冬虫夏草多糖保护小鼠免疫性肝损伤的筛选研究
作者：许建明 丁长海 李连德 梅 俏 李春如 樊美珍
单位：许建明 丁长海 梅 俏 樊美珍 安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032；李连德 李春如 安徽农业大学经济昆虫菌物研究所，合肥 230032
关键词：冬虫夏草；肝；病理学；免疫性疾病；小鼠
安徽医科大学学报990306 摘要 目的 评价6种冬虫夏草多糖对小鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法 序贯注射卡介苗和脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤模型，在造模过程中，每日灌服6种冬虫夏草多糖每鼠各150 mg，共12天。检测血清转氨酶和肝匀浆超氧化物歧化酶的活力、肝匀浆丙二醛浓度、肝脾脏器指数，并做肝脏病理学检查。结果 6种冬虫夏草多糖均有抗肝脏脂质过氧化作用，使肝匀浆丙二醛含量下降，超氧化物歧化酶活力升高(P<0.05或0.01)。其中地顶孢霉菌株来源的冬虫夏草多糖尚可显著降低血清转氨酶活力和肝脾脏器指数(P<0.05或0.01)，并改善肝坏死程度(P<0.05)。结论 在6种冬虫夏草多糖中，地顶孢霉菌株提取的虫草多糖具有较好的抗小鼠免疫性肝损伤作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R282.71
Evaluation for the protective effect of cordyceps
polysaccharides on immunological liver injury in mice
Xu Jianming, Ding Changhai, Li Liande et al
(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Midical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To evaluate the protective effect of 6 kinds of cordyceps polysaccharides on immunological liver injury in mice. Methods An immunological liver injury model was induced by administration of lipopolysaccharide following injection of BCG vaccine into mice, while 6 polysaccharides from different origins of cordyceps was given at ig 150 mg*d-1 for 12 days. The activities of serum transaminase (ALT, AST) and liver SOD, the concentration of liver MDA, the weighting indexes of liver and spleen, the liver pathology was comparatively observed to evaluate the effects of different cordyceps polysaccharides on immunological liver injury. Results The lipid peroxidation of immunological liver injury in mice was inhibited by all kinds of cordyceps polysaccharides, as indicated by decreased level of MDA and increased activity of SOD in the liver homogenates (P<0.05～0.01). It was especially found that polysaccharides from Acremonium terricola could significantly suppresed the elevation of serum transaminase and weighting indexes of liver or spleen(P<0.05～0.01)， one of which also improved the necrosis in the liver(P<0.05). Conclusion Of 6 cordyceps polysaccharides, the polysaccharide from Acremonium terricoal has better protective effect on immunological liver injury in mice.
, 百拇医药
MeSH cordyceps sinensis; liver/pathol; immunologic diseases; mice
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc〕寄生虫草蝙蝠的幼虫后形成的子座及干燥虫体。近年来国内外对冬虫夏草的化学成分及药理作用进行了广泛的研究，发现冬虫夏草的多糖成分可明显影响机体免疫功能，并可防治免疫损伤性肝硬化〔1，2〕〕，但尚无冬虫夏草多糖对急性免疫性肝损伤的报道。本研究在卡介苗加脂多糖诱发的小鼠免疫性肝损伤模型中，试用6种冬虫夏草多糖并评价其抗肝损伤作用，以期筛选出具有较好保肝作用的冬虫夏草菌株及其多糖成分。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品 6种冬虫夏草多糖由安徽农业大学提供，其菌株与多糖含量分别是：A.中国被毛孢菌phso 1，含多糖30%；B.中国被毛孢菌phso 4，含多糖80%；C.古尼拟青酶小孢菌变种ppGM，含多糖72.2%；D.地顶孢霉菌pAtol，含孢内多糖96%；E.地顶孢霉菌pAtolE，含孢外多糖97.1%；F.戴氏绿僵菌pMtol，含多糖70.1%。临用前以生理盐水配制。
, 百拇医药
1.1.2 试剂 卡介苗(BCG vaccine)购自安徽省结核病防治所，批号961101。脂多糖(LPS)系Sigma公司产品，1，1，3，3-四乙基丙烷(TEP)系Fluka公司产品。硫代巴比妥酸(TBA)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)分别购自上海试剂二厂和上海前进试剂厂。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒系上海荣盛试剂公司产品。
表1 6种冬虫夏草多糖对血清转氨酶和肝脏病理的影响(
±s,n=8)
组 别
血清转氨酶(kU.L-1)
肝细胞坏死程度
ALT
, 百拇医药
AST
正常对照
41.2±9.6
20.9±8.2
0
模型对照
83.5±26.4△△
51.7±9.6△△
2.4±0.6△△
冬虫夏草多糖处理
A
67.2±25.2
, 百拇医药
50.8±9.6
2.2±0.7
B
78.7±24.8
39.8±13.4
2.5±0.5
C
76.9±48.0
31.6±14.8**
2.3±0.6
D
48.0±19.2**
, 百拇医药
44.5±2.4*
1.8±0.9
E
38.4±9.6**
42.0±9.6*
1.0±0.5*
F
52.8±28.8**
53.6±12.6*
2.2±0.7
与正常对照组比较：△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2 6种冬虫夏草多糖对肝匀浆MDA、SOD以及脏器指数的影响(±s,n=8) 组 别
, 百拇医药
MDA
(nmol.g-1湿重)
SOD
(U.g-1湿重)
脏器指数(mg.10 g-1)
肝 脏
脾 脏
正常对照
105.6±18.6
228.0±48.0
580.0±50.0
, 百拇医药
59.0±10.0
模型对照
202.6±26.6△△
150.4±64.0△△
700.0±30.00△△
82.0±10.0△△
冬虫夏草多糖处理
A
133.3±26.6**
244.0±108.0*
, 百拇医药
670.0±30.0
90.0±8.0
B
129.3±45.3**
296.0±28.0**
720.0±100.0
90.0±20.0
C
82.6±8.0**
292.0±26.4**
660.0±60.0
, http://www.100md.com
100.0±20.0
D
96.0±16.0**
304.0±4.0**
620.0±60.0*
70.0±4.0*
E
85.3±18.6**
300.0±8.0**
550.0±90.0*
, http://www.100md.com
68.0±9.0*
F
82.6±5.3**
272.0±27.6**
670.0±30.0
86.0±10.0
与正常对照组比较：△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.011.1.3 动物 昆明系小鼠，♂，20 g±2 g，由安徽医科大学实验动物中心(皖医实动准字第01号)提供。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 小鼠免疫性肝损伤模型的制备与药物处理 参照文献〔3〕制作小鼠免疫性肝损伤模型，即由尾静脉iv 0.2 ml内含BCG 2.5 mg的生理盐水悬液，12 d后每鼠iv LPS 10 μg，16 h后处死小鼠，取血和肝脾组织作有关检测。在造模过程中，每鼠每日灌胃6种冬虫夏草多糖各150 mg，连续12天；模型对照组灌胃等量生理盐水。
1.2.2 肝损伤指标的检测 按试剂盒说明书操作步骤，用改良金氏法测定血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。称量肝脏和脾脏的湿重，计算脏器指数。选肝右叶用冷生理盐水漂洗去除积血，拭净后再用冷生理盐水制备100 g.L-1肝匀浆，分别按TBA法〔4〕和核黄素-NBT法〔5〕测定丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。另取肝左叶做病理检查，按肝脏坏死程度分为4级：0级，没有肝坏死；1级，轻度肝坏死；2级，中度肝坏死；3级，严重肝坏死。依此累计每组动物肝坏死级数，计算其平均肝坏死级数与标准差〔6〕。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 各项数据以±s表示，用t检验比较组间差异的显著性。
2 结果
2.1 6种冬虫夏草多糖对血清转氨酶和肝脏病理的影响 如表1所示，D、E 2种冬虫夏草多糖降低血浆转氨酶的作用显著(P<0.05或0.01)，其中E尚可减轻肝细胞坏死程度(P<0.05)。冬虫夏草多糖F亦有降酶作用(P<0.05)，冬虫夏草多糖C仅有降低单种血清转氨酶(AST)的作用，A、B二种虫草多糖无明显降酶作用。
2.2 6种冬虫夏草多糖对肝脏脂质过氧化和脏器指数的影响 如表2所示，6种冬虫夏草多糖均可显著降低肝匀浆中MDA含量，增加SOD的活力(P<0.05或0.01)。其中D、E2种冬虫夏草多糖尚有降低肝脾脏器指数的作用(P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
给小鼠注射卡介苗可使巨噬细胞和中性多核粒细胞聚集于肝脏，使肝脏处于致敏状态。继而用低毒剂量的脂多糖攻击，可激发这些细胞释放TNFα等炎症因子，造成肝脏炎症、坏死。这种动物模型适合于从免疫途径筛选新药，亦可用于从理论上研究免疫与细胞损伤的关系〔3，6〕。本研究针对冬虫夏草多糖具有免疫调节活性的特点，故而选用这种模型进行药理筛选试验，试图选出保肝作用较好的冬虫夏草多糖种类。
已有的研究表明，冬虫夏草多糖通过改善机体细胞免疫功能，加快有害物质的清除，而减轻肝细胞损伤。但在不同菌株中提取的冬虫夏草多糖，含量及其作用强度均有所不同〔1，7〕。在我们的筛选试验中，发现地顶孢霉菌的孢内多糖(D)和孢外多糖(E)均可显著降低血清两种转氨酶活力，具有较好的保肝作用。其他4种冬虫夏草多糖则分别因降酶作用较弱，或降酶作用普遍性差，或无降酶作用，而不能肯定其改善肝功能的作用。病理学检查进一步发现，地顶孢霉菌孢多糖(E)对肝细胞坏死亦有一定的改善作用，说明这种冬虫夏草多糖具有更好的抗肝损伤作用。
, 百拇医药
从本文的其他结果来看，地顶孢酶菌中提取的两种冬虫夏草多糖(D、E)不仅可降低肝脏的脏器指数，而且亦降低脾脏的脏器指数，是否因其免疫调节作用所致，尚待进一步研究。此外，6种冬虫夏草多糖均具有抗肝脏脂质过氧化作用，使肝脏MDA含量下降，SOD活性上升，提示冬虫夏草多糖的抗氧化作用可能与其肝脏保护作用有关。
作者简介：许建明，男，45岁，博士，副主任医师，副教授
参考文献
1 张传开，袁盛熔. 冬虫夏草及其人工菌丝的药理研究进展. 首都医科大学学报，1997；18(3)：287～290
2 朱家璇，王宝恩，王泰玲. 冬虫夏草对实验性免疫性肝纤维化的预防和治疗作用的研究. 中华消化内科杂志，1994；14(6)：333～336
3 Nagai H, Yakuo I， Yamada H et al. Liver imjury model in mice for immunopharmacological study. Japam J Pharmacology, 1988;46(3):247～254
, 百拇医药
4 Ohkawa H, Ohishi N, Yagik. Assay for lipid peroxdes in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979;95(4):351～354
5 韩德惠. 肝羟脯氨酸测定方法. 见：陈 奇主编. 中药药理研究方法学. 北京：人民卫生出版社，1993：846～847
6 Wang GS, Liu GT. Role of nitric oxide in immunological liver damage in mice. Biochem Pharmacol, 1995;49(2):1 277～1 281
7 吕瑞绵，杨永春，杨云鹤 等. 冬虫夏草化学成分研究. 药学通报，1981；16(9)：55～57
1999-01-13收稿, 百拇医药
单位：许建明 丁长海 梅 俏 樊美珍 安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032；李连德 李春如 安徽农业大学经济昆虫菌物研究所，合肥 230032
关键词：冬虫夏草；肝；病理学；免疫性疾病；小鼠
安徽医科大学学报990306 摘要 目的 评价6种冬虫夏草多糖对小鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法 序贯注射卡介苗和脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤模型，在造模过程中，每日灌服6种冬虫夏草多糖每鼠各150 mg，共12天。检测血清转氨酶和肝匀浆超氧化物歧化酶的活力、肝匀浆丙二醛浓度、肝脾脏器指数，并做肝脏病理学检查。结果 6种冬虫夏草多糖均有抗肝脏脂质过氧化作用，使肝匀浆丙二醛含量下降，超氧化物歧化酶活力升高(P<0.05或0.01)。其中地顶孢霉菌株来源的冬虫夏草多糖尚可显著降低血清转氨酶活力和肝脾脏器指数(P<0.05或0.01)，并改善肝坏死程度(P<0.05)。结论 在6种冬虫夏草多糖中，地顶孢霉菌株提取的虫草多糖具有较好的抗小鼠免疫性肝损伤作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R282.71
Evaluation for the protective effect of cordyceps
polysaccharides on immunological liver injury in mice
Xu Jianming, Ding Changhai, Li Liande et al
(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Midical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To evaluate the protective effect of 6 kinds of cordyceps polysaccharides on immunological liver injury in mice. Methods An immunological liver injury model was induced by administration of lipopolysaccharide following injection of BCG vaccine into mice, while 6 polysaccharides from different origins of cordyceps was given at ig 150 mg*d-1 for 12 days. The activities of serum transaminase (ALT, AST) and liver SOD, the concentration of liver MDA, the weighting indexes of liver and spleen, the liver pathology was comparatively observed to evaluate the effects of different cordyceps polysaccharides on immunological liver injury. Results The lipid peroxidation of immunological liver injury in mice was inhibited by all kinds of cordyceps polysaccharides, as indicated by decreased level of MDA and increased activity of SOD in the liver homogenates (P<0.05～0.01). It was especially found that polysaccharides from Acremonium terricola could significantly suppresed the elevation of serum transaminase and weighting indexes of liver or spleen(P<0.05～0.01)， one of which also improved the necrosis in the liver(P<0.05). Conclusion Of 6 cordyceps polysaccharides, the polysaccharide from Acremonium terricoal has better protective effect on immunological liver injury in mice.
, 百拇医药
MeSH cordyceps sinensis; liver/pathol; immunologic diseases; mice
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc〕寄生虫草蝙蝠的幼虫后形成的子座及干燥虫体。近年来国内外对冬虫夏草的化学成分及药理作用进行了广泛的研究，发现冬虫夏草的多糖成分可明显影响机体免疫功能，并可防治免疫损伤性肝硬化〔1，2〕〕，但尚无冬虫夏草多糖对急性免疫性肝损伤的报道。本研究在卡介苗加脂多糖诱发的小鼠免疫性肝损伤模型中，试用6种冬虫夏草多糖并评价其抗肝损伤作用，以期筛选出具有较好保肝作用的冬虫夏草菌株及其多糖成分。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品 6种冬虫夏草多糖由安徽农业大学提供，其菌株与多糖含量分别是：A.中国被毛孢菌phso 1，含多糖30%；B.中国被毛孢菌phso 4，含多糖80%；C.古尼拟青酶小孢菌变种ppGM，含多糖72.2%；D.地顶孢霉菌pAtol，含孢内多糖96%；E.地顶孢霉菌pAtolE，含孢外多糖97.1%；F.戴氏绿僵菌pMtol，含多糖70.1%。临用前以生理盐水配制。
, 百拇医药
1.1.2 试剂 卡介苗(BCG vaccine)购自安徽省结核病防治所，批号961101。脂多糖(LPS)系Sigma公司产品，1，1，3，3-四乙基丙烷(TEP)系Fluka公司产品。硫代巴比妥酸(TBA)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)分别购自上海试剂二厂和上海前进试剂厂。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒系上海荣盛试剂公司产品。
表1 6种冬虫夏草多糖对血清转氨酶和肝脏病理的影响(
±s,n=8)组 别
血清转氨酶(kU.L-1)
肝细胞坏死程度
ALT
, 百拇医药
AST
正常对照
41.2±9.6
20.9±8.2
0
模型对照
83.5±26.4△△
51.7±9.6△△
2.4±0.6△△
冬虫夏草多糖处理
A
67.2±25.2
, 百拇医药
50.8±9.6
2.2±0.7
B
78.7±24.8
39.8±13.4
2.5±0.5
C
76.9±48.0
31.6±14.8**
2.3±0.6
D
48.0±19.2**
, 百拇医药
44.5±2.4*
1.8±0.9
E
38.4±9.6**
42.0±9.6*
1.0±0.5*
F
52.8±28.8**
53.6±12.6*
2.2±0.7
与正常对照组比较：△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2 6种冬虫夏草多糖对肝匀浆MDA、SOD以及脏器指数的影响(
±s,n=8) 组 别, 百拇医药
MDA
(nmol.g-1湿重)
SOD
(U.g-1湿重)
脏器指数(mg.10 g-1)
肝 脏
脾 脏
正常对照
105.6±18.6
228.0±48.0
580.0±50.0
, 百拇医药
59.0±10.0
模型对照
202.6±26.6△△
150.4±64.0△△
700.0±30.00△△
82.0±10.0△△
冬虫夏草多糖处理
A
133.3±26.6**
244.0±108.0*
, 百拇医药
670.0±30.0
90.0±8.0
B
129.3±45.3**
296.0±28.0**
720.0±100.0
90.0±20.0
C
82.6±8.0**
292.0±26.4**
660.0±60.0
, http://www.100md.com
100.0±20.0
D
96.0±16.0**
304.0±4.0**
620.0±60.0*
70.0±4.0*
E
85.3±18.6**
300.0±8.0**
550.0±90.0*
, http://www.100md.com
68.0±9.0*
F
82.6±5.3**
272.0±27.6**
670.0±30.0
86.0±10.0
与正常对照组比较：△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.011.1.3 动物 昆明系小鼠，♂，20 g±2 g，由安徽医科大学实验动物中心(皖医实动准字第01号)提供。
1.2 方法
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1.2.1 小鼠免疫性肝损伤模型的制备与药物处理 参照文献〔3〕制作小鼠免疫性肝损伤模型，即由尾静脉iv 0.2 ml内含BCG 2.5 mg的生理盐水悬液，12 d后每鼠iv LPS 10 μg，16 h后处死小鼠，取血和肝脾组织作有关检测。在造模过程中，每鼠每日灌胃6种冬虫夏草多糖各150 mg，连续12天；模型对照组灌胃等量生理盐水。
1.2.2 肝损伤指标的检测 按试剂盒说明书操作步骤，用改良金氏法测定血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。称量肝脏和脾脏的湿重，计算脏器指数。选肝右叶用冷生理盐水漂洗去除积血，拭净后再用冷生理盐水制备100 g.L-1肝匀浆，分别按TBA法〔4〕和核黄素-NBT法〔5〕测定丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。另取肝左叶做病理检查，按肝脏坏死程度分为4级：0级，没有肝坏死；1级，轻度肝坏死；2级，中度肝坏死；3级，严重肝坏死。依此累计每组动物肝坏死级数，计算其平均肝坏死级数与标准差〔6〕。
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1.3 统计学处理 各项数据以
±s表示，用t检验比较组间差异的显著性。2 结果
2.1 6种冬虫夏草多糖对血清转氨酶和肝脏病理的影响 如表1所示，D、E 2种冬虫夏草多糖降低血浆转氨酶的作用显著(P<0.05或0.01)，其中E尚可减轻肝细胞坏死程度(P<0.05)。冬虫夏草多糖F亦有降酶作用(P<0.05)，冬虫夏草多糖C仅有降低单种血清转氨酶(AST)的作用，A、B二种虫草多糖无明显降酶作用。
2.2 6种冬虫夏草多糖对肝脏脂质过氧化和脏器指数的影响 如表2所示，6种冬虫夏草多糖均可显著降低肝匀浆中MDA含量，增加SOD的活力(P<0.05或0.01)。其中D、E2种冬虫夏草多糖尚有降低肝脾脏器指数的作用(P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
给小鼠注射卡介苗可使巨噬细胞和中性多核粒细胞聚集于肝脏，使肝脏处于致敏状态。继而用低毒剂量的脂多糖攻击，可激发这些细胞释放TNFα等炎症因子，造成肝脏炎症、坏死。这种动物模型适合于从免疫途径筛选新药，亦可用于从理论上研究免疫与细胞损伤的关系〔3，6〕。本研究针对冬虫夏草多糖具有免疫调节活性的特点，故而选用这种模型进行药理筛选试验，试图选出保肝作用较好的冬虫夏草多糖种类。
已有的研究表明，冬虫夏草多糖通过改善机体细胞免疫功能，加快有害物质的清除，而减轻肝细胞损伤。但在不同菌株中提取的冬虫夏草多糖，含量及其作用强度均有所不同〔1，7〕。在我们的筛选试验中，发现地顶孢霉菌的孢内多糖(D)和孢外多糖(E)均可显著降低血清两种转氨酶活力，具有较好的保肝作用。其他4种冬虫夏草多糖则分别因降酶作用较弱，或降酶作用普遍性差，或无降酶作用，而不能肯定其改善肝功能的作用。病理学检查进一步发现，地顶孢霉菌孢多糖(E)对肝细胞坏死亦有一定的改善作用，说明这种冬虫夏草多糖具有更好的抗肝损伤作用。
, 百拇医药
从本文的其他结果来看，地顶孢酶菌中提取的两种冬虫夏草多糖(D、E)不仅可降低肝脏的脏器指数，而且亦降低脾脏的脏器指数，是否因其免疫调节作用所致，尚待进一步研究。此外，6种冬虫夏草多糖均具有抗肝脏脂质过氧化作用，使肝脏MDA含量下降，SOD活性上升，提示冬虫夏草多糖的抗氧化作用可能与其肝脏保护作用有关。
作者简介：许建明，男，45岁，博士，副主任医师，副教授
参考文献
1 张传开，袁盛熔. 冬虫夏草及其人工菌丝的药理研究进展. 首都医科大学学报，1997；18(3)：287～290
2 朱家璇，王宝恩，王泰玲. 冬虫夏草对实验性免疫性肝纤维化的预防和治疗作用的研究. 中华消化内科杂志，1994；14(6)：333～336
3 Nagai H, Yakuo I， Yamada H et al. Liver imjury model in mice for immunopharmacological study. Japam J Pharmacology, 1988;46(3):247～254
, 百拇医药
4 Ohkawa H, Ohishi N, Yagik. Assay for lipid peroxdes in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979;95(4):351～354
5 韩德惠. 肝羟脯氨酸测定方法. 见：陈 奇主编. 中药药理研究方法学. 北京：人民卫生出版社，1993：846～847
6 Wang GS, Liu GT. Role of nitric oxide in immunological liver damage in mice. Biochem Pharmacol, 1995;49(2):1 277～1 281
7 吕瑞绵，杨永春，杨云鹤 等. 冬虫夏草化学成分研究. 药学通报，1981；16(9)：55～57
1999-01-13收稿, 百拇医药