HPLC法测定淡豆豉中异黄酮的含量
作者：毛峻琴 宓鹤鸣 娄子洋 柴逸峰 杨根金 刘荔荔 邢旺兴
单位：毛峻琴(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；宓鹤鸣(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；娄子洋(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；柴逸峰(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；杨根金(药物分析测试中心)；刘荔荔(药物分析测试中心)；邢旺兴(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)
关键词：淡豆豉；色谱法，高效液相；异黄酮；化学
第二军医大学学报001017 [摘要]目的:探讨以HPLC法对淡豆豉中异 黄酮的定量分析。方法:采用HPLC法，YWGC18柱，以甲醇∶水∶ 乙酸(10∶10∶1)为流动相，检测波长260 nm, 测定淡豆豉中染料木素、大豆黄素含 量。结果：淡豆豉中游离染料木素含量为(230.64±9.14) μg/g 、大豆黄素含量为(264.26±4.22) μg/g；用盐酸水解处理后样品中染料木素总含量为(276 .00±7.81) μg/g，大豆黄素总含量为(287.65±5.70) μg/g。结论：用HPLC法测定淡豆豉中异黄酮类成分含量，建立的方法准确、简便，可用于控制和评价淡 豆豉的品质。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 284.1 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0955-03
Detection of isoflavones contents in Seme sojae preparatum by HPLC
MAO Jun-Qin, MI He-Ming, LOU Zi-Yang， CHAI Yi-Feng，XING Wang-Xing
(Department of Pharmaceutical Ana lysis, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
YANG Gen- Jin，LIU Li-Li
, 百拇医药
(Pharmaceutical Analysis and Test Center)
[ABSTRACT] Objective: To provide evidence and method for eval uating the quality of Seme sojae preparatum (SSP). Methods: Contents of the isoflavones (genistein and daidzein) in SSP was measured by HPLC [ a column of YWGC18, methanol∶water∶acetic acid (10∶10∶1) as a mobi le phase, detective wave 260 nm]. Results: The content of genis tein was (230.64±9.14)μg/g and daidzein was (264.26±4.22) μg/g in SSP. The t otal contents of genistein and daidzein were (276.00±7.81) and (287.65±5. 70)μg/g respectively after hydrolysis by HCl. Conclusion: Deter mination of isoflavones in SSP by HPLC is acurate and conveniet. The results sho w that it is a suitable method for evaluating the quality of SSP.
, 百拇医药
[KEY WORDS] Seme sojae preparatum ； chromatography， high perfo rmance liquid; isoflavones; chemistry
淡豆豉是由豆科植物大豆[Glycine max(L.) Merr.]的成熟种子和青蒿、桑叶等中 药经发酵加工而成的制品,作为常用中药，历版《中国药典》均有记载。本品具有解表除烦 ，宣发郁热等功效，可用于感冒、寒热、头痛，烦躁、胸闷，虚烦不眠等症[1]。 然而，长期以来人们对淡豆豉缺乏深入研究，没有完善的质量控制标准,至今药典收载的方 法尚不能客观、有效地控制和评价淡豆豉的质量。为此，本文报告淡豆豉中异黄酮类成分的 HPLC法定量分析研究工作，旨在为淡豆豉的质量评价提供科学依据和方法。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 Waters高效液相色谱仪包括Waters 515泵，Waters 2487UV检测器，Rheodyne 7725I进样阀；Branson1200超声清洗器；旋转薄膜蒸发器。染料木素对 照品(Sigma公司，含量约为98%); 大豆黄素对照品(东北第六制药厂，含量约为95%) ；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸等均为分析纯。
, 百拇医药
1.2 色谱条件 色谱柱YWGC18，250 mm×4.5 mm, 10 μm (大连依利特公 司); 流动相为甲醇∶水∶乙酸(10∶10∶1)；检测波长260 nm；流速0.8 ml/min；灵敏度 0.01AUFS; 进样量20 μl。
1.3 样品制备 按照《中国药典》1995年版记载方法制备淡豆豉原料药。将自制 淡豆豉样品60℃干燥，粉碎，过60目筛。精密称取1 g，置具塞试管中，加入10 ml 80%乙醇 ，混匀，超声处理10 min, 离心5 min (3 000 r/min)，连续提取3次。合并提取液，减压蒸 干，80%乙醇定容，进样前用0.45 μm滤膜过滤。水解样品的制备是在样品中加入10 ml含有 2 mol/L盐酸的80%乙醇液，其余操作同上。黑色种皮品系大豆来源于东北地区，制备方法同 上。
1.4 提取和水解条件的选择
1.4.1 提取方法和溶剂的选择 超声连续提取3次的提取率与索氏提取率相近，并 省时，所以选择超声提取。选用不同浓度甲醇和乙醇作为提取溶剂，实验结果表明80%甲醇 和80%乙醇提取率相近，均较高；考虑到对人体的安全性，选择80%乙醇作为提取溶剂。
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1.4.2 水解条件选择 利用酸水解样品中的黄酮甙来测定染料木素总含量及大豆 黄素总含量。经用不同浓度的HCl试验, 结果显示2 mol/L HCl为最佳水解条件。
1.5 分析条件的选择 染料木素和大豆黄素结构相似，C18柱对其有良好的 选择性，所以选用C18柱。选择不同比例的甲醇、水、乙酸的混合溶剂洗脱，结果显 示用甲醇∶水∶乙酸(10∶10∶1)为最佳洗脱溶剂系统。
1.6 标准曲线的制备 精密称取各标准品，氯仿-甲醇(2∶1)溶解、定容。染 料木素80.00 μg/ml; 大豆黄素105.40 μg/ml,分别稀释1/2，1/5，1/10，1/20， 1/40五个浓度梯度。以峰面积Y和浓度X进行回归，线性回归方程分别为：
染料木素 Y=2 374.71X-789.46 (r=0.999 1)，浓度范围 2.00～40.00 μg/ml;
, 百拇医药
大豆黄素 Y=1 438.66X-448.59 (r=0.999 3)，浓度范围 2.64～52.70 μg/ml。
1.7 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品粉末，加入一定量对照品，按1.9 项样品测定法进行测定，计算回收率。结果为直接提取法样品中染料木素回收率(87.15±5. 16)%，大豆黄素回收率(98.3±7.81)%；水解提取法样品中染料木素回收率(92. 31±6.36)%,大豆黄素回收率(97.46±8.23)% (n=5)。
1.8 精密度实验 将同一样品在1 d内重复进样5次，以计算日内标准差。同时， 将同一样品连续测定5 d，以计算日间标准差。结果表明，日内及日间标准差均小于3%，说 明本法比较稳定、重现性好。
1.9 样品测定 根据各种异黄酮成分的线性范围配制一定浓度的样品溶液，用外 标法对各成分的色谱峰的峰面积进行测定并换算实际含量。
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2 结 果
用上述建立的方法对淡豆豉和大豆(黑色种皮品系)中两种异黄酮成分染料木素和大豆黄 素的含量进行测定，并对样品经酸水解前后的测定结果进行比较。详细结果见表1，同时进 行3个批次样品测定。HPLC分离色谱图见图1。
表 1 淡豆豉和大豆中异黄酮的含量
Tab 1 Contents of isoflavones in
SSP and black bean(n=3,
±s，ρB/μg*ml-1) Sampl e
Genistein
Daidzein
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Free
Hydrolysis
Free
Hydrolysis
Black bean
155.56±
383.06±
136.22±
410.45±
5.60
11.25
3.68
, 百拇医药
13.11
SSP
230.64±
276.00±
264.26±
287.65±
9.14
7.81
4.22
5.70
图 1 样品色谱图
, 百拇医药
Fig 1 Chromatogram of sample
A: Standard; B: Sample; 1. Daidzein; 2. Genistein
3 讨 论
淡豆豉为常用中药，是历版中国药典收载的品种，但至今未见其成分研究报道。淡豆豉由大 豆(一般用黑色种皮的品系)、青蒿和桑叶等药经发酵制备而成，处方中大豆用量最高。已 有的研究报道认为，制备淡豆豉的主要原料大豆中的异黄酮类物质为活性成分，具有抗肿瘤 、抗氧化等多方面功效[2]，其中主要包括染料木素、大豆黄素、鸡豆黄素A等。我 们以淡豆豉中染料木素和大豆黄素为指标，建立定量分析方法用于评价淡豆豉的质量，并与 原料黑大豆中相同成分进行比较获知：淡豆豉中游离染料木素含量比原料大豆中高48.3%， 大豆黄素含量比原料大豆高94%。结果提示淡豆豉经过发酵，受真菌、温度、湿度、酸度等 影响，其异黄酮甙元与糖发生解离，使游离甙元含量提高。通过酸水解使样品中甙键断裂， 可测得甙元总含量。实验结果显示，淡豆豉中染料木素、大豆黄素总含量低于原料大豆中的 含量，这可能是由于制备淡豆豉过程中煎煮、发酵等步骤使大豆黄酮类成分丢失或破坏所致 。
, 百拇医药
本文建立的HPLC法对淡豆豉中异黄酮进行定量分析，方法的灵敏度高，重现性好，与我们 曾用薄层扫描法测定结果比较，HPLC法灵敏度明显提高。因此本法适用于淡豆豉药材的质量 检验。
象淡豆豉这样的发酵性中药多为两种以上药材配伍混合，经过自然发酵或接种真菌发酵 制得，制备工艺繁琐，成分复杂，在中草药研究中尚未深入考察。我们希望通过对淡豆豉的 研究，为发酵性中药的现代化和标准化研究提供思路和方法。
[作者简介]毛峻琴(1973-)，女(汉族)，硕士，现在解放军85医院药剂科.
[参 考 文 献]
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典.1995年版, 一部[M]. 广州：广东科技出版社，1995.289.
[2] Barnes S. Evolution of the health benefits of soy isoflavones[J]. Proc Soc Exp Biol Med,1998,217:386-392.
[收稿日期] 2000-04-03
[修回日期] 2000-07-18, http://www.100md.com
单位：毛峻琴(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；宓鹤鸣(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；娄子洋(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；柴逸峰(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)；杨根金(药物分析测试中心)；刘荔荔(药物分析测试中心)；邢旺兴(第二军医大学药学院药物分析教研室 ，上海 200433)
关键词：淡豆豉；色谱法，高效液相；异黄酮；化学
第二军医大学学报001017 [摘要]目的:探讨以HPLC法对淡豆豉中异 黄酮的定量分析。方法:采用HPLC法，YWGC18柱，以甲醇∶水∶ 乙酸(10∶10∶1)为流动相，检测波长260 nm, 测定淡豆豉中染料木素、大豆黄素含 量。结果：淡豆豉中游离染料木素含量为(230.64±9.14) μg/g 、大豆黄素含量为(264.26±4.22) μg/g；用盐酸水解处理后样品中染料木素总含量为(276 .00±7.81) μg/g，大豆黄素总含量为(287.65±5.70) μg/g。结论：用HPLC法测定淡豆豉中异黄酮类成分含量，建立的方法准确、简便，可用于控制和评价淡 豆豉的品质。
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[中图分类号] R 284.1 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0955-03
Detection of isoflavones contents in Seme sojae preparatum by HPLC
MAO Jun-Qin, MI He-Ming, LOU Zi-Yang， CHAI Yi-Feng，XING Wang-Xing
(Department of Pharmaceutical Ana lysis, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
YANG Gen- Jin，LIU Li-Li
, 百拇医药
(Pharmaceutical Analysis and Test Center)
[ABSTRACT] Objective: To provide evidence and method for eval uating the quality of Seme sojae preparatum (SSP). Methods: Contents of the isoflavones (genistein and daidzein) in SSP was measured by HPLC [ a column of YWGC18, methanol∶water∶acetic acid (10∶10∶1) as a mobi le phase, detective wave 260 nm]. Results: The content of genis tein was (230.64±9.14)μg/g and daidzein was (264.26±4.22) μg/g in SSP. The t otal contents of genistein and daidzein were (276.00±7.81) and (287.65±5. 70)μg/g respectively after hydrolysis by HCl. Conclusion: Deter mination of isoflavones in SSP by HPLC is acurate and conveniet. The results sho w that it is a suitable method for evaluating the quality of SSP.
, 百拇医药
[KEY WORDS] Seme sojae preparatum ； chromatography， high perfo rmance liquid; isoflavones; chemistry
淡豆豉是由豆科植物大豆[Glycine max(L.) Merr.]的成熟种子和青蒿、桑叶等中 药经发酵加工而成的制品,作为常用中药，历版《中国药典》均有记载。本品具有解表除烦 ，宣发郁热等功效，可用于感冒、寒热、头痛，烦躁、胸闷，虚烦不眠等症[1]。 然而，长期以来人们对淡豆豉缺乏深入研究，没有完善的质量控制标准,至今药典收载的方 法尚不能客观、有效地控制和评价淡豆豉的质量。为此，本文报告淡豆豉中异黄酮类成分的 HPLC法定量分析研究工作，旨在为淡豆豉的质量评价提供科学依据和方法。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 Waters高效液相色谱仪包括Waters 515泵，Waters 2487UV检测器，Rheodyne 7725I进样阀；Branson1200超声清洗器；旋转薄膜蒸发器。染料木素对 照品(Sigma公司，含量约为98%); 大豆黄素对照品(东北第六制药厂，含量约为95%) ；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸等均为分析纯。
, 百拇医药
1.2 色谱条件 色谱柱YWGC18，250 mm×4.5 mm, 10 μm (大连依利特公 司); 流动相为甲醇∶水∶乙酸(10∶10∶1)；检测波长260 nm；流速0.8 ml/min；灵敏度 0.01AUFS; 进样量20 μl。
1.3 样品制备 按照《中国药典》1995年版记载方法制备淡豆豉原料药。将自制 淡豆豉样品60℃干燥，粉碎，过60目筛。精密称取1 g，置具塞试管中，加入10 ml 80%乙醇 ，混匀，超声处理10 min, 离心5 min (3 000 r/min)，连续提取3次。合并提取液，减压蒸 干，80%乙醇定容，进样前用0.45 μm滤膜过滤。水解样品的制备是在样品中加入10 ml含有 2 mol/L盐酸的80%乙醇液，其余操作同上。黑色种皮品系大豆来源于东北地区，制备方法同 上。
1.4 提取和水解条件的选择
1.4.1 提取方法和溶剂的选择 超声连续提取3次的提取率与索氏提取率相近，并 省时，所以选择超声提取。选用不同浓度甲醇和乙醇作为提取溶剂，实验结果表明80%甲醇 和80%乙醇提取率相近，均较高；考虑到对人体的安全性，选择80%乙醇作为提取溶剂。
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1.4.2 水解条件选择 利用酸水解样品中的黄酮甙来测定染料木素总含量及大豆 黄素总含量。经用不同浓度的HCl试验, 结果显示2 mol/L HCl为最佳水解条件。
1.5 分析条件的选择 染料木素和大豆黄素结构相似，C18柱对其有良好的 选择性，所以选用C18柱。选择不同比例的甲醇、水、乙酸的混合溶剂洗脱，结果显 示用甲醇∶水∶乙酸(10∶10∶1)为最佳洗脱溶剂系统。
1.6 标准曲线的制备 精密称取各标准品，氯仿-甲醇(2∶1)溶解、定容。染 料木素80.00 μg/ml; 大豆黄素105.40 μg/ml,分别稀释1/2，1/5，1/10，1/20， 1/40五个浓度梯度。以峰面积Y和浓度X进行回归，线性回归方程分别为：
染料木素 Y=2 374.71X-789.46 (r=0.999 1)，浓度范围 2.00～40.00 μg/ml;
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大豆黄素 Y=1 438.66X-448.59 (r=0.999 3)，浓度范围 2.64～52.70 μg/ml。
1.7 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品粉末，加入一定量对照品，按1.9 项样品测定法进行测定，计算回收率。结果为直接提取法样品中染料木素回收率(87.15±5. 16)%，大豆黄素回收率(98.3±7.81)%；水解提取法样品中染料木素回收率(92. 31±6.36)%,大豆黄素回收率(97.46±8.23)% (n=5)。
1.8 精密度实验 将同一样品在1 d内重复进样5次，以计算日内标准差。同时， 将同一样品连续测定5 d，以计算日间标准差。结果表明，日内及日间标准差均小于3%，说 明本法比较稳定、重现性好。
1.9 样品测定 根据各种异黄酮成分的线性范围配制一定浓度的样品溶液，用外 标法对各成分的色谱峰的峰面积进行测定并换算实际含量。
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2 结 果
用上述建立的方法对淡豆豉和大豆(黑色种皮品系)中两种异黄酮成分染料木素和大豆黄 素的含量进行测定，并对样品经酸水解前后的测定结果进行比较。详细结果见表1，同时进 行3个批次样品测定。HPLC分离色谱图见图1。
表 1 淡豆豉和大豆中异黄酮的含量
Tab 1 Contents of isoflavones in
SSP and black bean(n=3,
±s，ρB/μg*ml-1) Sampl eGenistein
Daidzein
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Free
Hydrolysis
Free
Hydrolysis
Black bean
155.56±
383.06±
136.22±
410.45±
5.60
11.25
3.68
, 百拇医药
13.11
SSP
230.64±
276.00±
264.26±
287.65±
9.14
7.81
4.22
5.70
图 1 样品色谱图
, 百拇医药
Fig 1 Chromatogram of sample
A: Standard; B: Sample; 1. Daidzein; 2. Genistein
3 讨 论
淡豆豉为常用中药，是历版中国药典收载的品种，但至今未见其成分研究报道。淡豆豉由大 豆(一般用黑色种皮的品系)、青蒿和桑叶等药经发酵制备而成，处方中大豆用量最高。已 有的研究报道认为，制备淡豆豉的主要原料大豆中的异黄酮类物质为活性成分，具有抗肿瘤 、抗氧化等多方面功效[2]，其中主要包括染料木素、大豆黄素、鸡豆黄素A等。我 们以淡豆豉中染料木素和大豆黄素为指标，建立定量分析方法用于评价淡豆豉的质量，并与 原料黑大豆中相同成分进行比较获知：淡豆豉中游离染料木素含量比原料大豆中高48.3%， 大豆黄素含量比原料大豆高94%。结果提示淡豆豉经过发酵，受真菌、温度、湿度、酸度等 影响，其异黄酮甙元与糖发生解离，使游离甙元含量提高。通过酸水解使样品中甙键断裂， 可测得甙元总含量。实验结果显示，淡豆豉中染料木素、大豆黄素总含量低于原料大豆中的 含量，这可能是由于制备淡豆豉过程中煎煮、发酵等步骤使大豆黄酮类成分丢失或破坏所致 。
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本文建立的HPLC法对淡豆豉中异黄酮进行定量分析，方法的灵敏度高，重现性好，与我们 曾用薄层扫描法测定结果比较，HPLC法灵敏度明显提高。因此本法适用于淡豆豉药材的质量 检验。
象淡豆豉这样的发酵性中药多为两种以上药材配伍混合，经过自然发酵或接种真菌发酵 制得，制备工艺繁琐，成分复杂，在中草药研究中尚未深入考察。我们希望通过对淡豆豉的 研究，为发酵性中药的现代化和标准化研究提供思路和方法。
[作者简介]毛峻琴(1973-)，女(汉族)，硕士，现在解放军85医院药剂科.
[参 考 文 献]
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典.1995年版, 一部[M]. 广州：广东科技出版社，1995.289.
[2] Barnes S. Evolution of the health benefits of soy isoflavones[J]. Proc Soc Exp Biol Med,1998,217:386-392.
[收稿日期] 2000-04-03
[修回日期] 2000-07-18, http://www.100md.com