Wortmannin对细胞的辐射增敏作用
作者：李雨 鲁颖 郑秀龙 罗成基 蔡建明 孟祥顺 赵芳 高建国 赵岚
单位：李雨、郑秀龙、蔡建明、孟祥顺、赵芳、高建国、赵岚 200433 上海，第二军医大学放射医学教研室；鲁颖 开封高等医学专科学校；罗成基 第三军医大学防原医学教研室
关键词：Wortmannin；放射增敏
中华放射医学与防护杂志/990513 【摘要】 目的 研究磷脂酰肌醇3-激酶的特异性抑制剂Wortmannin(WT)对细胞的放射增敏效应，以探索放射增敏信号传导途径。方法 采用体外细胞克隆培养法观察不同浓度WT在不同时间对3种细胞的放射增敏效应。结果 50 μmol/L以上浓度的WT在照射后6小时内对LP3细胞呈较明显的增敏效应，剂量存活曲线D0增敏比在2左右；50 μmol/L WT对HeLa细胞和SP/20细胞均呈明确增敏效应。结论 WT是一种新型放射增敏剂。
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Cellular radiosensitization by wortmannin
LI Yu,LU Ying,ZHENG Xiulong,et al.
Department of Radiation Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China,*Department of Radiation Medicine,Third Military Medical University,Chongqin,400038 China
【Abstract】 Objective To examine the radiosensitization possibility of wortmannin(WT) on some cell lines. Methods Cells were prepared with WT or DMSO(solvent) for 1h,and irradiated at the indicated dose.At different times after irradiation,the cells were washed to remove the WT and allowed to grow for 7 days,and colonies of more than 50 cells were examined under low power microscope. Results Marked radiosensitizing effect of WT in concentration over 50 μmol/L on LP cells within 6 h after radiation exposure was displayed,the D0 radiosensitization ratio in the dose survival curve being around 2.WT in concentration 50 μmol/L had definite radiosensitizing effect on HeLa and SP/20 cells. Conclusion WT is a noveldiosensitizer.
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【Key words】 Wortmannin Radiosensitization
人们已经认识到细胞内的磷脂信号传递是一个远未被了解的复杂过程，可能存在一个以上的磷脂信号传递系统，其中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI-3K)倍受重视，可能是新的信号系统的关键所在[1]。它是近年来引起广泛关注的细胞内信号代谢酶，可能参与一个新的磷脂信号代谢途径，影响细胞许多功能，PI-3K的催化产物可能是新的“第二信使”，在静息的细胞中未见其踪迹，仅出现于受多种理化因子作用后的细胞，且不受现知磷脂信号途径中酶的作用。PI-3K涉及广泛的细胞生命活动，多种细胞因子及受体，多种癌基因蛋白与之相关[2]。近年发现一种代谢性遗传病——共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangectasia,AT)的基因与PI-3K同源，而该病的最主要特征之一是对电离辐射敏感[3]。现已知与PI-3K具有同源关系的还有另外几个蛋白激酶，它们在细胞的基本生命活动中都具重要作用[4]。我们设想，PI-3K在细胞的辐射反应中也可能会起到某种作用。
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一种PI-3K的特异性抑制物对其研究帮助很大。它被称作“Wortmannin”(WT)，早在1974年被发现，为青霉菌产物，具有免疫抑制、抗炎、全身毒性等作用[5]。现发现其对该酶P110催化亚基有特异性抑制作用[6]。由此揭示了一系列有关PI-3K的新作用：参与神经轴突的生长延伸[7]；参与细胞凋亡过程[8]；与DNA蛋白激酶有关，可能参与DNA断链修复[9]。为此，我们应用PI-3K的特异性抑制剂WT作用数种细胞，观察其辐射反应变化，现已获得了一些令人感兴趣的结果。
材料和方法
1.材料
(1)培养细胞株LP3、HeLa、SP/20，分别来自本校生物教研室和本校免疫教研室。
(2)主要试剂及配制：RPMI 1640培养液，Sigma公司产品，依产品说明书配制，正压抽滤除菌后分装待用；小牛血清，上海华美生物工程公司产品；WT，Sigma公司产品，以DMSO溶解成1 mmol/L浓度，分装后贮存-70°环境。
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(3)主要设备及器材：二氧化碳培养箱(Heraeus)；倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；其他细胞培养用器材有洁净工作台，24孔细胞培养板，50 ml培养瓶；离心机等。
(4)60Co γ射线辐照装置，第二军医大学放射医学教研室。
2.方法
(1)细胞培养：将前述细胞分别在含10%小牛血清中的RPMI 1640培养液中置37℃，CO2体积分数为5%，100%湿度环境中培养7天，然后在倒置显微镜下进行细胞克隆计数。
(2)样品照射：将待测细胞分别装入试管或培养板及培养瓶中，在冰水浴环境下，置60Co γ射线源中，按实验设计以不同剂量进行照射(剂量率10 Gy/min)。
(3)实验设计：①不同作用浓度WT对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响。将对数生长期的LP3细胞置于含不同浓度的WT培养液中，1小时以2 Gy照射后，继续培养16小时，设不照射对照。然后以1640培养液洗3次以除去WT，继续培养7天，计数细胞克隆形成。②不同作用时间WT对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响。以含50 μmol/L WT的1640培养液作用于LP3细胞，于照射后不同时间(0、1、3、6、12小时)洗去WT，进行细胞克隆培养。LP3细胞以含50 μmol/L的WT作用1小时，接受不同剂量的γ射线照射，设无WT作为对照，细胞培养及计数方法同上。③WT对其他细胞株的辐射增敏作用。分别对SP/20和HeLa细胞进行上述WT作用处理，常规细胞培养及克隆计数，设单独WT作用及单独照射对照组。④统计学处理。实验中所有数据均按小样本t检验进行处理，以下各部分实验亦用此法处理。
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结果
1.不同作用浓度WT对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响(图1)。100 μmol/L的WT对LP3细胞无明显抑制作用(图1，对照)，在无WT作用时，2 Gy照射后LP3存活比为0.57(图1中WT)，随WT作用浓度增加细胞存活比依次降低，在大于50 μmol/L WT作用下，细胞存活无继续明显下降。说明WT对LP3细胞无毒杀作用，且具有一定的放射增敏作用。
图1 不同浓度WT对LP3细胞的辐射增敏效应
(2)不同作用时间对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响(图2)。LP3细胞在含50 μmol/L WT培养液中受2 Gy γ射线照射，继续在含WT的培养液中培养不同时间，随WT作用时间延长，细胞存活下降，但以1、3、6小时下降尤为明显。
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图2 照射后WT不同作用时间对
LP3细胞的辐射增敏效应
(3)以剂量-存活曲线观察WT的辐射增敏效应(图3)。参阅上述方法处理细胞，分别以1、2、3、5 Gy γ射线一次照射，培养7天后细胞克隆计数，以吸收剂量(Gy)为横座标，细胞克隆形成率为纵座标制作剂量存活曲线，图中WT为WT合并照射实验组，对照组为不含WT单纯照射。从剂量存活曲线比较可见在每一照射剂量点，WT作用使细胞存活均降低，两条曲线的D0值分别约为1.5 Gy和3 Gy，显示WT对LP3细胞的辐射增敏作用。
图3 WT对LP3细胞的辐射增敏作用
WT：WT+不同剂量照射；对照：不同剂量照射
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(4)WT对HeLa和SP/20细胞的辐射增敏作用。继续用人类HeLa和小鼠杂交瘤SP/20细胞进行WT的辐射增敏实验，结果见表1。结果表明，尽管各种细胞的存活数值不尽一致，但WT+2 Gy组每一种细胞的存活数值均小于单独WT和2 Gy照射存活数值，说明WT对细胞的辐射增敏可能是一个普遍现象。
表1 WT对细胞的辐射增敏作用(
±s)
细胞株
样本数
细胞存活分数
WTa
2 Gyb
, 百拇医药
WT+2 Gyc
LP3
6
0.90±0.05
0.57±0.09
0.18±0.04**
HeLa
6
0.88±0.07
0.41±0.08
0.13±0.09**
, 百拇医药 SP/20
6
0.92±0.08
0.45±0.06
0.21±0.10**
注：a为WT浓度为50 μmol/L作用细胞的结果；b为仅用2 Gy照射细胞培养的结果；c为WT+2 Gy照射后培养的结果。c与a或与b比，**P<0.01
讨论
有关细胞内通讯信号分子的研究，近数十年发展迅速。一般公认环腺苷酸(cAMP)，环鸟苷酸(cGMP)，钙离子(Ca++)，肌醇三磷酸(IP3)及甘油二脂(DG)等为胞内信使。1988年Whitman报道了PI-3K，它可以催化肌醇环与D3位磷酸化，生成相应的D3磷酸产物(3-Phosphatylated phosphoinositides)。该类产物不受任何已知的磷脂酶作用，不是已知磷脂信号通路的成分。这种酶与已知激酶性质不同，不受非离子型去垢剂的抑制，对腺嘌呤核苷不敏感，将其命名为磷脂酰肌醇-3激酶，从而揭示一个新的磷脂信号通路，已有愈来愈多的证据支持这一设想[10]。
, 百拇医药
AT是一个常染色体隐性遗传病，其表现有免疫缺陷，共济失调，毛细血管扩张等，另一个共同特征是对电离辐射敏感。近年对其基因的克隆显示该基因属于PI-3K相关激酶家族[11]，这一类激酶中相当一部分与辐射反应有关(如rad,DNA-PK等)。PI-3K的P110催化亚基与细胞有丝分裂，细胞周期调控等重要活动相关，AT基因与P110序列的相似性，提示AT基因在正常细胞内可能具有PI-3K的功能，AT基因的突变则可能影响这些功能而致对电离辐射敏感。我们设想如果改变PI-3K的活性，可能会影响细胞对电离辐射的敏感性。
电离辐射被广泛应用于癌症的治疗，虽然大部分肿瘤对放射治疗都有不同程度的敏感性，仍有少量肿瘤对辐射耐受，人们希望能够进一步了解这种现象的分子机理，并寻找设计各种制剂以影响改变肿瘤细胞的辐射敏感性。WT是一种青霉菌代谢产物，它可以特异性抑制PI-3K的P110亚基，不影响蛋白激酶C(protein kinase C),c-src,phosphodipasec,calmodulin-dependent protein kinase,和cAMP-dependent kinase等多种其他激酶[12]。PI-3K是否能影响细胞辐射反应 用WT抑制PI-3K是否可达到这种效果
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我们的实验设想并证实了WT的确可以增加几种细胞的辐射敏感性。WT对实验中采用的人类细胞和小鼠细胞均不显示明显的毒性作用，如果WT和电离辐射共同作用于细胞，则显现出明确的辐射增敏效果。尽管所采用的几种细胞增敏效果不完全一样，但它们的共同趋势是明显的。实验还说明了这种增敏效果的时相变化过程以及WT浓度与细胞受照剂量效应结果。应该指出的是，本文应用WT的浓度高于文献中报告的抑制PI-3K的剂量范围[13]。一般认为WT抑制PI-3K的浓度在5 μmol/L以下，而我们在细胞增敏应用的剂量在20 μmol/L以上，其原因可能与对其他蛋白酶类的非特异抑制作用有关[14]，也可能是培养液中的血清对WT有促进失活作用，WT在含血清培养液中时间延长，对细胞的杀伤逐渐下降，可能反映了这样一种过程。
我们的实验初步说明WT对细胞的辐射增敏作用可能是一个普遍存在的现象，这种现象的发生机理是什么，它都影响细胞内那些“靶”目标，通过哪些信号传导通路，这是我们以后将要继续讨论的问题。
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参考文献
1 Vanhaesebroeck B,Stein RC,Waterfield MD.The study of phosphoinositide 3 kinase function.Cancer Surv,1996,27:249-269.
2 Dhand R,Hara K,Hiles I,et al.PI-3kinase:structural and functional analysis of intersubunt interactions.Eur Molec Biol Org J,1994,13:511-521.
3 Savitsky A,Barshira A,Gilad S,et al.A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase.Science,1995,268:1749-1753.
, 百拇医药
4 Abraham RT.Phosphatidylinositol 3 kinase related kinase.Curr Opin Immunol,1996,8:412-418.
5 Wiesinger D,Gubler HU,Haefliger W,et al.Antiinflammatory activity of new mould metabolite 11 desacetory wortmannin and some of its derivatives.Experientia,1997,15:135-137.
6 Okada T,Nakanish S,Fukui L,et al.Blockage of chemotactic peptid induced stimulation of neutrophils by wortmannin as result of selective inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase.J Biol Chem,1994,269:3563-3567.
, 百拇医药
7 Kimura K,Hattori S,Kabuyama Y,et al.Neurite outgrowth of PL12 cells is suppressed by wortmannin,a speific inhibitor of phosphatidyl-inositol 3-kinase.J Biol Chem,1994,269:18961-18967.
8 Yao R,Cooper GM.Requirement for phosphatidylinositol 3 kinase in the prevention of apoptosis by nerve growth factor.Science,1995,267:2003-2006.
9 Hartley KD,Smith GCM,Gel D,et al.DNA dependent protein kinase catalytic subunt:a relative of phosphatidylinositol 3-kinase and the ataxia telangectasia gene product.Cell,1995,82:849-856.
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10 Kapeller R,Cantley LC.Phospatidylinositol 3 kinase.Biol Essays,1994,16:565-575.
11 Virginia AZ.ATM related genes:what do they tell us about functions of human gene Cell,1995,82:685-687.
12 Vlahals CJ,Matter WF,Brown RF,et al.Investigation of neutrophil signal transduction using a specific inhibitor of phosphatidylinositol 3 kinase.J Immunol,1995,154:2413-2422.
13 Woscholski R,Kodaki T,Mckinnon M,et al.A comparison of demethoxyviridin and wortmannin as inhibitor of phosphatidylinositol 3 kinase.FEBS Letters,1994,342:109-114.
14 Cross MJ,Stewart A,Hodgkin MN,et al.Wortmannin is not a specific inhibitor of phosphatidylinositol 3 kinase.J Biol Chem,1995,270:25352-25355.
(收稿:1998-12-14 修回1999-03-24), 百拇医药
单位：李雨、郑秀龙、蔡建明、孟祥顺、赵芳、高建国、赵岚 200433 上海，第二军医大学放射医学教研室；鲁颖 开封高等医学专科学校；罗成基 第三军医大学防原医学教研室
关键词：Wortmannin；放射增敏
中华放射医学与防护杂志/990513 【摘要】 目的 研究磷脂酰肌醇3-激酶的特异性抑制剂Wortmannin(WT)对细胞的放射增敏效应，以探索放射增敏信号传导途径。方法 采用体外细胞克隆培养法观察不同浓度WT在不同时间对3种细胞的放射增敏效应。结果 50 μmol/L以上浓度的WT在照射后6小时内对LP3细胞呈较明显的增敏效应，剂量存活曲线D0增敏比在2左右；50 μmol/L WT对HeLa细胞和SP/20细胞均呈明确增敏效应。结论 WT是一种新型放射增敏剂。
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Cellular radiosensitization by wortmannin
LI Yu,LU Ying,ZHENG Xiulong,et al.
Department of Radiation Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China,*Department of Radiation Medicine,Third Military Medical University,Chongqin,400038 China
【Abstract】 Objective To examine the radiosensitization possibility of wortmannin(WT) on some cell lines. Methods Cells were prepared with WT or DMSO(solvent) for 1h,and irradiated at the indicated dose.At different times after irradiation,the cells were washed to remove the WT and allowed to grow for 7 days,and colonies of more than 50 cells were examined under low power microscope. Results Marked radiosensitizing effect of WT in concentration over 50 μmol/L on LP cells within 6 h after radiation exposure was displayed,the D0 radiosensitization ratio in the dose survival curve being around 2.WT in concentration 50 μmol/L had definite radiosensitizing effect on HeLa and SP/20 cells. Conclusion WT is a noveldiosensitizer.
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【Key words】 Wortmannin Radiosensitization
人们已经认识到细胞内的磷脂信号传递是一个远未被了解的复杂过程，可能存在一个以上的磷脂信号传递系统，其中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI-3K)倍受重视，可能是新的信号系统的关键所在[1]。它是近年来引起广泛关注的细胞内信号代谢酶，可能参与一个新的磷脂信号代谢途径，影响细胞许多功能，PI-3K的催化产物可能是新的“第二信使”，在静息的细胞中未见其踪迹，仅出现于受多种理化因子作用后的细胞，且不受现知磷脂信号途径中酶的作用。PI-3K涉及广泛的细胞生命活动，多种细胞因子及受体，多种癌基因蛋白与之相关[2]。近年发现一种代谢性遗传病——共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangectasia,AT)的基因与PI-3K同源，而该病的最主要特征之一是对电离辐射敏感[3]。现已知与PI-3K具有同源关系的还有另外几个蛋白激酶，它们在细胞的基本生命活动中都具重要作用[4]。我们设想，PI-3K在细胞的辐射反应中也可能会起到某种作用。
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一种PI-3K的特异性抑制物对其研究帮助很大。它被称作“Wortmannin”(WT)，早在1974年被发现，为青霉菌产物，具有免疫抑制、抗炎、全身毒性等作用[5]。现发现其对该酶P110催化亚基有特异性抑制作用[6]。由此揭示了一系列有关PI-3K的新作用：参与神经轴突的生长延伸[7]；参与细胞凋亡过程[8]；与DNA蛋白激酶有关，可能参与DNA断链修复[9]。为此，我们应用PI-3K的特异性抑制剂WT作用数种细胞，观察其辐射反应变化，现已获得了一些令人感兴趣的结果。
材料和方法
1.材料
(1)培养细胞株LP3、HeLa、SP/20，分别来自本校生物教研室和本校免疫教研室。
(2)主要试剂及配制：RPMI 1640培养液，Sigma公司产品，依产品说明书配制，正压抽滤除菌后分装待用；小牛血清，上海华美生物工程公司产品；WT，Sigma公司产品，以DMSO溶解成1 mmol/L浓度，分装后贮存-70°环境。
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(3)主要设备及器材：二氧化碳培养箱(Heraeus)；倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；其他细胞培养用器材有洁净工作台，24孔细胞培养板，50 ml培养瓶；离心机等。
(4)60Co γ射线辐照装置，第二军医大学放射医学教研室。
2.方法
(1)细胞培养：将前述细胞分别在含10%小牛血清中的RPMI 1640培养液中置37℃，CO2体积分数为5%，100%湿度环境中培养7天，然后在倒置显微镜下进行细胞克隆计数。
(2)样品照射：将待测细胞分别装入试管或培养板及培养瓶中，在冰水浴环境下，置60Co γ射线源中，按实验设计以不同剂量进行照射(剂量率10 Gy/min)。
(3)实验设计：①不同作用浓度WT对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响。将对数生长期的LP3细胞置于含不同浓度的WT培养液中，1小时以2 Gy照射后，继续培养16小时，设不照射对照。然后以1640培养液洗3次以除去WT，继续培养7天，计数细胞克隆形成。②不同作用时间WT对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响。以含50 μmol/L WT的1640培养液作用于LP3细胞，于照射后不同时间(0、1、3、6、12小时)洗去WT，进行细胞克隆培养。LP3细胞以含50 μmol/L的WT作用1小时，接受不同剂量的γ射线照射，设无WT作为对照，细胞培养及计数方法同上。③WT对其他细胞株的辐射增敏作用。分别对SP/20和HeLa细胞进行上述WT作用处理，常规细胞培养及克隆计数，设单独WT作用及单独照射对照组。④统计学处理。实验中所有数据均按小样本t检验进行处理，以下各部分实验亦用此法处理。
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结果
1.不同作用浓度WT对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响(图1)。100 μmol/L的WT对LP3细胞无明显抑制作用(图1，对照)，在无WT作用时，2 Gy照射后LP3存活比为0.57(图1中WT)，随WT作用浓度增加细胞存活比依次降低，在大于50 μmol/L WT作用下，细胞存活无继续明显下降。说明WT对LP3细胞无毒杀作用，且具有一定的放射增敏作用。
图1 不同浓度WT对LP3细胞的辐射增敏效应
(2)不同作用时间对2 Gy照射后LP3细胞存活率的影响(图2)。LP3细胞在含50 μmol/L WT培养液中受2 Gy γ射线照射，继续在含WT的培养液中培养不同时间，随WT作用时间延长，细胞存活下降，但以1、3、6小时下降尤为明显。
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图2 照射后WT不同作用时间对
LP3细胞的辐射增敏效应
(3)以剂量-存活曲线观察WT的辐射增敏效应(图3)。参阅上述方法处理细胞，分别以1、2、3、5 Gy γ射线一次照射，培养7天后细胞克隆计数，以吸收剂量(Gy)为横座标，细胞克隆形成率为纵座标制作剂量存活曲线，图中WT为WT合并照射实验组，对照组为不含WT单纯照射。从剂量存活曲线比较可见在每一照射剂量点，WT作用使细胞存活均降低，两条曲线的D0值分别约为1.5 Gy和3 Gy，显示WT对LP3细胞的辐射增敏作用。
图3 WT对LP3细胞的辐射增敏作用
WT：WT+不同剂量照射；对照：不同剂量照射
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(4)WT对HeLa和SP/20细胞的辐射增敏作用。继续用人类HeLa和小鼠杂交瘤SP/20细胞进行WT的辐射增敏实验，结果见表1。结果表明，尽管各种细胞的存活数值不尽一致，但WT+2 Gy组每一种细胞的存活数值均小于单独WT和2 Gy照射存活数值，说明WT对细胞的辐射增敏可能是一个普遍现象。
表1 WT对细胞的辐射增敏作用(
±s)细胞株
样本数
细胞存活分数
WTa
2 Gyb
, 百拇医药
WT+2 Gyc
LP3
6
0.90±0.05
0.57±0.09
0.18±0.04**
HeLa
6
0.88±0.07
0.41±0.08
0.13±0.09**
, 百拇医药 SP/20
6
0.92±0.08
0.45±0.06
0.21±0.10**
注：a为WT浓度为50 μmol/L作用细胞的结果；b为仅用2 Gy照射细胞培养的结果；c为WT+2 Gy照射后培养的结果。c与a或与b比，**P<0.01
讨论
有关细胞内通讯信号分子的研究，近数十年发展迅速。一般公认环腺苷酸(cAMP)，环鸟苷酸(cGMP)，钙离子(Ca++)，肌醇三磷酸(IP3)及甘油二脂(DG)等为胞内信使。1988年Whitman报道了PI-3K，它可以催化肌醇环与D3位磷酸化，生成相应的D3磷酸产物(3-Phosphatylated phosphoinositides)。该类产物不受任何已知的磷脂酶作用，不是已知磷脂信号通路的成分。这种酶与已知激酶性质不同，不受非离子型去垢剂的抑制，对腺嘌呤核苷不敏感，将其命名为磷脂酰肌醇-3激酶，从而揭示一个新的磷脂信号通路，已有愈来愈多的证据支持这一设想[10]。
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AT是一个常染色体隐性遗传病，其表现有免疫缺陷，共济失调，毛细血管扩张等，另一个共同特征是对电离辐射敏感。近年对其基因的克隆显示该基因属于PI-3K相关激酶家族[11]，这一类激酶中相当一部分与辐射反应有关(如rad,DNA-PK等)。PI-3K的P110催化亚基与细胞有丝分裂，细胞周期调控等重要活动相关，AT基因与P110序列的相似性，提示AT基因在正常细胞内可能具有PI-3K的功能，AT基因的突变则可能影响这些功能而致对电离辐射敏感。我们设想如果改变PI-3K的活性，可能会影响细胞对电离辐射的敏感性。
电离辐射被广泛应用于癌症的治疗，虽然大部分肿瘤对放射治疗都有不同程度的敏感性，仍有少量肿瘤对辐射耐受，人们希望能够进一步了解这种现象的分子机理，并寻找设计各种制剂以影响改变肿瘤细胞的辐射敏感性。WT是一种青霉菌代谢产物，它可以特异性抑制PI-3K的P110亚基，不影响蛋白激酶C(protein kinase C),c-src,phosphodipasec,calmodulin-dependent protein kinase,和cAMP-dependent kinase等多种其他激酶[12]。PI-3K是否能影响细胞辐射反应 用WT抑制PI-3K是否可达到这种效果
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我们的实验设想并证实了WT的确可以增加几种细胞的辐射敏感性。WT对实验中采用的人类细胞和小鼠细胞均不显示明显的毒性作用，如果WT和电离辐射共同作用于细胞，则显现出明确的辐射增敏效果。尽管所采用的几种细胞增敏效果不完全一样，但它们的共同趋势是明显的。实验还说明了这种增敏效果的时相变化过程以及WT浓度与细胞受照剂量效应结果。应该指出的是，本文应用WT的浓度高于文献中报告的抑制PI-3K的剂量范围[13]。一般认为WT抑制PI-3K的浓度在5 μmol/L以下，而我们在细胞增敏应用的剂量在20 μmol/L以上，其原因可能与对其他蛋白酶类的非特异抑制作用有关[14]，也可能是培养液中的血清对WT有促进失活作用，WT在含血清培养液中时间延长，对细胞的杀伤逐渐下降，可能反映了这样一种过程。
我们的实验初步说明WT对细胞的辐射增敏作用可能是一个普遍存在的现象，这种现象的发生机理是什么，它都影响细胞内那些“靶”目标，通过哪些信号传导通路，这是我们以后将要继续讨论的问题。
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参考文献
1 Vanhaesebroeck B,Stein RC,Waterfield MD.The study of phosphoinositide 3 kinase function.Cancer Surv,1996,27:249-269.
2 Dhand R,Hara K,Hiles I,et al.PI-3kinase:structural and functional analysis of intersubunt interactions.Eur Molec Biol Org J,1994,13:511-521.
3 Savitsky A,Barshira A,Gilad S,et al.A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase.Science,1995,268:1749-1753.
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4 Abraham RT.Phosphatidylinositol 3 kinase related kinase.Curr Opin Immunol,1996,8:412-418.
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6 Okada T,Nakanish S,Fukui L,et al.Blockage of chemotactic peptid induced stimulation of neutrophils by wortmannin as result of selective inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase.J Biol Chem,1994,269:3563-3567.
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7 Kimura K,Hattori S,Kabuyama Y,et al.Neurite outgrowth of PL12 cells is suppressed by wortmannin,a speific inhibitor of phosphatidyl-inositol 3-kinase.J Biol Chem,1994,269:18961-18967.
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(收稿:1998-12-14 修回1999-03-24), 百拇医药