丹参酮ⅡA在兔体内脏的分布研究
作者：汪宝琪 庞志功 许育海
单位：西安医科大学药学院， 西安 710061
关键词：家兔内脏；胶束增敏荧光法；丹参酮ⅡA
沈阳药科大学学报990314摘 要 为了对丹参酮ⅡA在家兔内脏中的分布进行研究，在给家兔口服丹参酮液24 h之后，处死动物，采用胶束增敏荧光法，对主要脏器所含丹参酮ⅡA进行测定，所测心、肝、肾、肺的含量分别为2.26，4.03，3.03，1.69 μg/g.
分类号 R932.11；R911
A Study on Distribution of Tanshinone ⅡA in a Rabbit's Viscera
, http://www.100md.com
Wang Baoqi,Pang Zhigong,Xu Yuhai
College of Pharmacy,Xi′an Medical University,Xi′an 710061
Abstract In order to study the distribution of tanshinone ⅡA in a rabbit's viscera we made the rabbit take the tanshinone ⅡA solution first,then killed it after 24 hours.The tanshinone ⅡA in the main viscera was determined by highly sensitive micelle fluorometry.The contents of tanshinone ⅡA in the heart,liver,kindey and lungs were 2.26,4.03,3.03 and 1.69 μg/g，respectively.
, 百拇医药
Key words rabbit′s viscera;micelle sensitivity fluorometry;tanshinone ⅡA
丹参酮ⅡA为中药丹参的主要有效成分之一〔1〕.在基础药理实验中，常以此为活性代表物质进行研究，文献报道它具有活血化瘀、养血安神扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量和凝血降血脂的作用〔2〕.本文用胶束荧光法〔3〕，以十二烷基磺酸钠(SLS)为胶束试剂，在优化的实验条件下测定了给药24 h后，丹参酮ⅡA在兔体主要脏器中的分布.心脏含2.26 μg/g，肝脏含3.3 μg/g，肾脏含3.03 μg/g，肺脏含1.69 μg/g.在可信概率为3σ,最低检测下限为1.86×10-9 g/mL，平均回收率为97.48%.测定线性范围在2×10-8～8×10-7 g/mL，校正曲线方程Y=32.29+0.995C(C=1×10-8 g/mL)，相关系数r=0.996 8.
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1 实验方法
1.1 总丹参酮的提取
取丹参100 g粉碎成末，乙醚密封浸泡24 h，过滤乙醚液，浸泡两次，合并冷浸液，水浴上挥干乙醚，即得棕红色总丹参酮混合晶体.
1.2 脏器前处理
分别给体重约2.5 kg健康家兔灌胃总丹参酮60 mg，经24 h之后，处死动物，解剖分离出心、肝、肾、肺用生理盐水清洗脏器，擦干表面，称重记录，经匀浆得脏器组织液，将组织液离心(3 000 r/min)10 min,取上清液于离心管中，分别用乙醚提取，蒸干乙醚，用95%乙醇溶解提取物，用20 μL溶液点样于硅胶G-CMC-Na薄板上，用苯：乙酸乙酯(9∶1)为展开剂上行展开，并以标准品丹参酮ⅡA点样对照.在荧光灯下观察荧光斑点，并划圈标记.分别刮取与标准品Rf值相等的斑点于10 mL离心管中，用95%乙酮溶解，振荡、离心，取上清液1 mL待测.
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1.3 上机测定
取待测液1 mL于10 mL具塞容量瓶中，加入2 mL SLS溶液，1 mL KCl-NaOH缓冲液(pH=13)，快速振荡3 min定容至刻度，摇匀后于λex 360 nm,λem420 nm条件下测定荧光强度，并作随机校正曲线求取含量.
1.4 空白实验
取健康家兔一只，空腹24 h后，不给药立即处死动物，解剖，内脏按实验方法处理，将所得脏器组织液的上清液，同法点样、同样薄层分离，并在与标准品Rf值(Rf=0.74)相同的薄板处划圈标记，刮取薄板同法处理，同法上机测定，所得荧光强度IF=5.0，此值恰为本实验的本底值.说明本实验无内源物干扰荧光测定.
1.5 回收实验
取肝脏样品上清液2 mL(共4份)分别用乙醚提取后，按实验方法进行薄层分离，按标准加入法，分别加入2，3，4，5 μg的标准溶液，测定回收率分为113.5，91.3，90.8，96.48%，平均回收率为97.48%.
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1.6 日内差和日间差实验
取1 mL空白肾脏上清液，分别加入10 mL离心管中，再分别加入丹参酮ⅡA标准液，制备成0.02 μg/mL和0.04 μg/mL样品液，按日内每隔3 h测定一次，连续测定8次，日内差RSD=6.9%.按日间每隔24 h测定一次，连测5日，得日间差RSD=12%.
1.7 精密度实验
取空白肺脏上清液1 mL，加入丹参酮ⅡA标准液，制备成0.04 μg/mL的溶液，在荧光机上按实验方法连续测定11次，得RSD=1.55%，在可信概率为3σ的条件下，最低检测下限为1.86×10-9 g/mL.
2 实验结果
在平行实验条件下，用本实验方法，测得兔体脏器中所含丹参酮ⅡA如表1.
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3 讨论
3.1 实验条件的选择
Tab.1 Determination results of tanshinone
ⅡA′s content in rabbit′s viscera Rabbit No
Contents in viscera/μg.g-1
Heart
Liver
Kidney
Lung
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1
2.62
4.91
2.90
1.83
2
2.39
4.12
2.90
1.52
3
2.96
3.87
, 百拇医药
3.37
1.74
Average
2.66
4.30
3.03
1.69
丹参酮ⅡA经RF540型荧光分光光度计扫描，得λex为360 nm，λem为420 nm，加入SLS胶束试剂后无红移、紫移现象.经实验选用介质为pH13的KCl-NaOH缓冲溶液为宜；加入胶束试剂后振荡3 min合适；展开剂选用苯-乙酸乙酯(9∶1)为佳；薄板选用硅胶G-CMC-Na较为适宜.
3.2 对脏器含量的分析意见
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丹参酮ⅡA在脏器中的含量比给药24 h后血液中的含量(0.17 μg/mL)高一个数量级，与血药浓度达到高峰时的浓度(4.73 μg/mL)在同一数量级，这就表明丹参酮ⅡA比较容易进入各种脏器，并在脏器滞留时间较长，可能与它具有活血功能和扩张冠状动脉的功能有关.
丹参酮ⅡA在脏器中相对含量的比较提示，心、肝中含量较高，与药典〔4〕中收载的丹参归经于心、肝经相吻合.
参考文献
1 沙世炎.中草药有效成分分析法：上册.北京：人民卫生出版社，1985.64～65
2 郑国墀.丹参化学成分的研究概况.中国药学杂志，1989,24(1):6～7
3 庞志功，汪宝琪.胶束荧光的形成及在药物分析上的应用.西北药学杂志，1993,8(12):19～23
4 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：一部.北京：人民卫生出版社，1990.62～63
收稿日期:1999-01-25, 百拇医药
单位：西安医科大学药学院， 西安 710061
关键词：家兔内脏；胶束增敏荧光法；丹参酮ⅡA
沈阳药科大学学报990314摘 要 为了对丹参酮ⅡA在家兔内脏中的分布进行研究，在给家兔口服丹参酮液24 h之后，处死动物，采用胶束增敏荧光法，对主要脏器所含丹参酮ⅡA进行测定，所测心、肝、肾、肺的含量分别为2.26，4.03，3.03，1.69 μg/g.
分类号 R932.11；R911
A Study on Distribution of Tanshinone ⅡA in a Rabbit's Viscera
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Wang Baoqi,Pang Zhigong,Xu Yuhai
College of Pharmacy,Xi′an Medical University,Xi′an 710061
Abstract In order to study the distribution of tanshinone ⅡA in a rabbit's viscera we made the rabbit take the tanshinone ⅡA solution first,then killed it after 24 hours.The tanshinone ⅡA in the main viscera was determined by highly sensitive micelle fluorometry.The contents of tanshinone ⅡA in the heart,liver,kindey and lungs were 2.26,4.03,3.03 and 1.69 μg/g，respectively.
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Key words rabbit′s viscera;micelle sensitivity fluorometry;tanshinone ⅡA
丹参酮ⅡA为中药丹参的主要有效成分之一〔1〕.在基础药理实验中，常以此为活性代表物质进行研究，文献报道它具有活血化瘀、养血安神扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量和凝血降血脂的作用〔2〕.本文用胶束荧光法〔3〕，以十二烷基磺酸钠(SLS)为胶束试剂，在优化的实验条件下测定了给药24 h后，丹参酮ⅡA在兔体主要脏器中的分布.心脏含2.26 μg/g，肝脏含3.3 μg/g，肾脏含3.03 μg/g，肺脏含1.69 μg/g.在可信概率为3σ,最低检测下限为1.86×10-9 g/mL，平均回收率为97.48%.测定线性范围在2×10-8～8×10-7 g/mL，校正曲线方程Y=32.29+0.995C(C=1×10-8 g/mL)，相关系数r=0.996 8.
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1 实验方法
1.1 总丹参酮的提取
取丹参100 g粉碎成末，乙醚密封浸泡24 h，过滤乙醚液，浸泡两次，合并冷浸液，水浴上挥干乙醚，即得棕红色总丹参酮混合晶体.
1.2 脏器前处理
分别给体重约2.5 kg健康家兔灌胃总丹参酮60 mg，经24 h之后，处死动物，解剖分离出心、肝、肾、肺用生理盐水清洗脏器，擦干表面，称重记录，经匀浆得脏器组织液，将组织液离心(3 000 r/min)10 min,取上清液于离心管中，分别用乙醚提取，蒸干乙醚，用95%乙醇溶解提取物，用20 μL溶液点样于硅胶G-CMC-Na薄板上，用苯：乙酸乙酯(9∶1)为展开剂上行展开，并以标准品丹参酮ⅡA点样对照.在荧光灯下观察荧光斑点，并划圈标记.分别刮取与标准品Rf值相等的斑点于10 mL离心管中，用95%乙酮溶解，振荡、离心，取上清液1 mL待测.
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1.3 上机测定
取待测液1 mL于10 mL具塞容量瓶中，加入2 mL SLS溶液，1 mL KCl-NaOH缓冲液(pH=13)，快速振荡3 min定容至刻度，摇匀后于λex 360 nm,λem420 nm条件下测定荧光强度，并作随机校正曲线求取含量.
1.4 空白实验
取健康家兔一只，空腹24 h后，不给药立即处死动物，解剖，内脏按实验方法处理，将所得脏器组织液的上清液，同法点样、同样薄层分离，并在与标准品Rf值(Rf=0.74)相同的薄板处划圈标记，刮取薄板同法处理，同法上机测定，所得荧光强度IF=5.0，此值恰为本实验的本底值.说明本实验无内源物干扰荧光测定.
1.5 回收实验
取肝脏样品上清液2 mL(共4份)分别用乙醚提取后，按实验方法进行薄层分离，按标准加入法，分别加入2，3，4，5 μg的标准溶液，测定回收率分为113.5，91.3，90.8，96.48%，平均回收率为97.48%.
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1.6 日内差和日间差实验
取1 mL空白肾脏上清液，分别加入10 mL离心管中，再分别加入丹参酮ⅡA标准液，制备成0.02 μg/mL和0.04 μg/mL样品液，按日内每隔3 h测定一次，连续测定8次，日内差RSD=6.9%.按日间每隔24 h测定一次，连测5日，得日间差RSD=12%.
1.7 精密度实验
取空白肺脏上清液1 mL，加入丹参酮ⅡA标准液，制备成0.04 μg/mL的溶液，在荧光机上按实验方法连续测定11次，得RSD=1.55%，在可信概率为3σ的条件下，最低检测下限为1.86×10-9 g/mL.
2 实验结果
在平行实验条件下，用本实验方法，测得兔体脏器中所含丹参酮ⅡA如表1.
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3 讨论
3.1 实验条件的选择
Tab.1 Determination results of tanshinone
ⅡA′s content in rabbit′s viscera Rabbit No
Contents in viscera/μg.g-1
Heart
Liver
Kidney
Lung
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1
2.62
4.91
2.90
1.83
2
2.39
4.12
2.90
1.52
3
2.96
3.87
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3.37
1.74
Average
2.66
4.30
3.03
1.69
丹参酮ⅡA经RF540型荧光分光光度计扫描，得λex为360 nm，λem为420 nm，加入SLS胶束试剂后无红移、紫移现象.经实验选用介质为pH13的KCl-NaOH缓冲溶液为宜；加入胶束试剂后振荡3 min合适；展开剂选用苯-乙酸乙酯(9∶1)为佳；薄板选用硅胶G-CMC-Na较为适宜.
3.2 对脏器含量的分析意见
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丹参酮ⅡA在脏器中的含量比给药24 h后血液中的含量(0.17 μg/mL)高一个数量级，与血药浓度达到高峰时的浓度(4.73 μg/mL)在同一数量级，这就表明丹参酮ⅡA比较容易进入各种脏器，并在脏器滞留时间较长，可能与它具有活血功能和扩张冠状动脉的功能有关.
丹参酮ⅡA在脏器中相对含量的比较提示，心、肝中含量较高，与药典〔4〕中收载的丹参归经于心、肝经相吻合.
参考文献
1 沙世炎.中草药有效成分分析法：上册.北京：人民卫生出版社，1985.64～65
2 郑国墀.丹参化学成分的研究概况.中国药学杂志，1989,24(1):6～7
3 庞志功，汪宝琪.胶束荧光的形成及在药物分析上的应用.西北药学杂志，1993,8(12):19～23
4 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：一部.北京：人民卫生出版社，1990.62～63
收稿日期:1999-01-25, 百拇医药