腺相关病毒载体与中枢神经系统疾病的基因治疗
作者：贺民 鞠延 毛伯镛
单位：华西医科大学附属第一医院神经外科 成都 610041
关键词：
华西医学000385[中图分类号]R373.9；R511 [文献标识码]D
[文章编号]1002-0179(2000)03-0379-02
中枢神经系统疾病分子改变的深入研究和基因治疗技术的不断发展为临床治疗这些疾病带来了希望。但基因治疗临床应用的最大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择。理想的体内基因转移载体应具有较好的细胞靶向性，目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行。自七十年代末病毒载体的概念提出以来，用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体种类日渐增加，应用也愈加广泛。其中，腺相关病毒(AAV)载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员。由于该系统最大的优点之一是它的安全性较好，并且最有可能发展成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的非病毒载体系统，因此倍受关注，并已开始应用于临床试验〔1〕。
, 百拇医药
1 腺相关病毒的结构及特点
腺相关病毒(AAV)是单链DNA微小病毒，它的复制需要辅助病毒的参与，例如腺病毒或单纯疱疹病毒等。目前，从人类和灵长类动物中分离出腺相关病毒有5种不同的血清型，分别命名为腺相关病毒Ⅰ型至Ⅴ型。血清学研究表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型腺相关病毒主要感染人群，Ⅳ型感染猴〔2〕。Ⅱ型和Ⅲ型病毒染色体基因全序列中有82%的同源性。Ⅳ型与Ⅱ型和Ⅲ型的同源性分别为75%和78%。目前广泛用于基因治疗研究的腺相关病毒载体主要基于Ⅱ型腺相关病毒(AAV2)。
AAV2染色体DNA的长度为4680bp，其中包含两个阅读框架，分别编码调节蛋白Rep(Rep78,Rep68,Rep52和Rep40)及结构蛋白Cap(VP1，VP2，和VP3)，它们的表达由P5，P19和P48启动子调控〔3〕。Rep蛋白能反式调控DNA的复制和转录。病毒染色体DNA两端为146bp的反转末端重复序列(ITR)，是病毒复制的起点，其中有Rep蛋白结合位点(RBS)。ITR能顺式调控病毒染色体的复制、包装、整合以及从宿主染色体中释放。AAV2的包壳为非封闭型的，直径约25nm，由VP1、VP2和VP3蛋白构成，其构成比为1∶1∶10〔4〕。
, 百拇医药
野生型腺相关病毒(wt-AAV)是广泛存在的微小病毒，目前尚未发现其在人体中致病〔5〕。AAV特异地整合入人类19号染色体长臂末端从而降低了插入突变的危险，且已整合入宿主细胞染色体的AAV前病毒非常稳定〔6〕。Wu等证实AAV能整合入神经元及其他非分裂细胞的染色体中〔7〕。与wt-AAV相比，重组腺相关病毒(rAAV)载体的染色体整合率较低，整合位点的特异性不高。rAAV载体介导的体内转基因研究表明，rAAV能有效长时间地在体内转导(从3月到1.5年)〔8〕。另外，AAV载体感染的宿主细胞范围广泛，在体内和体外实验中均能感染分裂和非分裂期细胞，包括神经细胞和胶质细胞。由于rAAV载体中去除了病毒所有的编码序列而仅保留145bp的ITRs，从而避免了野生型病毒的产生，明显减轻了靶组织中的细胞毒性和细胞免疫反应，这在中枢神经系统中的意义尤其重要。rAAV能进行高滴度制备，病毒颗粒非常稳定，能耐受多种物化因素的干扰，且能被纯化和浓缩。这些特点无疑有利于将来的临床应用。但是，目前基于AAV载体的转基因系统仍有许多不足：首先，rAAV中外源基因的长度一般不超过4.7Kb；其次，由于病毒染色体DNA为单链，因此，rAAV中外源基因在宿主细胞中转导和表达需将单链的载体DNA转化为双链DNA，而这一过程易收受基因毒性物质、放射线、热处理以及某些腺病毒基因等因素的干扰〔9〕。另外，rAAV载体整合的具体机制尚不完全清楚，而且与逆转录病毒和腺病毒载体系统相比，rAAV的制备和检测系统尚不完善。不过，随着研究的深入和技术的改进，上述问题会得到逐步的解决。
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2 重组相关病毒载体的制备
目前最常用制备rAAV载体的方法是“双质粒(载体质粒/辅助质粒)瞬时共转染系统”。载体质粒中AAV编码序列完全由外源目的基因取代，仅保留AAV两端145bp的ITRs，而辅助质粒则保留所有AAV编码序列而无ITRs。由于两个质粒之间无重复序列，AAV的基因表达产物是以反式作用方式提供，因此不发生野生型病毒序列的重组、复制或包装。双质粒共转染包装细胞(例如293细胞)后，在腺病毒参与下，辅助质粒产生的Rep和Cap蛋白对由载体质粒提供的rAAV DNA进行复制和包装，生成含有目的基因的重组腺相关病毒颗粒(rAAV)，后者可通过物理化学的方法使之从细胞核中释放出来，再经氯化铯密度离心法纯化，最后加热灭活残余腺病毒，得到所需的rAAV病毒颗粒。
上述rAAV制备方法仍存在许多不足：首先，该方法不够简便，制备出的具感染性的病毒滴度较低；另外，该方法中需辅助腺病毒参与，仍有造成污染的可能性。针对以上问题，研究者们采用了许多解决方案。Xiao等利用含有腺相关病毒基本辅助基因的质粒替代辅助腺病毒的作用，从而避免了在生产rAAV过程中使用腺病毒〔10〕。Grimm等进一步构建了既含AAV辅助功能又含腺病毒辅助功能的质粒pDG〔11〕。另外，研究者们通过改进包装细胞系，使之具有AAV辅助功能和/或腺病毒辅助功能，从而简化制备步骤，避免使用腺病毒，同时也提高了产量。Inoue等建立了能进行大量生产rAAV载体的细胞系，这无疑为临床应用奠定了基础〔12〕。Zhou等报道了无需包装细胞在体外制备rAAV载体，这在rAAV的制备方面也是一个重要的发展方向〔13〕。
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3 rAAV载体在CNS及其疾病中的研究
使目的基因特定脑神经元中表达一直是神经生物学研究的目标。Pallella等利用Ⅰ型单纯疱疹病毒作为载体，虽能使神经元中有效表达目的基因，但无法解决其带来的明显的神经毒性〔14〕。腺病毒作为CNS转基因载体虽无明显神经毒性，但该类载体游离于宿主细胞质中，目的基因表达短暂，若增加载体滴度仍会造成神经损害〔15〕。逆转录病毒转导率高，但外源基因随载体进入细胞后与细胞染色体整合是随机的，有可能导致细胞内癌基因的激活，另外，它仅能感染分裂期细胞。脂质体较病毒载体有许多优越性，它的转导无需受体，无免疫源性，安全性高且制备简单，主要缺点是外源基因表达短暂。近年来的研究发现，腺相关病毒载体(AAV)能克服上述许多问题。
由于AAV载体DNA中不含病毒编码序列，因此不会有病毒蛋白的表达，宿主唯一接触的病毒蛋白是病毒的衣壳蛋白，而后者进入宿主细胞后即被迅速降解，因此，AAV载体能将外源基因转导入组织细胞而不产生免疫反应。许多研究也证明，rAAV载体能有效转染脑和脊髓并使外源基因持续表达而不产生毒性反应。另外，rAAV载体感染的宿主范围广泛且能感染非分裂期细胞。大量的体内试验表明，rAAV能成功地转染脑，脊髓，眼，肌肉，肺，肠，心脏和肝脏。Kaplitt等首先报道rAAV载体在脑神经元中的表达超过4个月，因此具有治疗的价值〔16〕。McCown等也报道，在鼠脑的不同区域，特别是在下丘和嗅结节中，rAAV-LacZ载体能长时间地表达〔17〕。将rAAV载体注射到脑的不同区域(包括海马，尾状核，梨状皮质，嗅结节，下丘和小脑等)，主要能转导这些区域中的多极神经元细胞。但是，不同脑区的转导效能却不同。在一项含CMV即早启动子的rAAV-LacZ载体转导试验中发现，不同脑区转基因的表达效能为：海马、梨状皮质和下丘>嗅结节>尾状核〔17〕。rAAV对不同脑区转导效能不同的机制尚不清楚，可能与AAV受体多少，AAV由单链DNA转化成双链DNA的转化率大小，以及在不同细胞中CMV启动子的活性不同等因素有关。另外，在脑内转导研究中也发现，不同脑区中外源基因持续表达的时间也不同，例如，将rAAV分别注入海马与下丘，1周后两个区域的大多数神经元细胞中有外源基因的高表达，而3个月后海马中rAAV转导神经元的数量明显减少，而下丘中的阳性神经元却无明显丢失〔17〕。Xiao等认为这一现象主要可能与启动子功能关闭有关。
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目前用于中枢神经系统的rAAV载体中的启动子来自于病毒和细胞，包括CMV即早启动子，AAV P40，NSE和PDGF等等启动子。其中，CMV启动子应用最为广泛。Bartlett等再含CMV启动子的rAAV转染脑组织的研究中发现，rAAV载体被神经元细胞快速且选择性地摄取，外源基因在神经元中表达而星形细胞和小胶质细胞中则无表达〔18〕。相反，将含有GFAP启动子的rAAV载体注入CNS，转基因的表达主要见于胶质细胞。由此推测，在CNS中rAAV对不同细胞类型的转导与不同启动子类型密切相关。另外，rAAV中利用神经特异性启动子(例如，PDGFB链启动子和NSE启动子)转染脊髓的研究发现，神经元中的转导效能及基因表达持续时间明显超过含CMV启动子的rAAV。总之，最终应用于临床的rAAV中的启动子应该具有组织特异性和可调控性。
由于腺相关病毒作为载体的CNS转基因系统具有以上这些重要的特点，因此该转基因系统已开始广泛用于CNS疾病基因治疗的研究。目前的研究广泛涉及了CNS功能性疾病(帕金森氏病，癫闲等)、CNS肿瘤、基因缺陷性疾病、脑血管病、以及CNS自身免疫性疾病等等方面。其中帕金林氏病的基因治疗研究选择该系统的文献较多。帕金森氏病基因治疗策略包括两方面：一、通过转基因加强多巴胺的生物合成；二、减少多巴胺能神经元数量的丢失。Mandel等以AAV为载体，将人酪氨酸水解酶基因(hTH)转导入帕金森氏病模型鼠的纹状体神经元细胞中，发现hTH在纹状体神经元中长时间表达，并成功地加强了神经元中左旋多巴的生物合成〔19〕。Mandel同样仍利用该转基因系统将鼠胶质细胞衍生神经营养因子(rGDNF)注入鼠脑黑质内，发现rAAV系统能明显提高GDNF的功能水平，明显减少黑质内多巴胺能神经元数量的丢失〔20〕。作者同时认为该基因系统不仅有效且安全性好。随着该系统在CNS疾病中的广泛应用和深入研究，将对CNS疾病的基因治疗起到愈来愈重要的作用。
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4 结语
虽然腺相关病毒载体系统在CNS疾病基因治疗中有许多的优越性，但它本身仍存在许多局限性。例如，它所携带的外源基因长度有限，要使外源基因表达必须要使单链DNA转化为双链DNA，另外，作为病毒载体，宿主仍会对病毒衣壳产生免疫反应，还有野生型病毒污染存在的可能性等等方面。因此，在rAAV载体基础上，有作者构建了rAAV质粒，并结合脂质体的优点，构建了rAAV质粒-脂质体复合物作为非病毒基因转移载体系统。During等就利用该转基因系统针对Canavan氏病人在脑中进行基因治疗的研究。总之，随着载体系统研究的不断深入和发展，将会为中枢神经系统疾病的基因治疗提供有利的工具，最终将基因治疗推向临床。
参考文献
1，Flotte T,et al.Hum Gene Ther,1996;7∶1145.
2，Parks WP,et al.Infect Immun,1970;2∶716.
, 百拇医药
3，Blackolw NR,et al.Am J Epidemiol,1968;88∶368.
4，Buller BML,et al.J Virol,1978;25∶331.
5，Berns KI,et al.Adv Virus Res,1987;32∶243.
6，Samulski RJ,et al.EMBO J,1991;10∶3941.
7，Wu P,et al.J Virol,1998;72(7)∶5919.
8，Xiao X,et al.Exp Neurol,1997;114∶113.
9，Ferrari FK,et al.J Viro,1996;70∶3227.
, 百拇医药
10，Xiao X,et al.J Virol,1998;72(3)∶2224.
11，Grimm D,et al.Hum Gene Ther,1998;9∶2745.
12，Inoue N,et al.J Virol,1998;72(9)∶7024.
13，Zhou XH,et al.J Virol,1998;72(4)∶3241.
14，Palella TD,et al.Gene,1988;80∶137.
15，Akli S,et al.Nat Genet,1993;3∶224.
16，Kaplitt MG,et al.Nat Genet,1998;8∶148.
17，McCown TJ,et al.Brain Res,1996;713∶99.
18，Bartlett JS,et al.Hum Gene Ther,1998;9∶1181.
19，Manderl RJ,et al.J Neurosci,1998;18(11)∶4271.
20，Mandel RJ,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94(25)∶14083.
(收稿日期：2000-05-22), 百拇医药
单位：华西医科大学附属第一医院神经外科 成都 610041
关键词：
华西医学000385[中图分类号]R373.9；R511 [文献标识码]D
[文章编号]1002-0179(2000)03-0379-02
中枢神经系统疾病分子改变的深入研究和基因治疗技术的不断发展为临床治疗这些疾病带来了希望。但基因治疗临床应用的最大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择。理想的体内基因转移载体应具有较好的细胞靶向性，目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行。自七十年代末病毒载体的概念提出以来，用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体种类日渐增加，应用也愈加广泛。其中，腺相关病毒(AAV)载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员。由于该系统最大的优点之一是它的安全性较好，并且最有可能发展成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的非病毒载体系统，因此倍受关注，并已开始应用于临床试验〔1〕。
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1 腺相关病毒的结构及特点
腺相关病毒(AAV)是单链DNA微小病毒，它的复制需要辅助病毒的参与，例如腺病毒或单纯疱疹病毒等。目前，从人类和灵长类动物中分离出腺相关病毒有5种不同的血清型，分别命名为腺相关病毒Ⅰ型至Ⅴ型。血清学研究表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型腺相关病毒主要感染人群，Ⅳ型感染猴〔2〕。Ⅱ型和Ⅲ型病毒染色体基因全序列中有82%的同源性。Ⅳ型与Ⅱ型和Ⅲ型的同源性分别为75%和78%。目前广泛用于基因治疗研究的腺相关病毒载体主要基于Ⅱ型腺相关病毒(AAV2)。
AAV2染色体DNA的长度为4680bp，其中包含两个阅读框架，分别编码调节蛋白Rep(Rep78,Rep68,Rep52和Rep40)及结构蛋白Cap(VP1，VP2，和VP3)，它们的表达由P5，P19和P48启动子调控〔3〕。Rep蛋白能反式调控DNA的复制和转录。病毒染色体DNA两端为146bp的反转末端重复序列(ITR)，是病毒复制的起点，其中有Rep蛋白结合位点(RBS)。ITR能顺式调控病毒染色体的复制、包装、整合以及从宿主染色体中释放。AAV2的包壳为非封闭型的，直径约25nm，由VP1、VP2和VP3蛋白构成，其构成比为1∶1∶10〔4〕。
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野生型腺相关病毒(wt-AAV)是广泛存在的微小病毒，目前尚未发现其在人体中致病〔5〕。AAV特异地整合入人类19号染色体长臂末端从而降低了插入突变的危险，且已整合入宿主细胞染色体的AAV前病毒非常稳定〔6〕。Wu等证实AAV能整合入神经元及其他非分裂细胞的染色体中〔7〕。与wt-AAV相比，重组腺相关病毒(rAAV)载体的染色体整合率较低，整合位点的特异性不高。rAAV载体介导的体内转基因研究表明，rAAV能有效长时间地在体内转导(从3月到1.5年)〔8〕。另外，AAV载体感染的宿主细胞范围广泛，在体内和体外实验中均能感染分裂和非分裂期细胞，包括神经细胞和胶质细胞。由于rAAV载体中去除了病毒所有的编码序列而仅保留145bp的ITRs，从而避免了野生型病毒的产生，明显减轻了靶组织中的细胞毒性和细胞免疫反应，这在中枢神经系统中的意义尤其重要。rAAV能进行高滴度制备，病毒颗粒非常稳定，能耐受多种物化因素的干扰，且能被纯化和浓缩。这些特点无疑有利于将来的临床应用。但是，目前基于AAV载体的转基因系统仍有许多不足：首先，rAAV中外源基因的长度一般不超过4.7Kb；其次，由于病毒染色体DNA为单链，因此，rAAV中外源基因在宿主细胞中转导和表达需将单链的载体DNA转化为双链DNA，而这一过程易收受基因毒性物质、放射线、热处理以及某些腺病毒基因等因素的干扰〔9〕。另外，rAAV载体整合的具体机制尚不完全清楚，而且与逆转录病毒和腺病毒载体系统相比，rAAV的制备和检测系统尚不完善。不过，随着研究的深入和技术的改进，上述问题会得到逐步的解决。
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2 重组相关病毒载体的制备
目前最常用制备rAAV载体的方法是“双质粒(载体质粒/辅助质粒)瞬时共转染系统”。载体质粒中AAV编码序列完全由外源目的基因取代，仅保留AAV两端145bp的ITRs，而辅助质粒则保留所有AAV编码序列而无ITRs。由于两个质粒之间无重复序列，AAV的基因表达产物是以反式作用方式提供，因此不发生野生型病毒序列的重组、复制或包装。双质粒共转染包装细胞(例如293细胞)后，在腺病毒参与下，辅助质粒产生的Rep和Cap蛋白对由载体质粒提供的rAAV DNA进行复制和包装，生成含有目的基因的重组腺相关病毒颗粒(rAAV)，后者可通过物理化学的方法使之从细胞核中释放出来，再经氯化铯密度离心法纯化，最后加热灭活残余腺病毒，得到所需的rAAV病毒颗粒。
上述rAAV制备方法仍存在许多不足：首先，该方法不够简便，制备出的具感染性的病毒滴度较低；另外，该方法中需辅助腺病毒参与，仍有造成污染的可能性。针对以上问题，研究者们采用了许多解决方案。Xiao等利用含有腺相关病毒基本辅助基因的质粒替代辅助腺病毒的作用，从而避免了在生产rAAV过程中使用腺病毒〔10〕。Grimm等进一步构建了既含AAV辅助功能又含腺病毒辅助功能的质粒pDG〔11〕。另外，研究者们通过改进包装细胞系，使之具有AAV辅助功能和/或腺病毒辅助功能，从而简化制备步骤，避免使用腺病毒，同时也提高了产量。Inoue等建立了能进行大量生产rAAV载体的细胞系，这无疑为临床应用奠定了基础〔12〕。Zhou等报道了无需包装细胞在体外制备rAAV载体，这在rAAV的制备方面也是一个重要的发展方向〔13〕。
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3 rAAV载体在CNS及其疾病中的研究
使目的基因特定脑神经元中表达一直是神经生物学研究的目标。Pallella等利用Ⅰ型单纯疱疹病毒作为载体，虽能使神经元中有效表达目的基因，但无法解决其带来的明显的神经毒性〔14〕。腺病毒作为CNS转基因载体虽无明显神经毒性，但该类载体游离于宿主细胞质中，目的基因表达短暂，若增加载体滴度仍会造成神经损害〔15〕。逆转录病毒转导率高，但外源基因随载体进入细胞后与细胞染色体整合是随机的，有可能导致细胞内癌基因的激活，另外，它仅能感染分裂期细胞。脂质体较病毒载体有许多优越性，它的转导无需受体，无免疫源性，安全性高且制备简单，主要缺点是外源基因表达短暂。近年来的研究发现，腺相关病毒载体(AAV)能克服上述许多问题。
由于AAV载体DNA中不含病毒编码序列，因此不会有病毒蛋白的表达，宿主唯一接触的病毒蛋白是病毒的衣壳蛋白，而后者进入宿主细胞后即被迅速降解，因此，AAV载体能将外源基因转导入组织细胞而不产生免疫反应。许多研究也证明，rAAV载体能有效转染脑和脊髓并使外源基因持续表达而不产生毒性反应。另外，rAAV载体感染的宿主范围广泛且能感染非分裂期细胞。大量的体内试验表明，rAAV能成功地转染脑，脊髓，眼，肌肉，肺，肠，心脏和肝脏。Kaplitt等首先报道rAAV载体在脑神经元中的表达超过4个月，因此具有治疗的价值〔16〕。McCown等也报道，在鼠脑的不同区域，特别是在下丘和嗅结节中，rAAV-LacZ载体能长时间地表达〔17〕。将rAAV载体注射到脑的不同区域(包括海马，尾状核，梨状皮质，嗅结节，下丘和小脑等)，主要能转导这些区域中的多极神经元细胞。但是，不同脑区的转导效能却不同。在一项含CMV即早启动子的rAAV-LacZ载体转导试验中发现，不同脑区转基因的表达效能为：海马、梨状皮质和下丘>嗅结节>尾状核〔17〕。rAAV对不同脑区转导效能不同的机制尚不清楚，可能与AAV受体多少，AAV由单链DNA转化成双链DNA的转化率大小，以及在不同细胞中CMV启动子的活性不同等因素有关。另外，在脑内转导研究中也发现，不同脑区中外源基因持续表达的时间也不同，例如，将rAAV分别注入海马与下丘，1周后两个区域的大多数神经元细胞中有外源基因的高表达，而3个月后海马中rAAV转导神经元的数量明显减少，而下丘中的阳性神经元却无明显丢失〔17〕。Xiao等认为这一现象主要可能与启动子功能关闭有关。
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目前用于中枢神经系统的rAAV载体中的启动子来自于病毒和细胞，包括CMV即早启动子，AAV P40，NSE和PDGF等等启动子。其中，CMV启动子应用最为广泛。Bartlett等再含CMV启动子的rAAV转染脑组织的研究中发现，rAAV载体被神经元细胞快速且选择性地摄取，外源基因在神经元中表达而星形细胞和小胶质细胞中则无表达〔18〕。相反，将含有GFAP启动子的rAAV载体注入CNS，转基因的表达主要见于胶质细胞。由此推测，在CNS中rAAV对不同细胞类型的转导与不同启动子类型密切相关。另外，rAAV中利用神经特异性启动子(例如，PDGFB链启动子和NSE启动子)转染脊髓的研究发现，神经元中的转导效能及基因表达持续时间明显超过含CMV启动子的rAAV。总之，最终应用于临床的rAAV中的启动子应该具有组织特异性和可调控性。
由于腺相关病毒作为载体的CNS转基因系统具有以上这些重要的特点，因此该转基因系统已开始广泛用于CNS疾病基因治疗的研究。目前的研究广泛涉及了CNS功能性疾病(帕金森氏病，癫闲等)、CNS肿瘤、基因缺陷性疾病、脑血管病、以及CNS自身免疫性疾病等等方面。其中帕金林氏病的基因治疗研究选择该系统的文献较多。帕金森氏病基因治疗策略包括两方面：一、通过转基因加强多巴胺的生物合成；二、减少多巴胺能神经元数量的丢失。Mandel等以AAV为载体，将人酪氨酸水解酶基因(hTH)转导入帕金森氏病模型鼠的纹状体神经元细胞中，发现hTH在纹状体神经元中长时间表达，并成功地加强了神经元中左旋多巴的生物合成〔19〕。Mandel同样仍利用该转基因系统将鼠胶质细胞衍生神经营养因子(rGDNF)注入鼠脑黑质内，发现rAAV系统能明显提高GDNF的功能水平，明显减少黑质内多巴胺能神经元数量的丢失〔20〕。作者同时认为该基因系统不仅有效且安全性好。随着该系统在CNS疾病中的广泛应用和深入研究，将对CNS疾病的基因治疗起到愈来愈重要的作用。
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4 结语
虽然腺相关病毒载体系统在CNS疾病基因治疗中有许多的优越性，但它本身仍存在许多局限性。例如，它所携带的外源基因长度有限，要使外源基因表达必须要使单链DNA转化为双链DNA，另外，作为病毒载体，宿主仍会对病毒衣壳产生免疫反应，还有野生型病毒污染存在的可能性等等方面。因此，在rAAV载体基础上，有作者构建了rAAV质粒，并结合脂质体的优点，构建了rAAV质粒-脂质体复合物作为非病毒基因转移载体系统。During等就利用该转基因系统针对Canavan氏病人在脑中进行基因治疗的研究。总之，随着载体系统研究的不断深入和发展，将会为中枢神经系统疾病的基因治疗提供有利的工具，最终将基因治疗推向临床。
参考文献
1，Flotte T,et al.Hum Gene Ther,1996;7∶1145.
2，Parks WP,et al.Infect Immun,1970;2∶716.
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7，Wu P,et al.J Virol,1998;72(7)∶5919.
8，Xiao X,et al.Exp Neurol,1997;114∶113.
9，Ferrari FK,et al.J Viro,1996;70∶3227.
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10，Xiao X,et al.J Virol,1998;72(3)∶2224.
11，Grimm D,et al.Hum Gene Ther,1998;9∶2745.
12，Inoue N,et al.J Virol,1998;72(9)∶7024.
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14，Palella TD,et al.Gene,1988;80∶137.
15，Akli S,et al.Nat Genet,1993;3∶224.
16，Kaplitt MG,et al.Nat Genet,1998;8∶148.
17，McCown TJ,et al.Brain Res,1996;713∶99.
18，Bartlett JS,et al.Hum Gene Ther,1998;9∶1181.
19，Manderl RJ,et al.J Neurosci,1998;18(11)∶4271.
20，Mandel RJ,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94(25)∶14083.
(收稿日期：2000-05-22), 百拇医药