免疫的小鼠无一例阳性，结果提示活化淋巴细胞的核及染色质是诱发双链DNA抗体产生的有效免疫原。
, 百拇医药
2.4 抗dsDNA抗体IgG亚类的鉴定 采用ELISA法鉴定不同免疫组诱导产生的抗dsDNA抗体的IgG亚类，结果如表2所示，不管何因素活化的淋巴细胞诱导产生的抗dsDNA抗体均为IgG1亚类。
表2 活化淋巴细胞及其活性核物质诱生的抗dsDNA抗体的IgG亚类的鉴定(OD，n=4,x±s)
Tab.2 IgG subclasses of anti-dsDNA antibody induced by activated lymphocytes and active nuclear particles(OD,n=4,x±s) Immunized mice
IgG1
IgG2a
IgG2b
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IgG3
Control
0.036±0.017
0.018±0.007
0.019±0.018
0.018±0.017
Activated LAK cells
1.402±0.210
0.048±0.016
0.063±0.013
0.036±0.016
, 百拇医药
Activated spleen
1.310±0.172
0.039±0.014
0.100±0.046
0.021±0.013
cells with LPS
Activated spleen
0.693±0.188
0.025±0.014
0.025±0.021
0.005±0.003
, 百拇医药
cells with ConA
Activated cell nucler
0.645±0.376
0.036±0.012
0.058±0.069
0.010±0.010
Activated cell chromatin
0.762±0.278
0.038±0.013
0.092±0.028
0.030±0.015
, 百拇医药
3 讨论
我们用活化的小鼠淋巴细胞作为自身抗原，免疫同系小鼠，结果成功地诱导产生了IgG类抗dsDNA抗体，并且小鼠肾脏有IgG类免疫复合沉积[5，6]。本实验表明这种诱生抗体的能力不受戊二醛处理的影响，而与活化淋巴细胞有关。由于单纯的DNA是没有免疫原性的，有人提出染色质(DNA和蛋白质的复合物)是诱生抗dsDNA抗体的自身抗原[9]。
人们早已观察到感染、遗传、性激素不平衡和免疫调节紊乱以及Fas和Fas配体异常等易诱发SLE[10]，但是不能很好地解释这些不同因素是如何诱导抗核抗体生成的。本实验提出SLE发病学的共同原因可能是淋巴细胞活化引起核抗原的改变，诱导自身抗核抗体的生成。正常机体对未活化的静止染色质呈耐受状态，染色质中与DNA结合的蛋白质或多肽在活化状态下抗原性发生改变，表达新的抗原决定簇或暴露隐蔽的抗原决定簇，激活TH，打破自身T细胞耐受，从而辅助具有应答潜能的识别核抗原的B细胞生成抗体。我们动态观察活性细胞核及活性染色质免疫组抗dsDNA抗体生成的情况，发现符合一般抗原诱生抗体的规律。经过测定，活化淋巴细胞及其活性核物质诱生的IgG类抗dsDNA抗体的亚类均为IgG1。该亚类抗体的生成主要与TH2上亚群分泌的IL-4等细胞因子有关[11]，从而提示TH2亚群可能参与了对B细胞克隆激活和抗dsDNA抗体生成。
, 百拇医药
尽管在正常状态下体内也有一定量的淋巴细胞的活化，但并非每个人都发生狼疮性疾病。什么条件下活化的淋巴细胞才能出现上述核抗原的改变?改变了的核抗原又如何刺激机体产生有效免疫应答?本实验室工作做了较好的回答[12]。
①本课题受国家自然科学基金资助(No.39730430)
作者简介：吴厚生，62岁，教授，主要从事自身免疫病发病机理研究
4 参考文献
1 Tan E M. Antinuclear antibodies:diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology.Adv Immunol,1989;44:93
2 Tillman D M, Marion N T. Both IgM and IgG anti-DNA antibodies are the products of clonally selective B cell stimulation in (NZB/NZW) fe-male mice. J Exp Med,1992;176:361
, 百拇医药
3 Shlomchik M J, Mascelli M, Shan H. Anti-DNA antibodies from autoimmune mice arise by clonal expansion and somatic mutation. J Exp Med,1990;171:265
4 Stollar B D. Immunochemistry of DNA. Int Rev Immunol，1989;5:1
5 卢 琳，李金柱，吴厚生 et al. 促丝裂原活化淋巴细胞诱导抗双链DNA抗体.上海医科大学学报，1997；25(3)：204
6 李金柱，王美英，吴厚生.万豆蛋白A活化脾细胞诱导抗双链DNA抗体生成.中华微生物学和免疫学杂志，1997；17(3)：207
7 钟叔平，何开玲. SRS-淋巴瘤小鼠淋巴细胞染色质理化性质的研究.中国病理生理杂志，1994；10(4)：378
, 百拇医药
8 夏金华，吴厚生. 天然DNA和细胞因子对系统性红斑狼疮患者淋巴细胞体外分泌抗双链DNA抗体的影响.上海医科大学学报，1993；21(2)：109
9 Theofilopoulos A N.The basis of autoimmunity part I:aberrant self recognition.Immunol Today,1995;16:90
10 Steingberg A D. Insights into the basis of systemic lupus. J Autoimmun,1995;8:771
11 Marinaro M, Staats H F, Hiroi T et al. Mucosal adjuvant effect of cholera toxin in mice results from induction of T helper 2(Th2) cells and IL-4.J Immunol,1995;155:4621
12 奚华国，陆春蓉，吴厚生.LAK细胞诱导抗双链DNA抗体生成条件中的研究.上海免疫学杂志，1998；18(5)：306
收稿1997-09-12 修回1998-03-09, 百拇医药
单位：上海医科大学免疫学教研室，上海200032
关键词：活化淋巴细胞；染色质；双链DNA抗体；IgG1亚类
中国免疫学杂志990702 中国图书分类号 R392.3
摘 要 目的：抗双链DNA(dsDNA)抗体的诱生机理不明，试图研究诱导该自身抗体产生的相应自身抗原。方法：取体外活化的Balb/c小鼠脾细胞及其染色质免疫同系小鼠，用ELISA方法检测IgG类抗双链DNA抗体及其IgG亚类。结果：不同原因活化的脾细胞及其染色质均可诱导IgG类抗双链DNA抗体产生，且抗体均为IgG1亚类。结论：活化淋巴细胞及其活性染色质是诱导双链DNA抗体生成的自身免疫原。
Induction of anti-dsDNA IgG1 antibody by immunization with activated lymphocytes and their active chromatin
, http://www.100md.com
WU Hou-Sheng,XI Hua-Guo,LU Lin et al.
Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032
Abstract Objective:The relevant primary autoantigen which induced anti-dsDNA antibodies was still enigmatic.Attempted to investigate the primary autoantigens driving the productiorn of these autoantibodies.Methods:Immunized Balb/c mice with activated syngenic spleen cells primed by ConA or LPS or rIL-2 in vitro and the chromatin isolated from activated spleen cells.Anti-dsDNA IgG antibodies and its subclass were determined by ELISA.Results:The activated lymphocytes and its chromatin all induced anti-dsDNA antibodies and these autoantibodies belong to IgG1 subclass.Conclusion:The results indicated that activated lymphocytes and their active chromatin can be the autoimmunogenes driving the production of anti-dsDNA antibodies.
, 百拇医药
Key words Activated lymphocytes Chromatin Anti-dsDNA antibody IgG1 subclass
哺乳类抗dsDNA抗体是系统性红斑狼疮(SLE)特征性标志和血清学诊断指标之一，与SLE的肾小球肾炎发病密切相关，亦是SLE重要致病性抗体[1]。尽管抗dsDNA抗体的IgG类型转换、VH体突变及抗DNA抗体B细胞克隆的特异增殖都提示这种自身抗体是经抗原特异性激活产生的[2，3]，但是用相应的抗原(天然DNA)免疫不能诱导该抗体产生[4]，至今人们尚不知该自身抗原是何种物质。
我们在用T细胞疫苗(TCV)预防和治疗SLE的过程中发现，空肠弯曲菌活化的小鼠淋巴细胞作为自身抗原免疫同系小鼠能诱导抗dsDNA抗体的生成[5]，ConA以及细菌脂多糖(LPS)活化的脾细胞也能诱导抗dsDNA抗体的生成[6]。本文用不同来源的活化淋巴细胞及其染色质作为抗原，进一步探讨抗dsDNA抗体的生成机理。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 6～8岁周龄Balb/c(H-2d)雌性小鼠购自中英合资西普尔-毕凯实验动物有限公司；ConA、LPS，HRP-羊抗鼠IgG亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)抗体均购自Sigma公司；IL-2购自上海第二军医大学；小牛胸腺DNA、HRP-羊抗鼠IgG抗体、FITC-羊抗鼠IgG抗体均购自上海华美生物制品公司。
1.2 方法
1.2.1 活化淋巴细胞的制备及免疫 无菌操作取脾脏和肠系膜淋巴结，用Tris-NH4Cl破坏红细胞，用完全1640培养液调整细胞浓度为2×106ml-1，分别加ConA(终浓度10 μg/ml)及LPS(终浓度10 μg/ml)或IL-2(终浓度1 000 U/ml)，于37℃ 5%CO2培养72 h，分别经或不经0.3%戊二醛处理，按2×107 cells/只皮下注射，1次/w，共3次。
, 百拇医药
1.2.2 活性细胞核及其染色质的提取和免疫 按何开玲教授改良Chiu法[7]，从ConA活化的和未活化的脾细胞中提取活性和非活性细胞核及染色质，分别按细胞核2×107个/只、染色质50 μg/只皮下注射，1次/w，共3次。3次免疫后眼眶后静脉丛采血，并分离血清。
1.2.3 IgG类抗双链DNA抗体检测[8] 用ELISA方法检测IgG类抗dsDNA抗体生成，酶标板用0.5%硫酸鱼精蛋白预处理。S1核酸酶处理小牛胸腺DNA按50 μg/ml作为包被抗原。检测血清除特别注明外均取免疫后第21天血清，血清样品按1∶50稀释。
2 结果
2.1 活化的淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成 如表1所示，正常鼠和未活化淋巴细胞免疫的小鼠没有一例出现IgG类抗dsDNA抗体；而经ConA激活的T淋巴细胞、经LPS激活的B淋巴细胞及IL-2 活化的LAK细胞免疫的小鼠均检测到高滴度IgG类抗dsDNA抗体生成。按OD≥OD正常+3s为阳性，则阳性率为100%(52/52)。
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表1 活化的淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成
Tab.1 Induction of anti-dsDNA IgG antibody by immunization with activated lymphocytes Immunized mice
n
Anti-dsDNA anti-
bodies(OD,x±s)
Anti-dsDNA antibodies
positive rate
Control
15
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0.057±0.028
—
Resting spleen cells
12
0.081±0.039
0/12
Activated spleen
20
1.018±0.263
20/20
cells with ConA
Activated spleen
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20
0.945±0.283
20/20
cells with LPS
Activated spleen
12
0.722±0.309
12/12
cells with IL-2
Note:control mice are normal animal without immunization, —.no positive rate
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2.2 戊二醛处理对活化淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成的影响 实验过程中，通常用戊二醛固定淋巴细胞，使其丧失生物活性而保留免疫原性。为了解戊二醛处理对抗原性的影响，我们分别观察了T、B活化淋巴细胞免疫前经戊二醛处理与不处理对诱导IgG类抗dsDNA抗体生成情况的影响。结果经戊二醛处理与不经处理的活化淋巴细胞均能诱导IgG类抗dsDNA抗体生成，两者比较没有显著差异(P>0.5，数据未列出)，提示淋巴细胞的活化才是诱导IgG类抗dsDNA抗体生成的关键。
2.3 活性细胞核及活性染色质诱导IgG类抗dsDNA抗体生成及其动态变化 免疫前小鼠血清中检测不到dsDNA抗体，活性细胞核或活性染色质3次免疫后7 d，即可测出抗dsDNA抗体，抗体滴度于免疫后14 d时到高峰，而后逐渐降低，至少可持续8 w。与免疫后14 d血清比较，按OD≥OD免疫前+3s为阳性，则活性细胞核或活性染色质免疫组的阳性率为100%(10/10)。静止细胞核和静止染色质免疫的小鼠无一例阳性，结果提示活化淋巴细胞的核及染色质是诱发双链DNA抗体产生的有效免疫原。
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2.4 抗dsDNA抗体IgG亚类的鉴定 采用ELISA法鉴定不同免疫组诱导产生的抗dsDNA抗体的IgG亚类，结果如表2所示，不管何因素活化的淋巴细胞诱导产生的抗dsDNA抗体均为IgG1亚类。
表2 活化淋巴细胞及其活性核物质诱生的抗dsDNA抗体的IgG亚类的鉴定(OD，n=4,x±s)
Tab.2 IgG subclasses of anti-dsDNA antibody induced by activated lymphocytes and active nuclear particles(OD,n=4,x±s) Immunized mice
IgG1
IgG2a
IgG2b
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IgG3
Control
0.036±0.017
0.018±0.007
0.019±0.018
0.018±0.017
Activated LAK cells
1.402±0.210
0.048±0.016
0.063±0.013
0.036±0.016
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Activated spleen
1.310±0.172
0.039±0.014
0.100±0.046
0.021±0.013
cells with LPS
Activated spleen
0.693±0.188
0.025±0.014
0.025±0.021
0.005±0.003
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cells with ConA
Activated cell nucler
0.645±0.376
0.036±0.012
0.058±0.069
0.010±0.010
Activated cell chromatin
0.762±0.278
0.038±0.013
0.092±0.028
0.030±0.015
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3 讨论
我们用活化的小鼠淋巴细胞作为自身抗原，免疫同系小鼠，结果成功地诱导产生了IgG类抗dsDNA抗体，并且小鼠肾脏有IgG类免疫复合沉积[5，6]。本实验表明这种诱生抗体的能力不受戊二醛处理的影响，而与活化淋巴细胞有关。由于单纯的DNA是没有免疫原性的，有人提出染色质(DNA和蛋白质的复合物)是诱生抗dsDNA抗体的自身抗原[9]。
人们早已观察到感染、遗传、性激素不平衡和免疫调节紊乱以及Fas和Fas配体异常等易诱发SLE[10]，但是不能很好地解释这些不同因素是如何诱导抗核抗体生成的。本实验提出SLE发病学的共同原因可能是淋巴细胞活化引起核抗原的改变，诱导自身抗核抗体的生成。正常机体对未活化的静止染色质呈耐受状态，染色质中与DNA结合的蛋白质或多肽在活化状态下抗原性发生改变，表达新的抗原决定簇或暴露隐蔽的抗原决定簇，激活TH，打破自身T细胞耐受，从而辅助具有应答潜能的识别核抗原的B细胞生成抗体。我们动态观察活性细胞核及活性染色质免疫组抗dsDNA抗体生成的情况，发现符合一般抗原诱生抗体的规律。经过测定，活化淋巴细胞及其活性核物质诱生的IgG类抗dsDNA抗体的亚类均为IgG1。该亚类抗体的生成主要与TH2上亚群分泌的IL-4等细胞因子有关[11]，从而提示TH2亚群可能参与了对B细胞克隆激活和抗dsDNA抗体生成。
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尽管在正常状态下体内也有一定量的淋巴细胞的活化，但并非每个人都发生狼疮性疾病。什么条件下活化的淋巴细胞才能出现上述核抗原的改变?改变了的核抗原又如何刺激机体产生有效免疫应答?本实验室工作做了较好的回答[12]。
①本课题受国家自然科学基金资助(No.39730430)
作者简介：吴厚生，62岁，教授，主要从事自身免疫病发病机理研究
4 参考文献
1 Tan E M. Antinuclear antibodies:diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology.Adv Immunol,1989;44:93
2 Tillman D M, Marion N T. Both IgM and IgG anti-DNA antibodies are the products of clonally selective B cell stimulation in (NZB/NZW) fe-male mice. J Exp Med,1992;176:361
, 百拇医药
3 Shlomchik M J, Mascelli M, Shan H. Anti-DNA antibodies from autoimmune mice arise by clonal expansion and somatic mutation. J Exp Med,1990;171:265
4 Stollar B D. Immunochemistry of DNA. Int Rev Immunol，1989;5:1
5 卢 琳，李金柱，吴厚生 et al. 促丝裂原活化淋巴细胞诱导抗双链DNA抗体.上海医科大学学报，1997；25(3)：204
6 李金柱，王美英，吴厚生.万豆蛋白A活化脾细胞诱导抗双链DNA抗体生成.中华微生物学和免疫学杂志，1997；17(3)：207
7 钟叔平，何开玲. SRS-淋巴瘤小鼠淋巴细胞染色质理化性质的研究.中国病理生理杂志，1994；10(4)：378
, 百拇医药
8 夏金华，吴厚生. 天然DNA和细胞因子对系统性红斑狼疮患者淋巴细胞体外分泌抗双链DNA抗体的影响.上海医科大学学报，1993；21(2)：109
9 Theofilopoulos A N.The basis of autoimmunity part I:aberrant self recognition.Immunol Today,1995;16:90
10 Steingberg A D. Insights into the basis of systemic lupus. J Autoimmun,1995;8:771
11 Marinaro M, Staats H F, Hiroi T et al. Mucosal adjuvant effect of cholera toxin in mice results from induction of T helper 2(Th2) cells and IL-4.J Immunol,1995;155:4621
12 奚华国，陆春蓉，吴厚生.LAK细胞诱导抗双链DNA抗体生成条件中的研究.上海免疫学杂志，1998；18(5)：306
收稿1997-09-12 修回1998-03-09, 百拇医药