气管内应用IL-18重组腺病毒对实验性肺转移癌的治疗作用
作者：陈吉泉 曹雪涛 修清玉 于益芝 罗文侗
单位：陈吉泉(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；曹雪涛(基础医学部免疫学教研室)；修清玉(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；于益芝(基础医学部免疫学教研室)；罗文侗(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)
关键词：白细胞介素18；重组腺病毒；肿瘤，转移；基因疗法；肺肿瘤
第二军医大学学报000614 【摘要】 目的：研究气管内应用白细胞介素18(IL-18)重组腺病毒(AdIL-18)对实验性肺转移癌的治疗作用。方法：(1)小鼠气管内滴入AdIL-18后，以RT-PCR法检测小鼠肺组织中IL-18 mRNA表达，ELISA法测定局部及外周血IL-18及其相关因子的水平。(2)C57BL/6小鼠尾静脉注射Lewis肺癌3LL细胞以建立肺转移癌模型，观察气管内应用AdIL-18对实验性肺转移癌的治疗作用，包括肺转移结节数、动物存活期、存活率变化等，并比较自然杀伤(NK)细胞和细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性。结果：(1)气管内应用AdIL-18后6 h,小鼠肺内即可检测到IL-18 mRNA 表达；72 h后肺灌洗液中可测到IL-18，且高于外周血水平，而对照组肺灌洗液及外周血中均未检测到。(2)气管内滴入AdIL-18对实验性肺转移癌有治疗作用，可使肺转移结节减少、动物的存活期延长及存活率升高，同时对NK细胞、CTL活性有增强作用。结论：气管内应用IL-18重组腺病毒后可有效表达，并对实验性肺转移癌有治疗作用。
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【中图分类号】 R 734.2； R 392.1 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0547-04
Effect of intratracheal administration of recombinant adenovirus containing IL-18 gene in treatment of experimental lung metastasis
CHEN Ji-Quan，XIU Qing-Yu，LUO Wen-Tong
(Department of Respiratory Medicine, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
CAO Xue-Tao，YU Yi-Zhi
(Department of Immunology, Department of Basic Medicine)
【ABSTRACT】 Objective: To study the treatment of experimental lung metastasis by intratracheal injection of IL-18 gene recombinant adenovirus. Methods: (1)The mouse IL-18 mRNA was detected by RT-PCR, the concentrations of IL-18， associated cytokines in lung lavage and blood were determined by ELISA at different times after intratracheal injection of IL-18 recombinant adenovirus. (2)The lung metastasis nodes, mouse survival period, survival rates were investigated in the treatment of experimental lung metastasis in C57BL/6 mouse model. The NK activity and CTL activity were determined by 51 Cr 4 h release method. Results: (1)The IL-18 mRNA could be detected in lung tissue 6 h after intratracheal use of IL-18 recombinant adenovirus, and the concentrations of IL-18 in lung lavage was higher than that of peripheral blood, and both IL-18 mRNA and IL-18 could not be detected in control groups. (2)Intratracheal use of IL-18 recombinant adenovirus had significant therapeutic effect on experimental lung metastasis with the results of increased CTL and NK activity, and with longer survival period and higher survival rates compared with the control groups. Conclusion: Intratracheal usage of adenovirus vector containing IL-18 gene has therapeutic effect on the lung metastasis, denoting that gene therapy of lung diseases can be done through airway directly with recombinant adenovirus.
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【KEY WORDS】 interleukin-18; recombinant adenovirus; neoplasm metastasis; gene therapy; lung neoplasm
雾化吸入已用于肺部感染、哮喘、肺癌等疾病的治疗，方便、有效。有研究表明，吸入IL-2脂质体对狗黑素瘤的肺部转移有治疗作用[1]；对肺部疾病如肺囊性纤维化(CF)的雾化吸入的基因治疗，也已取得较好疗效[2]。白细胞介素18(IL-18)为新近发现的具有抗肿瘤作用的细胞因子，设想气管内应用IL-18重组腺病毒(AdIL-18)对肺部的原发性及转移肿瘤将有一定的治疗和预防作用，同时可减低全身的毒副作用，并增强因子局部的有效浓度和持续时间。我们以β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因重组腺病毒气管内应用，继以X-gal染色，已表明重组腺病毒在气管内可有效表达(另文发表)，在此基础上在气管内应用具有抗肿瘤作用的小鼠IL-18重组腺病毒，观察其对实验性肺转移癌的治疗作用。
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1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/6(H-2kb)小鼠，雌性，6～8周龄，购自上海中英合资西普尔-必凯实验动物有限公司。3LL细胞为起源于C57BL/6(H-2kb)小鼠的Lewis肺癌细胞株，由日本癌研究会肿瘤研究所Hamada博士惠赠，免疫原性低，转移性高。YAC-1细胞为NK细胞敏感细胞株，用于测定NK细胞活性,由本校免疫学教研室保存。LacZ重组腺病毒(AdLacZ)由日本癌研究会肿瘤研究所Hamada博士惠赠，滴度为3×109 pfu/ml。含信号肽的小鼠IL-18重组腺病毒(AdIL-18)由本校免疫学教研室构建[3]，滴度为2×109 pfu/ml。核素标记的Na2CrO4 (51Cr)，3H掺入脱氧胸腺嘧啶(3H-TdR)购自Amersham公司，RPMI 1640和DMEM培养基购自Gibco公司。小鼠IL-2 和IFNγELISA检测试剂盒购自Endogen公司。小鼠IL-18标准品购自PrproTech公司。
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1.2 小鼠气管内应用重组腺病毒后的体内表达研究
1.2.1 实验分组 C57BL/6小鼠戊巴比妥钠麻醉后固定，暴露气管，气管注入50～100 μl(108 pfu)重组腺病毒或PBS，分3组：PBS，AdLacZ和AdIL-18组，每组6只动物。
1.2.2 IL-18 mRNA的检测 气管内给药后6 h, 处死小鼠，取肺组织，按常规方法抽提总RNA，纯化后行RT-PCR检测。上游引物为5′-CTCATCCTTCTGTTTCATTC，下游引物为5′-GGGTCACAGCCAGTCCTC，预计产物大小为220 bp，操作按文献[3]方法进行。
1.2.3 外周血及肺灌洗液中细胞因子检测 气管内给药后72 h，采用ELISA方法检测肺灌洗液及外周血中IL-2，IFNγ及IL-18水平[3]。
, 百拇医药 1.3 小鼠气管内应用重组腺病毒对实验性肺转移癌的治疗作用观察
1.3.1 实验性肺转移癌模型的建立 取对数生长期的3LL细胞，以Hank液配成1×106个/ml的细胞密度，每只C57BL/6小鼠经尾侧静脉注射100 μl。
1.3.2 AdIL-18对实验性肺转移癌的治疗作用 实验分PBS对照组、AdLacZ对照组、AdIL-18治疗组，每组10只动物。建立实验性肺转移癌模型后3 d，气管内滴入重组腺病毒1×108 pfu或PBS，观察动物的存活期和存活率。荷瘤后21 d，当对照组小鼠开始死亡时，处死各组小鼠，解剖，显微镜下计数肺表面结节。
1.3.3 NK细胞活性和细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性的测定 治疗后2周，按文献[4]的51Cr释放法测定各组小鼠脾脏细胞的NK细胞活性和CTL活性。
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1.4 统计学处理 采用t检验及χ2检验，存活期比较用时序检验， P<0.05为相差显著性界限。
2 结 果
2.1 气管内应用AdIL-18后肺组织及外周血中IL-18的表达 RT-PCR检测结果(图1)表明，气管内应用AdIL-18后6 h，小鼠肺组织中即可检出特异性的IL-18 mRNA，而PBS对照组及AdLacZ组则均未检出。
图 1 AdIL-18气管内应用后IL-18 mRNA的肺内表达
Fig 1 Expression of IL-18 mRNA in lung tissue
after intratracheal usage of AdIL-18
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1，2: β-actin； 3： AdLacZ negative control group;
4： AdIL-18 group(220 bp IL-18 mRNA)； 5: Marker
气管内用药后72 h,肺泡灌洗液及外周血中的细胞因子水平见表1。结果表明，气管内应用AdIL-18后，肺泡灌洗液中可检测到IL-18，且水平高于外周血(P<0.01)，而正常对照组和AdLacZ对照组肺泡灌洗液和外周血中均未检测到IL-18。同时，实验组肺灌洗液和外周血中的IL-2和IFNγ水平明显升高(P<0.01),提示气管内应用AdIL-18可有效表达IL-18，并诱导IL-2和IFNγ的产生。
2.2 气管内应用IL-18重组腺病毒对转移性肺癌的治疗作用
2.2.1 治疗后3LL肺转移癌小鼠的NK细胞及CTL活性 气管内应用重组腺病毒后2周，AdIL-18组小鼠脾细胞的NK细胞活性为(49.5±5.6)%，明显高于PBS对照组的(18.9±3.4)%和AdLacZ对照组的(19.2±3.5)% (P<0.01),而两个对照组间则无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，AdIL-18治疗组能诱导出一定程度的CTL(P<0.01),见图2。
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2.2.2 肺表面转移结节比较 实验性转移性肺癌模型建立后3 d，气管内应用AdIL-18，21 d后取肺脏计数表面转移结节，发现应用AdIL-18的荷瘤小鼠的肺转移结节数(11.2±4.3)明显少于PBS(72.4±5.6)和AdLacZ对照组(71.5±6.3) (P<0.01)。
2.2.3 存活期及存活率差异 如图3所示，观察90 d，气管应用IL-18重组腺病毒组的存活期及存活率明显高于BPS对照组和AdLacZ对照组(P<0.01)，而PBS和AdLacZ对照组间则无明显差异(P>0.05)。
表 1 AdIL-18气管内应用后灌洗液及外周血细胞因子水平
Tab 1 Concentrations of the cytokines in the lung lavages and peripheral blood after intratracheal usage of AdIL-18(n=6,
±s, ρB/pg*ml-1) Group
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IL-2
IFNγ
IL-18
LA
PB
LA
PB
LA
PB
AdIL-18
636±45**△△
876±15**△△
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521±38△△
475±34△△
187±5▲▲
44±6
AdLacZ
224±39**
116±30**
90±20
70±25
Control
64±23
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61±33
LA:Lung lavage; PB: Peripheral blood; **P<0.01 vs control group; △△P<0.01 vs AdLacZ group; ▲▲P<0.01 vs peripheral blood
图 2 气管内应用AdIL-18后体内CTL活性变化
Fig 2 Effect of intratracheal usage of
AdIL-18 on the CTL activity
○:PBS;□:AdLacZ;▲:AdIL-18
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图 3 气管内应用AdIL-18后对实验性
肺转移癌的治疗作用
Fig 3 Treatment of experimental lung metastasis by
intratracheal usage of AdIL-18
○:PBS;□:AdLacZ;▲:AdIL-18
3 讨 论
基因治疗是近年发展起来的医学新领域，已从基础研究转入临床试验，部分研究已取得令人鼓舞的结果[5～7]。肺部疾病的局部基因治疗有其优势：首先人肺部具有丰富的上皮组织和内皮细胞，表面积可达80 m2，利于外源基因导入；其次，特异性受体细胞易从支气管肺部灌洗液或肺活检中取得，便于对导入基因的表达及治疗效果进行观察[2,8,9]。目前，已有数百个纯化基因适于导入肺内，对肺内基因工程表达的基因调控也已有较多了解。
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用于肺部基因治疗的载体中,重组腺病毒有其独特优点：容量大(36 kb)，易制备、提取、浓缩及纯化，可获高滴度 (可达109～1012 pfu/ml) 腺病毒；安全性高，不整合至宿主细胞染色体，无插入突变和激活原癌基因或使抑癌基因失活的危险；转染效率高，能感染分裂期及静止期细胞，并能感染所有类型的气管上皮细胞包括纤维上皮细胞、分泌细胞、基底细胞和未分化细胞等，为治疗基因直接感染呼吸道上皮提供了可能[2,8,9]。我们以C57BL/6小鼠为模型，气管内滴入含LacZ基因的重组腺病毒AdLacZ，X-gal染色提示，滴入后6 h气管内即可见LacZ基因的表达，48 h达高峰，至28 d时仍有明显的表达(另文发表)。国外有气管内LacZ PCR检测阳性可达90 d的报道。囊性纤维跨膜电信号传导调节子(CFTR)基因重组腺病毒气管内滴入，其基因的表达可持续6周。SD大鼠气管内滴入IL-6重组腺病毒(Ad5rIL-6)后可有效表达，肺泡灌洗液中检出IL-6的同时，血清中仅测到微量IL-6，表明气管内滴入的病毒均保留在肺内[9]。我们给小鼠气管内滴入IL-18重组腺病毒后，对肺灌洗液和血清中IL-18及IFNγ的检测结果亦支持上述结论。表明重组腺病毒在对呼吸系统的直接转染中是一种高效载体。
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肺癌的基因治疗是目前研究热点，包括：肿瘤生物基因治疗、反义基因治疗、自杀基因治疗和基因置换治疗及补充治疗等。气管内应用具有抗肿瘤作用的药物或重组腺病毒具有明显的抗肿瘤作用。研究表明，气管内吸入IL-2脂质体可有效治疗狗黑素瘤的肺部转移，而气管内滴入108 pfu的构建好的血管内皮生长因子(VEGF)受体flt-1细胞外段的腺病毒载体，对BALB/c小鼠的C26细胞的肺部转移有明显的治疗作用[8]。
IL-18为新发现的具有抗肿瘤作用的细胞因子，可诱导IFNγ产生，明显增强NK活性及Th1型免疫反应，与IL-12具有协同作用[10]，其抗肿瘤作用与诱导产生的IFNγ、抑制血管形成、增强的Th1型反应有关，还与IL-18体内诱导的免疫记忆及产生杀伤性CD4+ T有关[5,10]。以IL-18预处理可保护小鼠对同基因肿瘤细胞的攻击，并对已形成的肿瘤有治疗作用[5,6]；转染IL-18基因的肿瘤细胞成瘤速度减慢、成瘤率减低，动物存活期延长[7]。我们采用重组技术构建了含信号肽的小鼠IL-18基因的腺病毒(AdIL-18)，气管内应用后，72 h及第8天均在灌洗液中和血清中可检测到IL-18，且灌洗液中的水平高于血浆中的水平，血浆中产生的IFNγ的水平亦明显升高，表明产生的IL-18产生了免疫学效应。气管内应用AdIL-18，对3LL肿瘤的肺转移有明显抑制作用，动物存活期明显延长，肺部转移结节数明显减少。同时发现AdIL-18气管内应用后对CTL和NK细胞活性有增强作用。
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本研究结果表明，气管内应用具有抗肿瘤作用的AdIL-18后可有效表达，且局部灌洗液中IL-18的水平明显高于外周血水平，有效激活了机体的免疫机能；对实验性肺转移癌也有一定的治疗作用，为肺部肿瘤的防治提供了一种新途径。
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39730420)
【作者简介】陈吉泉(1967～)，男(汉族)，博士，主治医师
【参考文献】
[1] Khanna C, Anderson PM, Hasz DE， et al. Interleukin-2 liposome inhalation therapy is safe and effective for dogs with spontaneous pulmonary metastases[J]. Cancer,1997, 79(7):1409-1421.
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[2] Rosenfeld MA, Yoshimura K, Trapnell BG， et al. In vivo transfer of the human systic fiberosis transmembrane conductance regulator gene to the airway epithelium[J]. Cell, 1992,68(1): 143-155.
[3] 陈吉泉, 曹雪涛，修清玉，等. IL-18基因修饰的树突状细胞的表型分析及免疫刺激活性[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1999，6(2):111-116.
[4] Cao X, Zhang W, He L, et al.Lymphotactin gene-modified bone marrow dendritic cells act as more potent adjuvants for peptide delivery to induce specific antitumor immunity[J]. J Immunol, 1998, 161(11):6238-6244.
, 百拇医药
[5] Micallef MJ, Yoshida K, Kawai S， et al. In vivo antitumor effects of murine interferon-gamma-inducing factor/interleukin-18 in mice bearing syngeneic Meth A sarcoma malignant ascites[J]. Cancer Immunol Immunother, 1997, 57(20): 4557-4563.
[6] Osaki T, Peron JM,Cai Q， et al. IFN-gamma-inducing factor/IL-18 administration mediates IFN-gamma- and IL-12-independent antitumor effects[J]. J Immunol, 1998, 160(4): 1742-1749.
[7] Fukumoto H, Nishio M, Nshio K， et al. Interferon-gamma-inducing factor gene transfection into Lewis lung carcinoma cells reduces tumorigenicity in vivo[J]. Jpn J Cancer Res, 1997, 88(5): 501-505.
, 百拇医药
[8] Kong HL, Hecht D, Song W, et al. Regional suppression of tumor growth by in vivo transfer of a cDNA encoding a serected form of the extracellular domain of the flt-1 vascular endothelial growth factor receptor[J]. Human Gene Ther, 1998, 9(6): 823-833.
[9] Xing Z, Braciak T, Jordan M , et al. Adenovirus-mediates cytokine gene transfer at tissue sites. Overexpression of IL-6 induces lymphocytic hyperplasia in the lung[J]. J Immunol, 1994, 153(9): 4059-4069.
[10] Kohno K, Kataoka J, Ohtsuki T, et al. IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th2 cells and exerts its independently of IL-12[J]. J Immunol, 1997, 158(4): 1541-1550.
【收稿日期】1999-12-09
【修回日期】2000-04-11, http://www.100md.com
单位：陈吉泉(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；曹雪涛(基础医学部免疫学教研室)；修清玉(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)；于益芝(基础医学部免疫学教研室)；罗文侗(第二军医大学长征医院呼吸内科，上海 200003)
关键词：白细胞介素18；重组腺病毒；肿瘤，转移；基因疗法；肺肿瘤
第二军医大学学报000614 【摘要】 目的：研究气管内应用白细胞介素18(IL-18)重组腺病毒(AdIL-18)对实验性肺转移癌的治疗作用。方法：(1)小鼠气管内滴入AdIL-18后，以RT-PCR法检测小鼠肺组织中IL-18 mRNA表达，ELISA法测定局部及外周血IL-18及其相关因子的水平。(2)C57BL/6小鼠尾静脉注射Lewis肺癌3LL细胞以建立肺转移癌模型，观察气管内应用AdIL-18对实验性肺转移癌的治疗作用，包括肺转移结节数、动物存活期、存活率变化等，并比较自然杀伤(NK)细胞和细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性。结果：(1)气管内应用AdIL-18后6 h,小鼠肺内即可检测到IL-18 mRNA 表达；72 h后肺灌洗液中可测到IL-18，且高于外周血水平，而对照组肺灌洗液及外周血中均未检测到。(2)气管内滴入AdIL-18对实验性肺转移癌有治疗作用，可使肺转移结节减少、动物的存活期延长及存活率升高，同时对NK细胞、CTL活性有增强作用。结论：气管内应用IL-18重组腺病毒后可有效表达，并对实验性肺转移癌有治疗作用。
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【中图分类号】 R 734.2； R 392.1 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0547-04
Effect of intratracheal administration of recombinant adenovirus containing IL-18 gene in treatment of experimental lung metastasis
CHEN Ji-Quan，XIU Qing-Yu，LUO Wen-Tong
(Department of Respiratory Medicine, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
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CAO Xue-Tao，YU Yi-Zhi
(Department of Immunology, Department of Basic Medicine)
【ABSTRACT】 Objective: To study the treatment of experimental lung metastasis by intratracheal injection of IL-18 gene recombinant adenovirus. Methods: (1)The mouse IL-18 mRNA was detected by RT-PCR, the concentrations of IL-18， associated cytokines in lung lavage and blood were determined by ELISA at different times after intratracheal injection of IL-18 recombinant adenovirus. (2)The lung metastasis nodes, mouse survival period, survival rates were investigated in the treatment of experimental lung metastasis in C57BL/6 mouse model. The NK activity and CTL activity were determined by 51 Cr 4 h release method. Results: (1)The IL-18 mRNA could be detected in lung tissue 6 h after intratracheal use of IL-18 recombinant adenovirus, and the concentrations of IL-18 in lung lavage was higher than that of peripheral blood, and both IL-18 mRNA and IL-18 could not be detected in control groups. (2)Intratracheal use of IL-18 recombinant adenovirus had significant therapeutic effect on experimental lung metastasis with the results of increased CTL and NK activity, and with longer survival period and higher survival rates compared with the control groups. Conclusion: Intratracheal usage of adenovirus vector containing IL-18 gene has therapeutic effect on the lung metastasis, denoting that gene therapy of lung diseases can be done through airway directly with recombinant adenovirus.
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【KEY WORDS】 interleukin-18; recombinant adenovirus; neoplasm metastasis; gene therapy; lung neoplasm
雾化吸入已用于肺部感染、哮喘、肺癌等疾病的治疗，方便、有效。有研究表明，吸入IL-2脂质体对狗黑素瘤的肺部转移有治疗作用[1]；对肺部疾病如肺囊性纤维化(CF)的雾化吸入的基因治疗，也已取得较好疗效[2]。白细胞介素18(IL-18)为新近发现的具有抗肿瘤作用的细胞因子，设想气管内应用IL-18重组腺病毒(AdIL-18)对肺部的原发性及转移肿瘤将有一定的治疗和预防作用，同时可减低全身的毒副作用，并增强因子局部的有效浓度和持续时间。我们以β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因重组腺病毒气管内应用，继以X-gal染色，已表明重组腺病毒在气管内可有效表达(另文发表)，在此基础上在气管内应用具有抗肿瘤作用的小鼠IL-18重组腺病毒，观察其对实验性肺转移癌的治疗作用。
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1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/6(H-2kb)小鼠，雌性，6～8周龄，购自上海中英合资西普尔-必凯实验动物有限公司。3LL细胞为起源于C57BL/6(H-2kb)小鼠的Lewis肺癌细胞株，由日本癌研究会肿瘤研究所Hamada博士惠赠，免疫原性低，转移性高。YAC-1细胞为NK细胞敏感细胞株，用于测定NK细胞活性,由本校免疫学教研室保存。LacZ重组腺病毒(AdLacZ)由日本癌研究会肿瘤研究所Hamada博士惠赠，滴度为3×109 pfu/ml。含信号肽的小鼠IL-18重组腺病毒(AdIL-18)由本校免疫学教研室构建[3]，滴度为2×109 pfu/ml。核素标记的Na2CrO4 (51Cr)，3H掺入脱氧胸腺嘧啶(3H-TdR)购自Amersham公司，RPMI 1640和DMEM培养基购自Gibco公司。小鼠IL-2 和IFNγELISA检测试剂盒购自Endogen公司。小鼠IL-18标准品购自PrproTech公司。
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1.2 小鼠气管内应用重组腺病毒后的体内表达研究
1.2.1 实验分组 C57BL/6小鼠戊巴比妥钠麻醉后固定，暴露气管，气管注入50～100 μl(108 pfu)重组腺病毒或PBS，分3组：PBS，AdLacZ和AdIL-18组，每组6只动物。
1.2.2 IL-18 mRNA的检测 气管内给药后6 h, 处死小鼠，取肺组织，按常规方法抽提总RNA，纯化后行RT-PCR检测。上游引物为5′-CTCATCCTTCTGTTTCATTC，下游引物为5′-GGGTCACAGCCAGTCCTC，预计产物大小为220 bp，操作按文献[3]方法进行。
1.2.3 外周血及肺灌洗液中细胞因子检测 气管内给药后72 h，采用ELISA方法检测肺灌洗液及外周血中IL-2，IFNγ及IL-18水平[3]。
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1.3.1 实验性肺转移癌模型的建立 取对数生长期的3LL细胞，以Hank液配成1×106个/ml的细胞密度，每只C57BL/6小鼠经尾侧静脉注射100 μl。
1.3.2 AdIL-18对实验性肺转移癌的治疗作用 实验分PBS对照组、AdLacZ对照组、AdIL-18治疗组，每组10只动物。建立实验性肺转移癌模型后3 d，气管内滴入重组腺病毒1×108 pfu或PBS，观察动物的存活期和存活率。荷瘤后21 d，当对照组小鼠开始死亡时，处死各组小鼠，解剖，显微镜下计数肺表面结节。
1.3.3 NK细胞活性和细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性的测定 治疗后2周，按文献[4]的51Cr释放法测定各组小鼠脾脏细胞的NK细胞活性和CTL活性。
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1.4 统计学处理 采用t检验及χ2检验，存活期比较用时序检验， P<0.05为相差显著性界限。
2 结 果
2.1 气管内应用AdIL-18后肺组织及外周血中IL-18的表达 RT-PCR检测结果(图1)表明，气管内应用AdIL-18后6 h，小鼠肺组织中即可检出特异性的IL-18 mRNA，而PBS对照组及AdLacZ组则均未检出。
图 1 AdIL-18气管内应用后IL-18 mRNA的肺内表达
Fig 1 Expression of IL-18 mRNA in lung tissue
after intratracheal usage of AdIL-18
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1，2: β-actin； 3： AdLacZ negative control group;
4： AdIL-18 group(220 bp IL-18 mRNA)； 5: Marker
气管内用药后72 h,肺泡灌洗液及外周血中的细胞因子水平见表1。结果表明，气管内应用AdIL-18后，肺泡灌洗液中可检测到IL-18，且水平高于外周血(P<0.01)，而正常对照组和AdLacZ对照组肺泡灌洗液和外周血中均未检测到IL-18。同时，实验组肺灌洗液和外周血中的IL-2和IFNγ水平明显升高(P<0.01),提示气管内应用AdIL-18可有效表达IL-18，并诱导IL-2和IFNγ的产生。
2.2 气管内应用IL-18重组腺病毒对转移性肺癌的治疗作用
2.2.1 治疗后3LL肺转移癌小鼠的NK细胞及CTL活性 气管内应用重组腺病毒后2周，AdIL-18组小鼠脾细胞的NK细胞活性为(49.5±5.6)%，明显高于PBS对照组的(18.9±3.4)%和AdLacZ对照组的(19.2±3.5)% (P<0.01),而两个对照组间则无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，AdIL-18治疗组能诱导出一定程度的CTL(P<0.01),见图2。
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2.2.2 肺表面转移结节比较 实验性转移性肺癌模型建立后3 d，气管内应用AdIL-18，21 d后取肺脏计数表面转移结节，发现应用AdIL-18的荷瘤小鼠的肺转移结节数(11.2±4.3)明显少于PBS(72.4±5.6)和AdLacZ对照组(71.5±6.3) (P<0.01)。
2.2.3 存活期及存活率差异 如图3所示，观察90 d，气管应用IL-18重组腺病毒组的存活期及存活率明显高于BPS对照组和AdLacZ对照组(P<0.01)，而PBS和AdLacZ对照组间则无明显差异(P>0.05)。
表 1 AdIL-18气管内应用后灌洗液及外周血细胞因子水平
Tab 1 Concentrations of the cytokines in the lung lavages and peripheral blood after intratracheal usage of AdIL-18(n=6,
±s, ρB/pg*ml-1) Group, 百拇医药
IL-2
IFNγ
IL-18
LA
PB
LA
PB
LA
PB
AdIL-18
636±45**△△
876±15**△△
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521±38△△
475±34△△
187±5▲▲
44±6
AdLacZ
224±39**
116±30**
90±20
70±25
Control
64±23
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61±33
LA:Lung lavage; PB: Peripheral blood; **P<0.01 vs control group; △△P<0.01 vs AdLacZ group; ▲▲P<0.01 vs peripheral blood
图 2 气管内应用AdIL-18后体内CTL活性变化
Fig 2 Effect of intratracheal usage of
AdIL-18 on the CTL activity
○:PBS;□:AdLacZ;▲:AdIL-18
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图 3 气管内应用AdIL-18后对实验性
肺转移癌的治疗作用
Fig 3 Treatment of experimental lung metastasis by
intratracheal usage of AdIL-18
○:PBS;□:AdLacZ;▲:AdIL-18
3 讨 论
基因治疗是近年发展起来的医学新领域，已从基础研究转入临床试验，部分研究已取得令人鼓舞的结果[5～7]。肺部疾病的局部基因治疗有其优势：首先人肺部具有丰富的上皮组织和内皮细胞，表面积可达80 m2，利于外源基因导入；其次，特异性受体细胞易从支气管肺部灌洗液或肺活检中取得，便于对导入基因的表达及治疗效果进行观察[2,8,9]。目前，已有数百个纯化基因适于导入肺内，对肺内基因工程表达的基因调控也已有较多了解。
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用于肺部基因治疗的载体中,重组腺病毒有其独特优点：容量大(36 kb)，易制备、提取、浓缩及纯化，可获高滴度 (可达109～1012 pfu/ml) 腺病毒；安全性高，不整合至宿主细胞染色体，无插入突变和激活原癌基因或使抑癌基因失活的危险；转染效率高，能感染分裂期及静止期细胞，并能感染所有类型的气管上皮细胞包括纤维上皮细胞、分泌细胞、基底细胞和未分化细胞等，为治疗基因直接感染呼吸道上皮提供了可能[2,8,9]。我们以C57BL/6小鼠为模型，气管内滴入含LacZ基因的重组腺病毒AdLacZ，X-gal染色提示，滴入后6 h气管内即可见LacZ基因的表达，48 h达高峰，至28 d时仍有明显的表达(另文发表)。国外有气管内LacZ PCR检测阳性可达90 d的报道。囊性纤维跨膜电信号传导调节子(CFTR)基因重组腺病毒气管内滴入，其基因的表达可持续6周。SD大鼠气管内滴入IL-6重组腺病毒(Ad5rIL-6)后可有效表达，肺泡灌洗液中检出IL-6的同时，血清中仅测到微量IL-6，表明气管内滴入的病毒均保留在肺内[9]。我们给小鼠气管内滴入IL-18重组腺病毒后，对肺灌洗液和血清中IL-18及IFNγ的检测结果亦支持上述结论。表明重组腺病毒在对呼吸系统的直接转染中是一种高效载体。
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肺癌的基因治疗是目前研究热点，包括：肿瘤生物基因治疗、反义基因治疗、自杀基因治疗和基因置换治疗及补充治疗等。气管内应用具有抗肿瘤作用的药物或重组腺病毒具有明显的抗肿瘤作用。研究表明，气管内吸入IL-2脂质体可有效治疗狗黑素瘤的肺部转移，而气管内滴入108 pfu的构建好的血管内皮生长因子(VEGF)受体flt-1细胞外段的腺病毒载体，对BALB/c小鼠的C26细胞的肺部转移有明显的治疗作用[8]。
IL-18为新发现的具有抗肿瘤作用的细胞因子，可诱导IFNγ产生，明显增强NK活性及Th1型免疫反应，与IL-12具有协同作用[10]，其抗肿瘤作用与诱导产生的IFNγ、抑制血管形成、增强的Th1型反应有关，还与IL-18体内诱导的免疫记忆及产生杀伤性CD4+ T有关[5,10]。以IL-18预处理可保护小鼠对同基因肿瘤细胞的攻击，并对已形成的肿瘤有治疗作用[5,6]；转染IL-18基因的肿瘤细胞成瘤速度减慢、成瘤率减低，动物存活期延长[7]。我们采用重组技术构建了含信号肽的小鼠IL-18基因的腺病毒(AdIL-18)，气管内应用后，72 h及第8天均在灌洗液中和血清中可检测到IL-18，且灌洗液中的水平高于血浆中的水平，血浆中产生的IFNγ的水平亦明显升高，表明产生的IL-18产生了免疫学效应。气管内应用AdIL-18，对3LL肿瘤的肺转移有明显抑制作用，动物存活期明显延长，肺部转移结节数明显减少。同时发现AdIL-18气管内应用后对CTL和NK细胞活性有增强作用。
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本研究结果表明，气管内应用具有抗肿瘤作用的AdIL-18后可有效表达，且局部灌洗液中IL-18的水平明显高于外周血水平，有效激活了机体的免疫机能；对实验性肺转移癌也有一定的治疗作用，为肺部肿瘤的防治提供了一种新途径。
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39730420)
【作者简介】陈吉泉(1967～)，男(汉族)，博士，主治医师
【参考文献】
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【收稿日期】1999-12-09
【修回日期】2000-04-11, http://www.100md.com