基因工程免疫毒素抗肿瘤研究进展
作者：王雄彪 张红宇 徐永华
单位：王雄彪(上海第二军医大学长海医院呼吸内科 上海 200433)；张红宇 徐永华(中国科学院上海细胞生物学研究所)
关键词：免疫毒素类；肿瘤
肿瘤000621
中图分类号：R730.51 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0453-04
对肿瘤的特异性治疗一直是医学工作者的梦想。80年代，有人将一些毒素蛋白偶联到与肿瘤细胞有亲和结合的抗体上，产生了第一代的免疫毒素(Immunotoxin)。免疫毒素的免疫原性和毒性，推动了免疫毒素从两个方面进行改造：弹头和毒素。弹头主要是抗体，包括肿瘤细胞表面过度表达的生长因子受体的配体。由于近年基因技术的突破，免疫毒素在肿瘤治疗领域展现了美好的前景。
, 百拇医药
一、对抗体的研究
近年来PCR技术的发展大大简化了获取抗体可变区基因的过程，用5′端前导顺序或框架区引物及3′端恒定区域V基因中的J区引物，可以从很少量的细胞中扩增得到抗体的可变区片段，PCR产物能直接克隆到表达载体上。通常针对不同的VH和VL家族采用不同的引物。
1.单链抗体
Fv片段是指成对的VH和VL构域。人工表达的Fv片段还保留原有的抗原结合能力[1]，但VH和VL仅由相对较弱的非极性键连在一起，因此在低浓度时有些Fv片段就解离了。进一步的改进就是将VH和VL用一个小肽(Linker)连起来，即单链抗体(Single Chain Fv,scFv)[2]。
, 百拇医药
单链抗体的关键是Linker序列，Linker必须能使轻、重链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型。同时，Linker尽可能减少受到蛋白酶的攻击，并防止单链抗体的聚集。Linker长度以14～25个氨基酸残基为适，目前最常用的Linker序列是由Huston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构和计算机辅助分析结果设计的，具刚性结构的15肽序列(Gly4Ser)3。
单链抗体保留了原有单价Fab的抗原结合能力。由于分子量比较小(25 kD)，有利于穿过血管组织定位于肿瘤，但是许多抗原抗体的相互作用涉及结合部位，从而限制了单价scFv的应用。进一步改进是将两个scFv联在一起组成双scFv片段以增加其亲和力。
2.dsFv和pFv
尽管scFv能满足大部分Fv的稳定性，有时scFv单价结合位点结构干扰了其与抗原的结合，Linker结构会破坏scFc的正确重叠。因此，在scFv基础上又增添了两种形式disulfide stabilize Fvs(dsFvs)、permutated Fvs (pFvs)。引入亮氨酸拉链、半胱氨酸及α-螺旋等结构，可用于构建双价单链抗体分子(dsFv)。dsFv在37℃很稳定，具有很强的选择性杀伤细胞毒活性[3]。动物实验也证明dsFv疗效优于scFv。VH和VL的三维图象显示CDRs(Complementarity Determining Regions)在分子顶部，3-3b的β折叠区(base loops)位于分子的底部，将VH和VL各自base loops切开、交叉连接，也就构成了更为稳定的pFv[4]。anti-Tac pFv与anti-Tac scFv有相似的结合活性和全部的特异性，稳定性更强，在人血清中37℃ 24 h后仍能维持25%的结合活性。
, 百拇医药
3.具有完整抗体结构的人-鼠工程抗体
(1)嵌合抗体(Chimeric Antibody)：嵌合抗体的C区是人源的，同时具有抗原结合能力以及Fc的效应，可以根据所要求的抗体效应功能选择人重链各亚类的C区基因。对用于杀伤细胞的抗体通常选用IgG1的C区，因为其Fc能够结合巨噬细胞、多形核白细胞等的Fc受体上，包括FcR1、FcR2、FcR3，从而介导ADCC和补体激活的杀伤效应，例如人-鼠IgG1嵌合抗体已被证明能介导针对肿瘤细胞的单核细胞和淋巴细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒性[5]。如抗体仅用于激活等，则通常采用人IgG2或IgG4的C区。
(2)重构抗体(Reshaped Antibody)：将特异抗体的CDRs移植到另一个抗体的可变区框架上，这种仅拥有鼠源CDRs的人抗体分子几乎可以说是人源的，称人化抗体(Humanized Antibody)[6]。框架区的某些氨基酸也参与了CDRs环的组成，因此一种是根据已知的人抗体序列，选取与供体鼠抗体框架区同源性最高的人抗体分子作构建重构抗体的基础。VH和VL的框架区不必来源于同一抗体分子。另一种是根据已知的X光衍射结构选取人的框架区，再根据植入特异抗体CDRs的结构来修饰人供体的框架区。
, 百拇医药
4.人源抗体、抗体库、分泌人抗体的小鼠
抗体库(Antibody Library)[7]基本原理就是将各种B细胞的轻、重链V基因分离出来组成轻、重链V基因库，通过随机配对组装入载体，从而组成巨大的抗体组合基因文库(Recombinatorial Antibody Gene Library)。但是，体内抗体与抗原的结合力是在逐次免疫后提高的，即亲和力成熟现象(Affinity Maturation)[8]。在生发中心，经抗原刺激后的B细胞，其抗体V基因发生大量体细胞突变(Somatic mutation)，结合抗原筛选和细胞凋亡的机制，从中选择出能生成抗原特异的高亲和力抗体的B细胞。在人体就要考虑定点突变的方式。
如果将人免疫球蛋白基因组替代小鼠的，并进行正常的B细胞发育，包括重排，则在免疫后能诱发V基因的高突变，选择并扩增产生高亲和力抗体的B细胞，那将得到有特异结合能力和各种效应的完整人单抗[9]。
, 百拇医药
上述各种基因工程抗体，目的是有较强的亲和性，尽量少的鼠源性。应用基因工程技术改造现有的具有优良特异性和亲和力的鼠类抗体，仍是现有最实际的方法，有很多已进入临床使用。
作为免疫毒素的靶子须有下列条件，第一是肿瘤抗原的特异性，最理想是肿瘤的特异抗原，进而制备抗体，但目前大多数是肿瘤相关抗原，具有相对特异性，属于胚胎性抗原较多；另一类是生长因子受体，如EGF、IL-2的受体在某些肿瘤细胞过度表达[10，11]。其二是靶抗原不能以脱落形式存在，主要存在于细胞表面，以免可溶性抗原与免疫毒素竞争结合。其三，抗原抗体结合后抗原能够被“内吞”，使毒素分子转运入细胞内，产生杀伤作用[12]，符合这三个条件，才能成为免疫毒素的靶子。
某些生长因子受体在肿瘤细胞表面过度表达，其配体可发挥类似抗体的功能。EGF受体的配体TGF-α与PE40、PE38构成的免疫毒素对肿瘤细胞有明显的特异杀伤活性，TGF-α-PE38抑制非小细胞肺癌(NSCLC)克隆形成的LD50为0.002～0.1 ng/ml[13]。
, 百拇医药
二、对毒素的研究
1.超抗原(Superantigen)直接与MHC-Ⅱ类分子结合形成配体，通过该配体与T细胞受体(TCR)的Vβ结合来激活T细胞的抗原分子，具有极高的T细胞激活频率，与基因工程抗体融合后不再依赖MHC-Ⅱ类分子，可发挥强有力的细胞毒活性，超抗原的研究对象目前主要是葡萄球菌肠毒素(SEA)。在鼠体内取得了疗效[14]。
2.核糖体延伸因子-2抑制剂：1.植物类核糖体失活蛋白(RIPs)，阻断28s rRNA的4324位腺嘌呤的N糖苷键。又分为两型，Ⅰ型RIPSs如BD1只有酶活性结构，没有结合区。从葫芦科植物Bryonia泻根提取的BD1，其重组合成肽为267个氨基酸。Francisco JA用烟草细胞表达系统不仅表达成功有活性BD1，而且成功表达有特异结合活性和杀伤活性的融合蛋白抗体ntBD1-G28-5 scFv[15]。Ⅱ型RIPs包括蓖麻毒蛋白(Ricin)，即有酶活性区，又有结合区。Ricin的A链结合的anti-CD7-dgA治疗T细胞淋巴瘤和白血病患者，最大的耐受剂量MTD每天达0.2 mg/kg[16]。2.细菌毒素类，包括：①白喉毒素及衍生物(Diphtheria toxin,DT)[17] DT分子量60 kD,A链发挥酶活性，B区具有细胞结合活性，结合活性主要在羧基末端；同时有介导A区内吞转移的作用。将B区去除或点突变，可以制备一系列DT衍生物，去除了正常细胞的结合活性，保留了转位和ADP核糖基化活性。这类DT非常特异，对正常细胞低毒。②绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin, PE)[18] PE是66 kD的单链蛋白，氨基末端1-252个氨基酸构成Ⅰa区，为细胞结合结构域。Ⅰb 365～404，是介于Ⅱ与Ⅲ区之间的小分子，功能不清楚，但去除后不影响毒素活性。第253～264氨基酸组成Ⅱ区，负责毒素的转位。Ⅲ区，405～613，具有ADP核糖基化活性。PE及衍生物到达细胞，在受体或抗体受体介导下内吞，在胞内蛋白水解酶的作用下，Ⅰ、Ⅱ区被去除，Ⅲ区转移入内质网，再转移至胞质。
, 百拇医药
将PE分子的Ⅰa去除，则产生了PE40，用PE40和其它一些配体，如生长因子或抗体相连接，即重组免疫毒素，能够强烈杀伤受体细胞。然而此类免疫毒素在使用过程中，有体内半衰期短，实体瘤穿透率低，及免疫毒素本身的毒副作用，因此，试图通过PE分子的突变来得到改善。目前有以下几种突变体[19]：(1)PE38，是在PE40基础上进一步除去非特异结构域(第365～380)氨基酸，减少了PE分子上的一个二硫键。(2)PE38 KDEL，是将PE分子的羧基端REDLK置换成KDEL，其活性可提高6～10倍。(3)PE35，其转化结构域上的部分氨基酸进一步被去除(253-279位)，使得分子中的二硫键均被删除，而活性不受影响。通过45例应用PE38免疫毒素临床观察，所产生抗体的主要抗原表位位于PE分子中的274-283、470-492、531-540、555-564、596-609，这将有利于对PE38的基因改造，降低免疫原性[20]。
荷瘤裸鼠实验表明，免疫毒素的疗效与使用方法有关，隔两天注射共5次最为有效。在SCID(Severe combined immunodeficient)鼠、大鼠、猴，G28-5 scFv-PE40的最大耐受剂量分别为0.48、1.0、1.67 mg/kg[21]。局部应用免疫毒素疗效优于全身应用[22]。
, 百拇医药
3.其它
(1)蜂毒肽(Melittin)，分子量小，仅26肽，作用机制是直接溶解细胞膜，不需膜内吞，具有很强的杀伤活性[23]。
(2)牛精液RNase[24]，免疫原性低，具有明显的抗肿瘤活性和低免疫原性。
(3)化疗药物活化剂，如scFv携带β-内酰胺酶至肿瘤部位，可转化低毒性的马法兰前体C-Mel为马法兰，在局部发挥作用[25]。
尽管免疫毒素采用这些毒素的衍生物，减少了非特异结合，但仍存在着剂量依赖的非特异或特异对正常细胞的损害。尤其半衰期短的免疫毒素，对血管内皮细胞有较明显的损害，造成血管渗漏综合症(Vascular Leak Syndrome)，PE衍生物往往造成肝损害。另一方面，免疫毒素的毒素部分往往是高免疫原性的。因而免疫原性限制了免疫毒素的反复应用。肿瘤病人治疗往往合并使用化疗药，使得机体的免疫力低下，同时应用免疫抑制剂，也能降低免疫反应[26，27]。
, 百拇医药
4.许多化合物和生物因子能明显提高免疫毒素的生物活性[28]。
趋溶酶体的胺类物质氯化铵和氯喹，能升高含有免疫毒素交联物的溶酶体pH值，促进免疫毒素从溶酶体释放至细胞质。羧基离子载体monensin能影响高尔基体的囊泡化，有利于交联物的转运，提高免疫毒素的杀伤活性。钙离子通道拮抗剂Verapamil perherxiline β-肾上腺素封闭物、细胞因子(如干扰素)、抗生素(如道诺霉素)、免疫抑制剂(如环孢霉素A)等均可通过不同机制来提高免疫毒素的生物活性。
三、免疫毒素研究发展和前景
近来，另一种形式的基因工程免疫毒素(Genetic Immunotoxin)和胞内抗体(Intracellular antibody)弥补了抗原相对特异的不足和降低了抗体的免疫原性[29]。基因工程免疫毒素是毒素分子以质粒形式进入体内，即将毒素基因接入表达质粒，质粒与scFv通过碱性的鱼精蛋白相互连接，由scFv引导至靶细胞，毒素在胞内的表达可预先设计成受控于可诱导的或靶细胞特异性启动子。这种基因工程抗体可以更有选择性地到达靶细胞。胞内抗体以mRNA形式到达靶细胞，翻译成抗体，使某些癌基因蛋白失活。抗体基因可由逆转录病毒、腺病毒等载体转移到靶细胞，以这种方式运输的抗体免疫原性极低，是一种新形式抗体基因治疗。
, http://www.100md.com
近年来，针对肿瘤的免疫毒素治疗研究掀起了一个高潮，这得益于基因工程的发展和对毒素了解的深入。1996年召开的第四届免疫毒素讨论会，总结了其研究进展和临床使用情况。由于基因工程抗体免疫毒素、重组免疫毒素是近年发展起来的，动物实验报道多、疗效好、可使荷瘤小鼠完全治愈，副作用低，而鼠抗体和毒素分子化学交连的免疫毒素在临床应用有了初步的总结[30]。尽管毒素与化疗相似或更低，但肿瘤穿透性差，高免疫原性、血管渗漏综合征出现率高，是目前的主要问题。
基因工程免疫毒素由于具有高特异性，高细胞毒活性，无疑是肿瘤治疗的主要方面。可以预料，免疫原性等问题，在理论和实践上均能在短期内获得突破，通过严格的体外和动物体内试验，将逐步走向临床。
王雄彪，男，医学博士，主治医师。
参考文献
[1]King DJ, Byron OD, Mountain A, et al. Expression ,purification and characterization of B72.3 Fv fragments〔J〕. Biochem J,1993,290(Pt 3):723
, 百拇医药
[2]Huston JS, Levinson D, Mudget-Hunter M, et al. Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produce in E.coli〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:5879
[3]Mansfield E, Amlot P, Pastan I, et al. Recombinant RFB4 immunotoxins exhibit potent cytotoxic acitivity for CD22-bearing cells and tumors〔J〕. Blood,1997,90(5):2020
[4]Brinkmann U, Di Carlo A, Vasmatzis G, et al. Stabilization of a recombinant Fv fragment by base-loop interconnection and V(H)-V(L) permutation〔J〕. J Mol Biol,1997,268(1):107
, http://www.100md.com
[5]LoBuglio AF, Wheeler RH, Trang J, et al. Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man:kinetics and immune response〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(11):4220
[6]Baker TS,Begent HJ, Dweji MR ,et al. Charaterization of th antibody response in patients undergoing radioimmunotherapy with chimeric B72.3. Antibody immunoconjugates, and radiopharmaceuticals〔J〕.1991,4(4):799
[7]Mao S, Gao C, Lo CH, et al. Phage-display libray selection of high-affinity human single-chain antibodies to tumor-associated carbohydrate antigens sialyl Lewisx and Lewisx〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(12):6953
, 百拇医药
[8]Hwakins RE, Russell SJ, Winter G. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation〔J〕. J Mol Biol,1992,226(3):889
[9]Yang XD, Jia XC, Corvalan JR, et al. Eradication of established tumors by a fully human monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor without concomitant chemotherapy〔J〕. Cancer Res,1999,59(6):1236
[10]Schmidt M, Reiser P, Hills D, et al. Expression of an oncogenic mutant EGF receptor markedly increases the sensitivity of cells to an EGF-receptor-specific antibody-toxin〔J〕. Int J Cancer,1998,75(6):878
, 百拇医药
[11]Waldmann TA. The interleukin-2 receptor on malignant cells:a target for disgnosis and therapy〔J〕. Cell Immunol,1986,99(1):53
[12]Olsnes S, Sandvig K. How protein toxins enter and kill cells〔J〕. Cancer Treat Res,1988,37:39
[13]Draoui M, Siegall CB, Fitz Gerald DF,et al. TGFα-PE40 inhibits non-small cell lung cancer growth〔J〕. Life Sciences,1994,54(7):445
[14]Rosendahl A,Kristensson K, Hansson J, et al. Repeated treatment with antibody-targeted superantigens strongly inhibits tumor growth〔J〕. Int J Cancer,1998,76:274
, 百拇医药
[15]Francisco JA, Gawlak SL, Miller M, et al. Experssion and characterization of bryodin 1 and a bryodin 1-based single-chain immunotoxin from tobacco cell culture〔J〕. Bioconjug Chem,1997,8(5):708
[16]Frankel AE, Laver JH,Willingham MC, et al. Therapy of patients with T-cell lymphomas and leukemias using an anti-CD7 monoclonal antibody-ricin A chain immunotoxin〔J〕. Leuk Lymphoma,1997,26(3-4)：287
[17]Li BY, Ramakrishnan S.Recombinant hybrid toxin with dual enzymatic activities. Potential use in preparing highly effective immunotoxins〔J〕. J Biol Chem,1994,269(4):2652
, http://www.100md.com
[18]Pastan I, Fitz Gerald D. Pesudomonoas exotoxin:chimeric toxins〔J〕. J Biol Chem,1989,264(26):15157
[19]Mansfield E, Pastan I, Fitz Gerald DJ. Characterization of RFB4-Pseudomonas exotoxin A immunotoxins targeted to CD22 on B-cell malignancies〔J〕. Bioconjug Chem,1996,7(5):557
[20]Roscoe DM, Pai LH, Pastan I.Identification of epitopes on a mutant from of pseudomonas exotoxin using serum form humans treated with pseudomoas exotoxin containing immunotoxins〔J〕. Eur J Immunol,1997,27(6):1459
, http://www.100md.com
[21]Francisco JA, Schreiber GJ, Comereski CR, et al. In vivo efficacy and toxicity of a single-chain immunotoxin targeted to CD40〔J〕. Blood,1997,89(12):4493
[22]Altenschmidt U, Schmidt M, Groner B, et al. Targeted therapy of schwannoma cells in immunocompetent rats with an erbB2-specific antibody-toxin〔J〕. Int J Cancer,1997,73(1):117
[23]Dunn RD, Weston KM, Longhurst TJ, et al. Antigen binding and cytotoxic properties of a recombinant immunotoxin incorporating the lytic peptide, melittin〔J〕. Immunotechnology,1996,2(3):229
, 百拇医药
[24]Deonarain MP, Epenetos AA. Design, characterization and anti-tumor cytotoxicity of a panel of recombinant,mammalian ribonuclease-based immunotoxins〔J〕. Br J Cancer,1998,77(4):537
[25]Kerr DE, Li Z, Siemers NO, et al. Developement and activities of a new melphalan prodrug designed for tumor-selective activation〔J〕. Bioconjug Chem,1998,9(2):225
[26]Vitetta ES, Stone M, Amlot P, et al. Phase I immunotoxin trial in patients with B-cell lymphoma〔J〕. Cancer Res,1991,51(15):4052
, http://www.100md.com
[27]Pai LH FitzGerald DJ, Tepper M, et al. inhibition of antibody response to pseudomonas exotoxin and an immunotoxin containing pseudomonas exotoxin by 15-deoxyspergualin in mice〔J〕. Cancer Res,1990,50(24):7750
[28]Wu M. Enhancement of immunotoxin activity using chemical and biologcial reagents〔J〕. Br J Cancer,1997,75(9):1347
[29]Maxwell IH, Glode LM, Maxwell F. Expression of the diphtheria toxin A-chain coding sequence under the control of promoters and enhancers from immunoglobulin genes as a means of directing toxicity to B-lymphoid cells〔J〕. Cancer Res,1991,51(16):4299
[30]Li BY,Ramakrishnan S. Recombinant hybrid toxin with dual enzymatic activities. potential use in preparing highly effective immunotoxins〔J〕. J Biol Chem,1994,269(4):2652
(收稿日期：1999-05-31；修回日期：2000-05-23), http://www.100md.com
单位：王雄彪(上海第二军医大学长海医院呼吸内科 上海 200433)；张红宇 徐永华(中国科学院上海细胞生物学研究所)
关键词：免疫毒素类；肿瘤
肿瘤000621
中图分类号：R730.51 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0453-04
对肿瘤的特异性治疗一直是医学工作者的梦想。80年代，有人将一些毒素蛋白偶联到与肿瘤细胞有亲和结合的抗体上，产生了第一代的免疫毒素(Immunotoxin)。免疫毒素的免疫原性和毒性，推动了免疫毒素从两个方面进行改造：弹头和毒素。弹头主要是抗体，包括肿瘤细胞表面过度表达的生长因子受体的配体。由于近年基因技术的突破，免疫毒素在肿瘤治疗领域展现了美好的前景。
, 百拇医药
一、对抗体的研究
近年来PCR技术的发展大大简化了获取抗体可变区基因的过程，用5′端前导顺序或框架区引物及3′端恒定区域V基因中的J区引物，可以从很少量的细胞中扩增得到抗体的可变区片段，PCR产物能直接克隆到表达载体上。通常针对不同的VH和VL家族采用不同的引物。
1.单链抗体
Fv片段是指成对的VH和VL构域。人工表达的Fv片段还保留原有的抗原结合能力[1]，但VH和VL仅由相对较弱的非极性键连在一起，因此在低浓度时有些Fv片段就解离了。进一步的改进就是将VH和VL用一个小肽(Linker)连起来，即单链抗体(Single Chain Fv,scFv)[2]。
, 百拇医药
单链抗体的关键是Linker序列，Linker必须能使轻、重链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型。同时，Linker尽可能减少受到蛋白酶的攻击，并防止单链抗体的聚集。Linker长度以14～25个氨基酸残基为适，目前最常用的Linker序列是由Huston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构和计算机辅助分析结果设计的，具刚性结构的15肽序列(Gly4Ser)3。
单链抗体保留了原有单价Fab的抗原结合能力。由于分子量比较小(25 kD)，有利于穿过血管组织定位于肿瘤，但是许多抗原抗体的相互作用涉及结合部位，从而限制了单价scFv的应用。进一步改进是将两个scFv联在一起组成双scFv片段以增加其亲和力。
2.dsFv和pFv
尽管scFv能满足大部分Fv的稳定性，有时scFv单价结合位点结构干扰了其与抗原的结合，Linker结构会破坏scFc的正确重叠。因此，在scFv基础上又增添了两种形式disulfide stabilize Fvs(dsFvs)、permutated Fvs (pFvs)。引入亮氨酸拉链、半胱氨酸及α-螺旋等结构，可用于构建双价单链抗体分子(dsFv)。dsFv在37℃很稳定，具有很强的选择性杀伤细胞毒活性[3]。动物实验也证明dsFv疗效优于scFv。VH和VL的三维图象显示CDRs(Complementarity Determining Regions)在分子顶部，3-3b的β折叠区(base loops)位于分子的底部，将VH和VL各自base loops切开、交叉连接，也就构成了更为稳定的pFv[4]。anti-Tac pFv与anti-Tac scFv有相似的结合活性和全部的特异性，稳定性更强，在人血清中37℃ 24 h后仍能维持25%的结合活性。
, 百拇医药
3.具有完整抗体结构的人-鼠工程抗体
(1)嵌合抗体(Chimeric Antibody)：嵌合抗体的C区是人源的，同时具有抗原结合能力以及Fc的效应，可以根据所要求的抗体效应功能选择人重链各亚类的C区基因。对用于杀伤细胞的抗体通常选用IgG1的C区，因为其Fc能够结合巨噬细胞、多形核白细胞等的Fc受体上，包括FcR1、FcR2、FcR3，从而介导ADCC和补体激活的杀伤效应，例如人-鼠IgG1嵌合抗体已被证明能介导针对肿瘤细胞的单核细胞和淋巴细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒性[5]。如抗体仅用于激活等，则通常采用人IgG2或IgG4的C区。
(2)重构抗体(Reshaped Antibody)：将特异抗体的CDRs移植到另一个抗体的可变区框架上，这种仅拥有鼠源CDRs的人抗体分子几乎可以说是人源的，称人化抗体(Humanized Antibody)[6]。框架区的某些氨基酸也参与了CDRs环的组成，因此一种是根据已知的人抗体序列，选取与供体鼠抗体框架区同源性最高的人抗体分子作构建重构抗体的基础。VH和VL的框架区不必来源于同一抗体分子。另一种是根据已知的X光衍射结构选取人的框架区，再根据植入特异抗体CDRs的结构来修饰人供体的框架区。
, 百拇医药
4.人源抗体、抗体库、分泌人抗体的小鼠
抗体库(Antibody Library)[7]基本原理就是将各种B细胞的轻、重链V基因分离出来组成轻、重链V基因库，通过随机配对组装入载体，从而组成巨大的抗体组合基因文库(Recombinatorial Antibody Gene Library)。但是，体内抗体与抗原的结合力是在逐次免疫后提高的，即亲和力成熟现象(Affinity Maturation)[8]。在生发中心，经抗原刺激后的B细胞，其抗体V基因发生大量体细胞突变(Somatic mutation)，结合抗原筛选和细胞凋亡的机制，从中选择出能生成抗原特异的高亲和力抗体的B细胞。在人体就要考虑定点突变的方式。
如果将人免疫球蛋白基因组替代小鼠的，并进行正常的B细胞发育，包括重排，则在免疫后能诱发V基因的高突变，选择并扩增产生高亲和力抗体的B细胞，那将得到有特异结合能力和各种效应的完整人单抗[9]。
, 百拇医药
上述各种基因工程抗体，目的是有较强的亲和性，尽量少的鼠源性。应用基因工程技术改造现有的具有优良特异性和亲和力的鼠类抗体，仍是现有最实际的方法，有很多已进入临床使用。
作为免疫毒素的靶子须有下列条件，第一是肿瘤抗原的特异性，最理想是肿瘤的特异抗原，进而制备抗体，但目前大多数是肿瘤相关抗原，具有相对特异性，属于胚胎性抗原较多；另一类是生长因子受体，如EGF、IL-2的受体在某些肿瘤细胞过度表达[10，11]。其二是靶抗原不能以脱落形式存在，主要存在于细胞表面，以免可溶性抗原与免疫毒素竞争结合。其三，抗原抗体结合后抗原能够被“内吞”，使毒素分子转运入细胞内，产生杀伤作用[12]，符合这三个条件，才能成为免疫毒素的靶子。
某些生长因子受体在肿瘤细胞表面过度表达，其配体可发挥类似抗体的功能。EGF受体的配体TGF-α与PE40、PE38构成的免疫毒素对肿瘤细胞有明显的特异杀伤活性，TGF-α-PE38抑制非小细胞肺癌(NSCLC)克隆形成的LD50为0.002～0.1 ng/ml[13]。
, 百拇医药
二、对毒素的研究
1.超抗原(Superantigen)直接与MHC-Ⅱ类分子结合形成配体，通过该配体与T细胞受体(TCR)的Vβ结合来激活T细胞的抗原分子，具有极高的T细胞激活频率，与基因工程抗体融合后不再依赖MHC-Ⅱ类分子，可发挥强有力的细胞毒活性，超抗原的研究对象目前主要是葡萄球菌肠毒素(SEA)。在鼠体内取得了疗效[14]。
2.核糖体延伸因子-2抑制剂：1.植物类核糖体失活蛋白(RIPs)，阻断28s rRNA的4324位腺嘌呤的N糖苷键。又分为两型，Ⅰ型RIPSs如BD1只有酶活性结构，没有结合区。从葫芦科植物Bryonia泻根提取的BD1，其重组合成肽为267个氨基酸。Francisco JA用烟草细胞表达系统不仅表达成功有活性BD1，而且成功表达有特异结合活性和杀伤活性的融合蛋白抗体ntBD1-G28-5 scFv[15]。Ⅱ型RIPs包括蓖麻毒蛋白(Ricin)，即有酶活性区，又有结合区。Ricin的A链结合的anti-CD7-dgA治疗T细胞淋巴瘤和白血病患者，最大的耐受剂量MTD每天达0.2 mg/kg[16]。2.细菌毒素类，包括：①白喉毒素及衍生物(Diphtheria toxin,DT)[17] DT分子量60 kD,A链发挥酶活性，B区具有细胞结合活性，结合活性主要在羧基末端；同时有介导A区内吞转移的作用。将B区去除或点突变，可以制备一系列DT衍生物，去除了正常细胞的结合活性，保留了转位和ADP核糖基化活性。这类DT非常特异，对正常细胞低毒。②绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin, PE)[18] PE是66 kD的单链蛋白，氨基末端1-252个氨基酸构成Ⅰa区，为细胞结合结构域。Ⅰb 365～404，是介于Ⅱ与Ⅲ区之间的小分子，功能不清楚，但去除后不影响毒素活性。第253～264氨基酸组成Ⅱ区，负责毒素的转位。Ⅲ区，405～613，具有ADP核糖基化活性。PE及衍生物到达细胞，在受体或抗体受体介导下内吞，在胞内蛋白水解酶的作用下，Ⅰ、Ⅱ区被去除，Ⅲ区转移入内质网，再转移至胞质。
, 百拇医药
将PE分子的Ⅰa去除，则产生了PE40，用PE40和其它一些配体，如生长因子或抗体相连接，即重组免疫毒素，能够强烈杀伤受体细胞。然而此类免疫毒素在使用过程中，有体内半衰期短，实体瘤穿透率低，及免疫毒素本身的毒副作用，因此，试图通过PE分子的突变来得到改善。目前有以下几种突变体[19]：(1)PE38，是在PE40基础上进一步除去非特异结构域(第365～380)氨基酸，减少了PE分子上的一个二硫键。(2)PE38 KDEL，是将PE分子的羧基端REDLK置换成KDEL，其活性可提高6～10倍。(3)PE35，其转化结构域上的部分氨基酸进一步被去除(253-279位)，使得分子中的二硫键均被删除，而活性不受影响。通过45例应用PE38免疫毒素临床观察，所产生抗体的主要抗原表位位于PE分子中的274-283、470-492、531-540、555-564、596-609，这将有利于对PE38的基因改造，降低免疫原性[20]。
荷瘤裸鼠实验表明，免疫毒素的疗效与使用方法有关，隔两天注射共5次最为有效。在SCID(Severe combined immunodeficient)鼠、大鼠、猴，G28-5 scFv-PE40的最大耐受剂量分别为0.48、1.0、1.67 mg/kg[21]。局部应用免疫毒素疗效优于全身应用[22]。
, 百拇医药
3.其它
(1)蜂毒肽(Melittin)，分子量小，仅26肽，作用机制是直接溶解细胞膜，不需膜内吞，具有很强的杀伤活性[23]。
(2)牛精液RNase[24]，免疫原性低，具有明显的抗肿瘤活性和低免疫原性。
(3)化疗药物活化剂，如scFv携带β-内酰胺酶至肿瘤部位，可转化低毒性的马法兰前体C-Mel为马法兰，在局部发挥作用[25]。
尽管免疫毒素采用这些毒素的衍生物，减少了非特异结合，但仍存在着剂量依赖的非特异或特异对正常细胞的损害。尤其半衰期短的免疫毒素，对血管内皮细胞有较明显的损害，造成血管渗漏综合症(Vascular Leak Syndrome)，PE衍生物往往造成肝损害。另一方面，免疫毒素的毒素部分往往是高免疫原性的。因而免疫原性限制了免疫毒素的反复应用。肿瘤病人治疗往往合并使用化疗药，使得机体的免疫力低下，同时应用免疫抑制剂，也能降低免疫反应[26，27]。
, 百拇医药
4.许多化合物和生物因子能明显提高免疫毒素的生物活性[28]。
趋溶酶体的胺类物质氯化铵和氯喹，能升高含有免疫毒素交联物的溶酶体pH值，促进免疫毒素从溶酶体释放至细胞质。羧基离子载体monensin能影响高尔基体的囊泡化，有利于交联物的转运，提高免疫毒素的杀伤活性。钙离子通道拮抗剂Verapamil perherxiline β-肾上腺素封闭物、细胞因子(如干扰素)、抗生素(如道诺霉素)、免疫抑制剂(如环孢霉素A)等均可通过不同机制来提高免疫毒素的生物活性。
三、免疫毒素研究发展和前景
近来，另一种形式的基因工程免疫毒素(Genetic Immunotoxin)和胞内抗体(Intracellular antibody)弥补了抗原相对特异的不足和降低了抗体的免疫原性[29]。基因工程免疫毒素是毒素分子以质粒形式进入体内，即将毒素基因接入表达质粒，质粒与scFv通过碱性的鱼精蛋白相互连接，由scFv引导至靶细胞，毒素在胞内的表达可预先设计成受控于可诱导的或靶细胞特异性启动子。这种基因工程抗体可以更有选择性地到达靶细胞。胞内抗体以mRNA形式到达靶细胞，翻译成抗体，使某些癌基因蛋白失活。抗体基因可由逆转录病毒、腺病毒等载体转移到靶细胞，以这种方式运输的抗体免疫原性极低，是一种新形式抗体基因治疗。
, http://www.100md.com
近年来，针对肿瘤的免疫毒素治疗研究掀起了一个高潮，这得益于基因工程的发展和对毒素了解的深入。1996年召开的第四届免疫毒素讨论会，总结了其研究进展和临床使用情况。由于基因工程抗体免疫毒素、重组免疫毒素是近年发展起来的，动物实验报道多、疗效好、可使荷瘤小鼠完全治愈，副作用低，而鼠抗体和毒素分子化学交连的免疫毒素在临床应用有了初步的总结[30]。尽管毒素与化疗相似或更低，但肿瘤穿透性差，高免疫原性、血管渗漏综合征出现率高，是目前的主要问题。
基因工程免疫毒素由于具有高特异性，高细胞毒活性，无疑是肿瘤治疗的主要方面。可以预料，免疫原性等问题，在理论和实践上均能在短期内获得突破，通过严格的体外和动物体内试验，将逐步走向临床。
王雄彪，男，医学博士，主治医师。
参考文献
[1]King DJ, Byron OD, Mountain A, et al. Expression ,purification and characterization of B72.3 Fv fragments〔J〕. Biochem J,1993,290(Pt 3):723
, 百拇医药
[2]Huston JS, Levinson D, Mudget-Hunter M, et al. Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produce in E.coli〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:5879
[3]Mansfield E, Amlot P, Pastan I, et al. Recombinant RFB4 immunotoxins exhibit potent cytotoxic acitivity for CD22-bearing cells and tumors〔J〕. Blood,1997,90(5):2020
[4]Brinkmann U, Di Carlo A, Vasmatzis G, et al. Stabilization of a recombinant Fv fragment by base-loop interconnection and V(H)-V(L) permutation〔J〕. J Mol Biol,1997,268(1):107
, http://www.100md.com
[5]LoBuglio AF, Wheeler RH, Trang J, et al. Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man:kinetics and immune response〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(11):4220
[6]Baker TS,Begent HJ, Dweji MR ,et al. Charaterization of th antibody response in patients undergoing radioimmunotherapy with chimeric B72.3. Antibody immunoconjugates, and radiopharmaceuticals〔J〕.1991,4(4):799
[7]Mao S, Gao C, Lo CH, et al. Phage-display libray selection of high-affinity human single-chain antibodies to tumor-associated carbohydrate antigens sialyl Lewisx and Lewisx〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(12):6953
, 百拇医药
[8]Hwakins RE, Russell SJ, Winter G. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation〔J〕. J Mol Biol,1992,226(3):889
[9]Yang XD, Jia XC, Corvalan JR, et al. Eradication of established tumors by a fully human monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor without concomitant chemotherapy〔J〕. Cancer Res,1999,59(6):1236
[10]Schmidt M, Reiser P, Hills D, et al. Expression of an oncogenic mutant EGF receptor markedly increases the sensitivity of cells to an EGF-receptor-specific antibody-toxin〔J〕. Int J Cancer,1998,75(6):878
, 百拇医药
[11]Waldmann TA. The interleukin-2 receptor on malignant cells:a target for disgnosis and therapy〔J〕. Cell Immunol,1986,99(1):53
[12]Olsnes S, Sandvig K. How protein toxins enter and kill cells〔J〕. Cancer Treat Res,1988,37:39
[13]Draoui M, Siegall CB, Fitz Gerald DF,et al. TGFα-PE40 inhibits non-small cell lung cancer growth〔J〕. Life Sciences,1994,54(7):445
[14]Rosendahl A,Kristensson K, Hansson J, et al. Repeated treatment with antibody-targeted superantigens strongly inhibits tumor growth〔J〕. Int J Cancer,1998,76:274
, 百拇医药
[15]Francisco JA, Gawlak SL, Miller M, et al. Experssion and characterization of bryodin 1 and a bryodin 1-based single-chain immunotoxin from tobacco cell culture〔J〕. Bioconjug Chem,1997,8(5):708
[16]Frankel AE, Laver JH,Willingham MC, et al. Therapy of patients with T-cell lymphomas and leukemias using an anti-CD7 monoclonal antibody-ricin A chain immunotoxin〔J〕. Leuk Lymphoma,1997,26(3-4)：287
[17]Li BY, Ramakrishnan S.Recombinant hybrid toxin with dual enzymatic activities. Potential use in preparing highly effective immunotoxins〔J〕. J Biol Chem,1994,269(4):2652
, http://www.100md.com
[18]Pastan I, Fitz Gerald D. Pesudomonoas exotoxin:chimeric toxins〔J〕. J Biol Chem,1989,264(26):15157
[19]Mansfield E, Pastan I, Fitz Gerald DJ. Characterization of RFB4-Pseudomonas exotoxin A immunotoxins targeted to CD22 on B-cell malignancies〔J〕. Bioconjug Chem,1996,7(5):557
[20]Roscoe DM, Pai LH, Pastan I.Identification of epitopes on a mutant from of pseudomonas exotoxin using serum form humans treated with pseudomoas exotoxin containing immunotoxins〔J〕. Eur J Immunol,1997,27(6):1459
, http://www.100md.com
[21]Francisco JA, Schreiber GJ, Comereski CR, et al. In vivo efficacy and toxicity of a single-chain immunotoxin targeted to CD40〔J〕. Blood,1997,89(12):4493
[22]Altenschmidt U, Schmidt M, Groner B, et al. Targeted therapy of schwannoma cells in immunocompetent rats with an erbB2-specific antibody-toxin〔J〕. Int J Cancer,1997,73(1):117
[23]Dunn RD, Weston KM, Longhurst TJ, et al. Antigen binding and cytotoxic properties of a recombinant immunotoxin incorporating the lytic peptide, melittin〔J〕. Immunotechnology,1996,2(3):229
, 百拇医药
[24]Deonarain MP, Epenetos AA. Design, characterization and anti-tumor cytotoxicity of a panel of recombinant,mammalian ribonuclease-based immunotoxins〔J〕. Br J Cancer,1998,77(4):537
[25]Kerr DE, Li Z, Siemers NO, et al. Developement and activities of a new melphalan prodrug designed for tumor-selective activation〔J〕. Bioconjug Chem,1998,9(2):225
[26]Vitetta ES, Stone M, Amlot P, et al. Phase I immunotoxin trial in patients with B-cell lymphoma〔J〕. Cancer Res,1991,51(15):4052
, http://www.100md.com
[27]Pai LH FitzGerald DJ, Tepper M, et al. inhibition of antibody response to pseudomonas exotoxin and an immunotoxin containing pseudomonas exotoxin by 15-deoxyspergualin in mice〔J〕. Cancer Res,1990,50(24):7750
[28]Wu M. Enhancement of immunotoxin activity using chemical and biologcial reagents〔J〕. Br J Cancer,1997,75(9):1347
[29]Maxwell IH, Glode LM, Maxwell F. Expression of the diphtheria toxin A-chain coding sequence under the control of promoters and enhancers from immunoglobulin genes as a means of directing toxicity to B-lymphoid cells〔J〕. Cancer Res,1991,51(16):4299
[30]Li BY,Ramakrishnan S. Recombinant hybrid toxin with dual enzymatic activities. potential use in preparing highly effective immunotoxins〔J〕. J Biol Chem,1994,269(4):2652
(收稿日期：1999-05-31；修回日期：2000-05-23), http://www.100md.com