P38激酶在PC12细胞缺氧/再给氧损伤中的作用
作者：罗成义 徐如祥 邹雨汐 杨志林 戴宜武
单位：罗成义(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；徐如祥(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；邹雨汐(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；杨志林(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；戴宜武(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)
关键词：缺氧/再给氧；细胞死亡；信号转导；PC12细胞
脑与神经疾病杂志000601
摘 要 目的：探讨PC12细胞缺氧/再给氧损伤的信号转导机理。 方法： 培养的PC12细胞先缺氧(95%N2/5%CO2)6h， 然后重新给氧， 观测不同时间点细胞的存活率和caspase-3 的活性； 用MTT法测存活率， caspase-3 检测试剂盒测caspase-3 活性。 用p38拮抗剂SB203580孵育细胞2h， 之后缺氧/再给氧， 观察SB203580对细胞存活率和caspase-3活性的影响。 结果： PC12细胞缺氧/再给氧后caspase-3 活性明显增加并使细胞存活率下降， SB203580明显降低缺氧/复氧后caspase-3的活性并使细胞死亡减少。 结论： PC12细胞缺氧/再给氧后至少可以通过激活p38、caspase-3信号分子诱导PC12细胞死亡。
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Effects of p38 Kinase in PC12 Cellular Injury Induced by Hypoxia/Reoxygenation
Luo Cheng-Yi，Xu Ru-Xiang，Zou Yu-Xi，Yang Zhi-Lin，Dai Yi-Wu
(Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, The First Military Medical
University, Guangzhou510282)
Abstract Objective： To study signal transduction pathway of hypoxia reoxygenation inducing PC12 cell death. Methods: PC12 cells were submitted to hypoxia (95%N2/5%CO2) for 6 h 37℃， then returned to standard incubation chamber (95%O2/5%CO2, 37℃), afterwards at different time points cell survival rate was quantified by MTT assay and caspase-3 activity was measured with caspase-3 assay kits; Before hypoxia/reoxygenation, cells were incubated with SB203580 for 2h, the effects of SB293580 on caspase-3 activity and cell survival were detected. Results:Hypoxia/reoxygenation increased caspase-3 activity and decreased cell survival rate significantly in PC12 cell; SB203580 reduced caspase- activity and decreased cell death induce by hypoxia/reoxygenation. Conclusion: Hypoxia/reoxygenation might induce PC12 cell death through the activation of p38 and then caspase-3.
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Key words Hypoxia/reoxygenation; Cell death; Signal transduction; PC12 cell
缺血缺氧性损伤是创伤性或缺血性脑损伤等神经系统疾病中普遍存在的病理生理现象， 一旦发生会导致迟发性细胞死亡， 而神经细胞比其他脑细胞对氧供应的减少更敏感、 缺血又伴随着缺氧， 因此研究缺氧/再给氧条件下神经细胞死亡的发生机理有助于对这些神经疾病的认识。 尽管培养细胞只能充当一种简单的模型， 但它们有助于理解涉及许多疾病的细胞和分子机理。 有研究发现从PC12细胞培养液中撤离NGF(nerve growth factor)会引起p38激酶的激活并导致细胞死亡的发生[1]， 但在PC12细胞中缺氧/复氧能否活化p38激酶以及引起细胞死亡的作用途径未见报道。 目前越来越多的实验揭示许多刺激作用于细胞， 通过一定的途径最后激活凋亡蛋白酶caspase家族而导致细胞的死亡[2]， 但caspase激活与PC12细胞死亡关系的研究并不多。 为此本实验在培养的PC12细胞上， 观察p38拮抗剂SB203580对缺氧/复氧后不同时间点细胞存活率和caspase-3活性变化的影响， 以探讨缺氧/复氧引起PC12细胞死亡的信号转导途径。
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材 料 与 方 法
1. 主要试剂：
p38拮抗剂(SB203580)、 caspase-3拮抗剂(caspase-3 inhibitorⅡ)购自Calbiochem-Novabiochem Corporation La Jolla, CA; 噻唑篮(Thiazolyl blue, MTT)购自Sino-American Biotec; caspase-3 活性检测试剂盒购自CLONTECH Laboratories, Inc; RPMI 1640 为Sigma产品。
2. 细胞培养
PC12细胞用含10%无支原体小牛血清的RPMI 1640培养基， 在37℃、 5%CO2条件下正常孵育， 按以下分组进行实验。
实验分组： (1)正常组： 细胞正常培养， 不加任何处理； (2)缺氧/复氧处理组： 将正常生长的PC12细胞培养瓶置于含95%N2/5%CO2混合气体的培养箱内， 37℃下卵育6h， 之后放回正常培养箱内培养； 继续孵育3、 6、 12、 24h后观测caspase-3活性和细胞存活率；(3)Caspase- inhibitorⅡ加缺氧/复氧处理组： PC12细胞先加caspase-3 inhibitorⅡ100μmol/L(终浓度)卵育2h再按前述方法作缺氧/复氧处理， 继续共同卵育3、6、12、24h后测细胞存活率；(4)SB203580加缺氧/复氧处理组： PC12细胞先加SB203580(终浓度为20μmol/L)卵育2h， 再按前述方法作缺氧/复氧处理， 继续培养3、 6、 12、 24h后观测caspase-3活性和细胞存活率。
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3. 细胞存活率的检测
用MTT法[3]测细胞存活率： 按实验设计于药物作用后加10μl MTT(5mg/ml)继续孵育2h， 用0.04N HCl/异丙醇裂解细胞， 之后用紫外分光光度计在575nm和620nm波长处测其吸收值， 差值表示存活率； 正常组吸收差值代表100%存活， 处理组与正常组的差值之比代表相对存活率。
4. Caspase-3活性的检测
按Caspase-3活性检测试剂盒进行， 简述如下： 正常组或处理组的细胞200×g离心10 min， 去除上清； 50μl冰冷细胞裂解缓冲液重悬细胞， 冰上孵育10 min； 12000 rpm， 4℃离心细胞裂解液3 min； 将上清液转到新的微量离心管； 每管加50μl的2×反应缓冲液(使用前1ml的2×反应缓冲液加1.0mol/L DTT 10μl)， 再加1.0mmol/L Caspase-3底物DEVD-pNA 5μl， 37℃水浴孵育1h； 紫外分光光度计测405nm波长处的吸收值， 酶的相对活性用处理组与正常组的吸收值之比表示， 设正常组的活性为1。
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结 果
1. 经缺氧/复氧处理后3、 6、 12、 24h细胞存活率均明显下降， 与正常组比较差异显著(见图1)。
图1 缺氧/再给氧后PC12细胞的存活率
2. Caspase-3 inhibitorⅡ加缺氧/复氧处理组及SB203580 加缺氧/复氧处理组与缺氧/复氧处理组比较， 细胞存活率明显增加； 两种拮抗剂均未完全阻断细胞死亡(见图2)。
图2 不同处理对PC12细胞存活率的影响
3. 缺氧/复氧处理PC12细胞， 在观察时间内Caspase-3活性逐渐增加， SB203580加缺氧/复氧处理使Caspase-3活性下降， 与缺氧/复氧处理组比较有显著差异， 但未能使Caspase-3活性达到正常(见图3)。
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图3 不同处理对PC12细胞Caspase-3活性的影响
讨 论
许多临床和实验研究发现脑缺血缺氧的时间和程度与脑功能损害程度成正相关， 神经细胞对缺血缺氧的耐受力差， 因此可以认为研究缺血缺氧对神经细胞的损伤机理是研究缺血缺氧性脑损害的核心。目前普遍认为脑缺血缺氧后神经细胞不仅存在坏死同时还有凋亡， 但缺血缺氧引起神经细胞凋亡的信号转导途径仍不完全清楚。 由于缺血必然导致缺氧， 因此利用体外培养细胞缺氧模型所得的研究结果可以帮助解释在体缺血缺氧性脑损害的发生机理。 本实验发现PC12细胞缺氧/再给氧后， 在观察时间内其存活率进行性下降， 证明缺氧/再给氧可以引起PC12细胞的死亡。 实验亦揭示缺氧再给氧后Caspase-3活性逐渐升高， 使用Caspase-3拮抗剂能明显增加细胞的存活率， 据此认为缺血再给氧引起PC12细胞的死亡与Caspase-3的活化关系密切。 Caspase是天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶超家族， Caspase-3是其中的一个重要成员； 活化后使特异性底物裂解、 切断目标细胞与周围细胞的联系、 细胞骨架改变、 DNA复制和修复能力降低等， 最终使细胞解体形成凋亡小体， 普遍认为Caspase-3是引起细胞凋亡的重要因素[4]。 因此本研究揭示了NO可以通过一定的途径活化Caspase-3而诱导PC12细胞凋亡性死亡。
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p38激酶属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员， 这类激酶参与细胞分裂分化等生理过程， 亦有文献报道[1]在培养的PC12细胞中撤离神经生长因子会引起p38激酶的磷酸化而导致细胞的凋亡， 并认为p38激酶作为一种信号分子在细胞凋亡中发挥着重要作用， 但缺氧/再给氧能否激活PC12细胞中的p38激酶以及活化的p38激酶通过何种途径导致PC12细胞凋亡还存在很多争议。 为探索其机理， 我们首先用p38拮抗剂孵育细胞抑制p38激酶激活， 之后给予缺氧/再给氧处理， 观测Caspase-3的活性和细胞的生存率， 发现p38拮抗剂明显降低了Caspase-3活性并减少缺氧引起的细胞死亡。 从这些实验结果推测缺氧/再给氧至少可以通过活化p38激酶而导致细胞凋亡并且p38激酶信号分子位于Caspase-3的上游。 p38是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 依赖于酪氨酸和苏氨酸残基的磷酸化而激活； 尽管本实验没有检测p38活性， 但很有可能由于缺氧的应急刺激使受体蛋白酪氨酸磷酸化， 引起p38上游激酶的活化并相继激活了p38激酶； 活化的p38激酶又可激活下游的激酶、酶或蛋白， 产生生物学作用[5]， 因此Caspase-3可能作为p38激酶的一种底物而受到激活， 促进细胞凋亡的发生。
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实验亦发现Caspase-3拮抗剂不能完全阻断细胞死亡、 p38激酶拮抗剂不能完全阻断Caspase-3的激活， 从一个侧面反映缺氧/再给氧引起PC12细胞死亡的机理是极其复杂的。 本研究证明了NO至少可以通过相继激活p38激酶、 Caspase-3蛋白酶这个信号转导链而导致PC12细胞死亡。
本课题受广东省自然科学基金资助(GD990416)
参考文献
1，Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, et al. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinase on apoptosis. Science 1995;270(24)∶1326-1331.
2，Namura S, Zhu J, Fink K, et al. Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia. J Neurosci 1998;18(10)∶3659-3668.
, 百拇医药
3，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983;65(1-2)∶55～63.
4，Janicke RU, Sprengart ML, Wati MR, et al. Caspase-3 requierd for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis. J Biol Chem 1998;273(16)∶9360.
5，Karin M. Mitogen-activated protei kinase cascades as redulators of stress responses. Ann-N-Y-Acad-Sci 1998;851∶139～146.
(2000-7-26，收稿), http://www.100md.com
单位：罗成义(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；徐如祥(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；邹雨汐(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；杨志林(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)；戴宜武(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经外科)
关键词：缺氧/再给氧；细胞死亡；信号转导；PC12细胞
脑与神经疾病杂志000601
摘 要 目的：探讨PC12细胞缺氧/再给氧损伤的信号转导机理。 方法： 培养的PC12细胞先缺氧(95%N2/5%CO2)6h， 然后重新给氧， 观测不同时间点细胞的存活率和caspase-3 的活性； 用MTT法测存活率， caspase-3 检测试剂盒测caspase-3 活性。 用p38拮抗剂SB203580孵育细胞2h， 之后缺氧/再给氧， 观察SB203580对细胞存活率和caspase-3活性的影响。 结果： PC12细胞缺氧/再给氧后caspase-3 活性明显增加并使细胞存活率下降， SB203580明显降低缺氧/复氧后caspase-3的活性并使细胞死亡减少。 结论： PC12细胞缺氧/再给氧后至少可以通过激活p38、caspase-3信号分子诱导PC12细胞死亡。
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Effects of p38 Kinase in PC12 Cellular Injury Induced by Hypoxia/Reoxygenation
Luo Cheng-Yi，Xu Ru-Xiang，Zou Yu-Xi，Yang Zhi-Lin，Dai Yi-Wu
(Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, The First Military Medical
University, Guangzhou510282)
Abstract Objective： To study signal transduction pathway of hypoxia reoxygenation inducing PC12 cell death. Methods: PC12 cells were submitted to hypoxia (95%N2/5%CO2) for 6 h 37℃， then returned to standard incubation chamber (95%O2/5%CO2, 37℃), afterwards at different time points cell survival rate was quantified by MTT assay and caspase-3 activity was measured with caspase-3 assay kits; Before hypoxia/reoxygenation, cells were incubated with SB203580 for 2h, the effects of SB293580 on caspase-3 activity and cell survival were detected. Results:Hypoxia/reoxygenation increased caspase-3 activity and decreased cell survival rate significantly in PC12 cell; SB203580 reduced caspase- activity and decreased cell death induce by hypoxia/reoxygenation. Conclusion: Hypoxia/reoxygenation might induce PC12 cell death through the activation of p38 and then caspase-3.
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Key words Hypoxia/reoxygenation; Cell death; Signal transduction; PC12 cell
缺血缺氧性损伤是创伤性或缺血性脑损伤等神经系统疾病中普遍存在的病理生理现象， 一旦发生会导致迟发性细胞死亡， 而神经细胞比其他脑细胞对氧供应的减少更敏感、 缺血又伴随着缺氧， 因此研究缺氧/再给氧条件下神经细胞死亡的发生机理有助于对这些神经疾病的认识。 尽管培养细胞只能充当一种简单的模型， 但它们有助于理解涉及许多疾病的细胞和分子机理。 有研究发现从PC12细胞培养液中撤离NGF(nerve growth factor)会引起p38激酶的激活并导致细胞死亡的发生[1]， 但在PC12细胞中缺氧/复氧能否活化p38激酶以及引起细胞死亡的作用途径未见报道。 目前越来越多的实验揭示许多刺激作用于细胞， 通过一定的途径最后激活凋亡蛋白酶caspase家族而导致细胞的死亡[2]， 但caspase激活与PC12细胞死亡关系的研究并不多。 为此本实验在培养的PC12细胞上， 观察p38拮抗剂SB203580对缺氧/复氧后不同时间点细胞存活率和caspase-3活性变化的影响， 以探讨缺氧/复氧引起PC12细胞死亡的信号转导途径。
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材 料 与 方 法
1. 主要试剂：
p38拮抗剂(SB203580)、 caspase-3拮抗剂(caspase-3 inhibitorⅡ)购自Calbiochem-Novabiochem Corporation La Jolla, CA; 噻唑篮(Thiazolyl blue, MTT)购自Sino-American Biotec; caspase-3 活性检测试剂盒购自CLONTECH Laboratories, Inc; RPMI 1640 为Sigma产品。
2. 细胞培养
PC12细胞用含10%无支原体小牛血清的RPMI 1640培养基， 在37℃、 5%CO2条件下正常孵育， 按以下分组进行实验。
实验分组： (1)正常组： 细胞正常培养， 不加任何处理； (2)缺氧/复氧处理组： 将正常生长的PC12细胞培养瓶置于含95%N2/5%CO2混合气体的培养箱内， 37℃下卵育6h， 之后放回正常培养箱内培养； 继续孵育3、 6、 12、 24h后观测caspase-3活性和细胞存活率；(3)Caspase- inhibitorⅡ加缺氧/复氧处理组： PC12细胞先加caspase-3 inhibitorⅡ100μmol/L(终浓度)卵育2h再按前述方法作缺氧/复氧处理， 继续共同卵育3、6、12、24h后测细胞存活率；(4)SB203580加缺氧/复氧处理组： PC12细胞先加SB203580(终浓度为20μmol/L)卵育2h， 再按前述方法作缺氧/复氧处理， 继续培养3、 6、 12、 24h后观测caspase-3活性和细胞存活率。
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3. 细胞存活率的检测
用MTT法[3]测细胞存活率： 按实验设计于药物作用后加10μl MTT(5mg/ml)继续孵育2h， 用0.04N HCl/异丙醇裂解细胞， 之后用紫外分光光度计在575nm和620nm波长处测其吸收值， 差值表示存活率； 正常组吸收差值代表100%存活， 处理组与正常组的差值之比代表相对存活率。
4. Caspase-3活性的检测
按Caspase-3活性检测试剂盒进行， 简述如下： 正常组或处理组的细胞200×g离心10 min， 去除上清； 50μl冰冷细胞裂解缓冲液重悬细胞， 冰上孵育10 min； 12000 rpm， 4℃离心细胞裂解液3 min； 将上清液转到新的微量离心管； 每管加50μl的2×反应缓冲液(使用前1ml的2×反应缓冲液加1.0mol/L DTT 10μl)， 再加1.0mmol/L Caspase-3底物DEVD-pNA 5μl， 37℃水浴孵育1h； 紫外分光光度计测405nm波长处的吸收值， 酶的相对活性用处理组与正常组的吸收值之比表示， 设正常组的活性为1。
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结 果
1. 经缺氧/复氧处理后3、 6、 12、 24h细胞存活率均明显下降， 与正常组比较差异显著(见图1)。
图1 缺氧/再给氧后PC12细胞的存活率
2. Caspase-3 inhibitorⅡ加缺氧/复氧处理组及SB203580 加缺氧/复氧处理组与缺氧/复氧处理组比较， 细胞存活率明显增加； 两种拮抗剂均未完全阻断细胞死亡(见图2)。
图2 不同处理对PC12细胞存活率的影响
3. 缺氧/复氧处理PC12细胞， 在观察时间内Caspase-3活性逐渐增加， SB203580加缺氧/复氧处理使Caspase-3活性下降， 与缺氧/复氧处理组比较有显著差异， 但未能使Caspase-3活性达到正常(见图3)。
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图3 不同处理对PC12细胞Caspase-3活性的影响
讨 论
许多临床和实验研究发现脑缺血缺氧的时间和程度与脑功能损害程度成正相关， 神经细胞对缺血缺氧的耐受力差， 因此可以认为研究缺血缺氧对神经细胞的损伤机理是研究缺血缺氧性脑损害的核心。目前普遍认为脑缺血缺氧后神经细胞不仅存在坏死同时还有凋亡， 但缺血缺氧引起神经细胞凋亡的信号转导途径仍不完全清楚。 由于缺血必然导致缺氧， 因此利用体外培养细胞缺氧模型所得的研究结果可以帮助解释在体缺血缺氧性脑损害的发生机理。 本实验发现PC12细胞缺氧/再给氧后， 在观察时间内其存活率进行性下降， 证明缺氧/再给氧可以引起PC12细胞的死亡。 实验亦揭示缺氧再给氧后Caspase-3活性逐渐升高， 使用Caspase-3拮抗剂能明显增加细胞的存活率， 据此认为缺血再给氧引起PC12细胞的死亡与Caspase-3的活化关系密切。 Caspase是天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶超家族， Caspase-3是其中的一个重要成员； 活化后使特异性底物裂解、 切断目标细胞与周围细胞的联系、 细胞骨架改变、 DNA复制和修复能力降低等， 最终使细胞解体形成凋亡小体， 普遍认为Caspase-3是引起细胞凋亡的重要因素[4]。 因此本研究揭示了NO可以通过一定的途径活化Caspase-3而诱导PC12细胞凋亡性死亡。
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p38激酶属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员， 这类激酶参与细胞分裂分化等生理过程， 亦有文献报道[1]在培养的PC12细胞中撤离神经生长因子会引起p38激酶的磷酸化而导致细胞的凋亡， 并认为p38激酶作为一种信号分子在细胞凋亡中发挥着重要作用， 但缺氧/再给氧能否激活PC12细胞中的p38激酶以及活化的p38激酶通过何种途径导致PC12细胞凋亡还存在很多争议。 为探索其机理， 我们首先用p38拮抗剂孵育细胞抑制p38激酶激活， 之后给予缺氧/再给氧处理， 观测Caspase-3的活性和细胞的生存率， 发现p38拮抗剂明显降低了Caspase-3活性并减少缺氧引起的细胞死亡。 从这些实验结果推测缺氧/再给氧至少可以通过活化p38激酶而导致细胞凋亡并且p38激酶信号分子位于Caspase-3的上游。 p38是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 依赖于酪氨酸和苏氨酸残基的磷酸化而激活； 尽管本实验没有检测p38活性， 但很有可能由于缺氧的应急刺激使受体蛋白酪氨酸磷酸化， 引起p38上游激酶的活化并相继激活了p38激酶； 活化的p38激酶又可激活下游的激酶、酶或蛋白， 产生生物学作用[5]， 因此Caspase-3可能作为p38激酶的一种底物而受到激活， 促进细胞凋亡的发生。
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本课题受广东省自然科学基金资助(GD990416)
参考文献
1，Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, et al. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinase on apoptosis. Science 1995;270(24)∶1326-1331.
2，Namura S, Zhu J, Fink K, et al. Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia. J Neurosci 1998;18(10)∶3659-3668.
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3，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983;65(1-2)∶55～63.
4，Janicke RU, Sprengart ML, Wati MR, et al. Caspase-3 requierd for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis. J Biol Chem 1998;273(16)∶9360.
5，Karin M. Mitogen-activated protei kinase cascades as redulators of stress responses. Ann-N-Y-Acad-Sci 1998;851∶139～146.
(2000-7-26，收稿), http://www.100md.com