胶体金标记法测定创伤性休克时PMNs表面LFA-1的表达将微生态学理论贯穿于口腔微生物的教学中
作者：王妍春 赵克森
单位：王妍春 510010 广州军区广州总医院肾内科；赵克森 第一军医大学病理生理教研室
关键词：创伤和损伤；粒细胞；膜糖蛋白
胶体金标记法测定创伤性休克时 PMNs表面LFA 【摘要】 目的 研究创伤性休克时多形核粒细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMNs)表面LFA-1的表达情况。方法 间接免疫胶体金标记法。结果 创伤后PMNs表面及细胞内胶体金颗粒数明显减少(P<0.01)。单位细胞体积所含有的金颗粒粒子数(个/μm3)，由正常对照组的324±19，减至创伤组的76±15。结论 在休克的发展中，白细胞表面LFA-1表达量可能不是介导白细胞与内皮细胞粘附的主要原因。
近来发现，粘附分子特别是整合蛋白家族的CD11/CD18类亚家族(包括LFA-1、Mac-1和P150，95)在白细胞粘附中作用特别活跃。用抗CD18的单克隆抗体60.3在失血性休克的实验证明，PMNs粘附性的升高在缺血和再灌注后的血管组织损伤中起着重要作用。而激活PMNs对内皮细胞的粘附由PMNs表面的CD18粘附受体复合物所介导[1，2]。我们用间接免疫胶体金标记法研究了创伤性休克时PMNs表面LFA-1的表达情况，报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
1 模型制备、病例选择和分组
创伤性休克组(n=4)全为重症车祸或凶器刺伤后8h以内，年龄25～35岁，未经任何治疗。入院时有休克征象，血压低、脉细弱、神志不清。入院后立即静脉取血3ml。正常对照组(n=4)为健康志愿者，年龄25～35岁，静脉取血5ml。
2 白细胞分离法
将肝素抗凝血用生理盐水等倍稀释，利用Ficoll-Hypague分离液(上海荣盛生物试剂厂、中科院上海细胞生物研究所合作生产)梯度离心法一次性分离PMNs。
3 免疫胶体金标记法[3]
细胞悬液(1×105细胞/ml)30μl加入96孔圆底培养板中，加入一抗(小鼠抗人LFA-1单克隆抗体，为中国军事医学科学院产品。)50μl， 阴性对照加入等量PBS，4℃放置30min。洗涤后上述样品均加入金标羊抗鼠二抗(中国军事医学科学院产品)30μl。
, 百拇医药
4 标记金颗粒的计数与计算
收集标记好的细胞并制成超薄切片。阴性对照细胞超薄切片行铀铅双重染色[4]。JEM-1200EX透射电子显微镜观察并照片，平均每例标本照片数不少于35张[5]；利用惠普彩色扫描仪(美国HP公司生产)人工计数每个细胞截面的胶体金颗粒数；用Quantimet 520型图像分析仪(Leica公司生产)测定细胞面积；以公式Nv＝Nx/Ac.t计算单位细胞体积中所含有的金颗粒粒子数[6]。
Nv 单位体积所含有的粒子数
Nx 细胞中所观察到的粒子数
Ac 细胞面积
t 切片厚度(本实验取其平均值为120nm)
, 百拇医药
结果表达与统计学处理。
实验数据以
±s表示。结果比较用Student,s t检验。
结 果
电镜观察发现创伤后PMNs表面及细胞内胶体金颗粒数明显减少(P<0.01)。单位细胞体积所含有的金颗粒粒子数(个/μm3)，由正常对照组的324±19，减至创伤组的76±15(见图1，照片1、2)。阴性对照细胞未见或偶见1～2个金颗粒(见照片3)。
病人存活50%。
, http://www.100md.com
图1 人创伤后PMNs表面LFA-1标记胶体金颗粒数(个/μm3)变化
照片1 正常对照组免疫金标记的PMNs
照片2 创伤休克组免疫金标记的PMNs(与照片1比可见细胞标记的胶体金颗粒数明显减少)
, 百拇医药
照片3 免疫金标记阴性对照PMNs(未见有金颗粒标记上)
讨 论
电镜观察发现创伤后PMNs表面LFA-1表达量降低。对其真正意义，至今未明。其发生机理有以下可能： (1) 可能分子结构发生了变化使LFA-1单克隆抗体不能识别。(2) 分子膜表达缺陷，可能是由于针对LFA-1的自身抗体的存在。(3) 淋巴因子使LFA-1表达下降。(4) 有人还提出与LFA-1的先天性缺陷或病毒基因组在淋巴细胞里的掺入使合成缺陷有关[7～9]。提示在休克的发展中，白细胞表面LFA-1表达量可能不是介导白细胞与内皮细胞粘附的主要原因。
参考文献
1 Walsh CJ，Carey PD，Cook DJ，et al.Anti-CD18 antibody attenuates neutropenia and alveolar capillary-membrane injury during gram-negative sepsis.Surgery.1991，110(2)：205，discussion 211
, 百拇医药
2 Vedder NB，Fouty BW，Winn RK.Role of neutrophils in generalized reperfussion injury associated with resuscitation from shock.Surgery.1989，106(3)：509
3 刘连璞，罗深秋.免疫电镜细胞化学技术(研究生补充讲义).广州： 第一军医大学印刷室.1992，20～22
4 [日]小川和郎，中根一穗主编.朴英杰，等翻译.组织细胞化学技术.广州： 中山大学出版社.1991，6～7
5 郑福盛.细胞形态立体计量学.北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1990，26～28
6 申洪，沈忠英.实用生物体视学技术.广州： 中山大学出版社.1991，99～100
, 百拇医药
7 Springer TA，Thompson WS，Miller LJ，et al.Inherited deficiency of the Mac-1，LFA-1，P150，95 glycoprotein family and its molecular basis.J Exp Med.1984，160：1901
8 Joasso A.Viral antibodies and thyroyoxicosis.Lancet.1975，2：125
9 Suenaga K，Yoon JW.Association of β-cell-specific expression of endogenous retrovirus with development of insulitis and diabetes in NOD mouse.Diabetes.1988，37：1722
收稿： 1998-09-07
中国微生态学杂志 2000年第3期第12卷 综 述
将微生态学理论贯穿于口腔微生物的教学中
作者：盛红华 刘洋
单位：上海铁道大学医学院 微生物教研室，上海 200331
关键词：, 百拇医药
单位：王妍春 510010 广州军区广州总医院肾内科；赵克森 第一军医大学病理生理教研室
关键词：创伤和损伤；粒细胞；膜糖蛋白
胶体金标记法测定创伤性休克时 PMNs表面LFA 【摘要】 目的 研究创伤性休克时多形核粒细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMNs)表面LFA-1的表达情况。方法 间接免疫胶体金标记法。结果 创伤后PMNs表面及细胞内胶体金颗粒数明显减少(P<0.01)。单位细胞体积所含有的金颗粒粒子数(个/μm3)，由正常对照组的324±19，减至创伤组的76±15。结论 在休克的发展中，白细胞表面LFA-1表达量可能不是介导白细胞与内皮细胞粘附的主要原因。
近来发现，粘附分子特别是整合蛋白家族的CD11/CD18类亚家族(包括LFA-1、Mac-1和P150，95)在白细胞粘附中作用特别活跃。用抗CD18的单克隆抗体60.3在失血性休克的实验证明，PMNs粘附性的升高在缺血和再灌注后的血管组织损伤中起着重要作用。而激活PMNs对内皮细胞的粘附由PMNs表面的CD18粘附受体复合物所介导[1，2]。我们用间接免疫胶体金标记法研究了创伤性休克时PMNs表面LFA-1的表达情况，报告如下。
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材料和方法
1 模型制备、病例选择和分组
创伤性休克组(n=4)全为重症车祸或凶器刺伤后8h以内，年龄25～35岁，未经任何治疗。入院时有休克征象，血压低、脉细弱、神志不清。入院后立即静脉取血3ml。正常对照组(n=4)为健康志愿者，年龄25～35岁，静脉取血5ml。
2 白细胞分离法
将肝素抗凝血用生理盐水等倍稀释，利用Ficoll-Hypague分离液(上海荣盛生物试剂厂、中科院上海细胞生物研究所合作生产)梯度离心法一次性分离PMNs。
3 免疫胶体金标记法[3]
细胞悬液(1×105细胞/ml)30μl加入96孔圆底培养板中，加入一抗(小鼠抗人LFA-1单克隆抗体，为中国军事医学科学院产品。)50μl， 阴性对照加入等量PBS，4℃放置30min。洗涤后上述样品均加入金标羊抗鼠二抗(中国军事医学科学院产品)30μl。
, 百拇医药
4 标记金颗粒的计数与计算
收集标记好的细胞并制成超薄切片。阴性对照细胞超薄切片行铀铅双重染色[4]。JEM-1200EX透射电子显微镜观察并照片，平均每例标本照片数不少于35张[5]；利用惠普彩色扫描仪(美国HP公司生产)人工计数每个细胞截面的胶体金颗粒数；用Quantimet 520型图像分析仪(Leica公司生产)测定细胞面积；以公式Nv＝Nx/Ac.t计算单位细胞体积中所含有的金颗粒粒子数[6]。
Nv 单位体积所含有的粒子数
Nx 细胞中所观察到的粒子数
Ac 细胞面积
t 切片厚度(本实验取其平均值为120nm)
, 百拇医药
结果表达与统计学处理。
实验数据以
±s表示。结果比较用Student,s t检验。结 果
电镜观察发现创伤后PMNs表面及细胞内胶体金颗粒数明显减少(P<0.01)。单位细胞体积所含有的金颗粒粒子数(个/μm3)，由正常对照组的324±19，减至创伤组的76±15(见图1，照片1、2)。阴性对照细胞未见或偶见1～2个金颗粒(见照片3)。
病人存活50%。
, http://www.100md.com
图1 人创伤后PMNs表面LFA-1标记胶体金颗粒数(个/μm3)变化
照片1 正常对照组免疫金标记的PMNs
照片2 创伤休克组免疫金标记的PMNs(与照片1比可见细胞标记的胶体金颗粒数明显减少)
, 百拇医药
照片3 免疫金标记阴性对照PMNs(未见有金颗粒标记上)
讨 论
电镜观察发现创伤后PMNs表面LFA-1表达量降低。对其真正意义，至今未明。其发生机理有以下可能： (1) 可能分子结构发生了变化使LFA-1单克隆抗体不能识别。(2) 分子膜表达缺陷，可能是由于针对LFA-1的自身抗体的存在。(3) 淋巴因子使LFA-1表达下降。(4) 有人还提出与LFA-1的先天性缺陷或病毒基因组在淋巴细胞里的掺入使合成缺陷有关[7～9]。提示在休克的发展中，白细胞表面LFA-1表达量可能不是介导白细胞与内皮细胞粘附的主要原因。
参考文献
1 Walsh CJ，Carey PD，Cook DJ，et al.Anti-CD18 antibody attenuates neutropenia and alveolar capillary-membrane injury during gram-negative sepsis.Surgery.1991，110(2)：205，discussion 211
, 百拇医药
2 Vedder NB，Fouty BW，Winn RK.Role of neutrophils in generalized reperfussion injury associated with resuscitation from shock.Surgery.1989，106(3)：509
3 刘连璞，罗深秋.免疫电镜细胞化学技术(研究生补充讲义).广州： 第一军医大学印刷室.1992，20～22
4 [日]小川和郎，中根一穗主编.朴英杰，等翻译.组织细胞化学技术.广州： 中山大学出版社.1991，6～7
5 郑福盛.细胞形态立体计量学.北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1990，26～28
6 申洪，沈忠英.实用生物体视学技术.广州： 中山大学出版社.1991，99～100
, 百拇医药
7 Springer TA，Thompson WS，Miller LJ，et al.Inherited deficiency of the Mac-1，LFA-1，P150，95 glycoprotein family and its molecular basis.J Exp Med.1984，160：1901
8 Joasso A.Viral antibodies and thyroyoxicosis.Lancet.1975，2：125
9 Suenaga K，Yoon JW.Association of β-cell-specific expression of endogenous retrovirus with development of insulitis and diabetes in NOD mouse.Diabetes.1988，37：1722
收稿： 1998-09-07
中国微生态学杂志 2000年第3期第12卷 综 述
将微生态学理论贯穿于口腔微生物的教学中
作者：盛红华 刘洋
单位：上海铁道大学医学院 微生物教研室，上海 200331
关键词：, 百拇医药