外源野生型p53基因表达对人肺癌细胞药物敏感性影响
作者：张洪涛 汪蕙 赖百塘 张春燕 扬学惠
单位：张洪涛 汪蕙 赖百塘 张春燕 扬学惠(101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所)
关键词：人肺肿瘤；p53基因；基因表达；药物敏感性试验；细胞凋亡
中国肺癌杂志000302 【摘要】 目的 了解外源野生型p53(wild-type p53, wtp53)基因表达对人大细胞肺癌801-D细胞对化疗药物敏感性的影响。方法 选用p53基因突变的人大细胞肺癌801-D系。用脂质体介导构建的含wtp53基因载体转染801-D细胞，PCR检测外源wtp53在宿主细胞存在情况，3H-TdR掺入法测定801-D细胞转染 wtp53后药物敏感性变化，流式细胞仪(FACS)分析细胞死亡情况。结果 转染wtp53在801-D细胞有效表达，FACS分析转染细胞死亡率为 20.1%。对多种抗癌药物筛选，转染wtp53细胞对顺铂和5-氟脲嘧啶敏感性分别提高9.7和11.4倍，对非DNA损伤制剂和其它DNA损伤制剂的敏感性无变化；DNA断裂电泳分析和形态学观察显示细胞呈坏死特征。结论 wtp53可选择性增加801-D细胞对某些 DNA损伤制剂的敏感性，其调节机制可能以非凋亡途径为主，此为肺癌综合治疗提供了实验依据。
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Effects of exogenous wild-type p53 gene expression on sensitivity to chemotherapeutic agents in human lung cancer cell
ZHANG Hongtao, WANG Hui, LAI Baitang, ZHANG Chunyan, YANG Xuehui. Cellular and Molecular Biology Lab, Beijing Thoracic Tumor Research Institute, Beijing 101149, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of exogenous wild-type p53 (wtp53) gene expression on sensitivity to chemotherapeutic agents with different mechanism of action in human lung cancer cells. Methods A human lung cancer cells line 801-D with point mutation of p53 was transfected with either constructed recombinant plasmid pEGFP-p53, which expressed wtp53 or pEGFP vector. The expression of neo and wtp53 gene in anti-G418 clone, 801-D vector and 801-D-wtp53, were detected by PCR. The functional activity of transfected wtp53 was demonstrated by partly 801-D apoptosis. 3 H-TdR uptake assay was taken for drug sensitivity measure according to standard procedures. Flow cytometry was employed to determine cell death.Results Sensitivity of 801-D-wtp53 to cisplatin and 5-fluorouracil was higher than that of 801-D vector by 9.7 and 11.4 fold respectively. There was no significant difference for other DNA-damaging agents and non-DNA-damaging agents, such as etoposide and adriamycin, vincristine and methylenum Caeruleum. Analysis of DNA ladder by gel electrophoresis and morphological observation showed cell necrosis characteristics. Conclusion 801-D cell line shows a selective sensitization to DNA-damaging agents when exogenous wtp53 is expressed. The increased sensitivity to cisplatin by exogenous wtp53 expression may be through non-apoptosis pathway. This study results provide experimental bases for comprehensive treatment of lung cancer.
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【Key words】 Human lung neoplasms p53 gene Gene expression Drug sensitivity assay Apoptosis
This work was supported by grants partly from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 39370354) and from the Natural Sciences Foundation of Beijing (No.7972006).
p53蛋白的一个重要功能是对复杂的DNA损伤系统进行调控，监视基因组的完整性。转染野生型p53(wild-type p53, wtp53)基因于肿瘤细胞，可补偿其内源性p53功能丧失，这是一种基因替代疗法，可有效重建p53功能。通过基因转染方法研究p53的功能状态影响肿瘤细胞对化疗，尤其是DNA损伤药物的敏感性是可行的。我们首次用国内建立的有p53突变的肺癌细胞系，导入wtp53基因，检测导入基因后肺癌细胞系对不同作用机制的抗癌制剂的敏感性变化。
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1 材料与方法
1.1 肺癌细胞系 人大细胞肺癌801-D系由301医院建立。该系细胞存在p53基因第7外显子突变，p53核心区248氨基酸密码发生CGG至CTT颠换，免疫组化染色显示801-D细胞p53突变蛋白呈强阳性反应[1]。
1.2 wtp53基因转染 重组表达质粒pEGFP-p53(含1.8kb wtp53 cDNA)和空载质粒pEGFP由中科院生物物理所构建和提供。用Lipofectine介导，转染801-D细胞，筛选G418抗性克隆，转染pEGFP-wtp53和pEGFP的801-D细胞分别命名为801-D-wtp53和801-D vector。801-D-wtp53细胞生长变缓[1]。
1.3 肿瘤细胞外源基因p53 cDNA和neo基因检测 提取801-D和转染细胞总DNA。1.8kb wtp53 cDNA特异性引物：P1 5'-CAT ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG-3'；P2 5'-CG GGA TCC TCA CCC AGC CTG GGC ATC CTT GAG-3'。可扩增外源p53 cDNA 708-1068基因区域374bp基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。用同样方法检测801-D vector和 801-D-wtp53中190bp neo基因存在。
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1.4 药物和药物敏感试验 选用国内临床常用化疗药物。DNA损伤类药物：阿霉素(adriamycin)、足叶乙甙(VP-16)、顺铂(cisplatin)、氟脲嘧啶(5-FU)；非DNA损伤制剂：西艾克(vincristine)、亚甲兰(methylenum Caeruleum)。参照Alley方法[2]，采用3H-TdR掺入药敏试验。取对数生长期801-D，801-D vector和801-D-wtp53细胞接种96孔板，100μl中含500个细胞/孔，贴壁后加入不同浓度上述药物，每孔100μl，对照只加完全培基，每一药物浓度设3复孔。4d后加入3H-TdR(中国原子能研究院产品)0.5μCi/孔，16h后弃上清，胰酶消化，收集细胞于玻璃纤维纸上；生理盐水洗涤、烘干，液闪仪测cpm。
±s表示每组数据，并求出与对照的相对百分率。每组药物重复试验至少3次。
1.5 流式细胞仪分析 801-D vector，801-D-wtp53及IC50(801-D-wtp53)浓度的顺铂和 5-FU作用4d后的两种细胞，经200μg/ml RNase 37℃处理1h，50μg/ml碘化丙锭4℃避光染色，FACS分析。
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1.6 .细胞凋亡的检测 ①梯形DNA形成试验：用10μg/ml顺铂作用12h、24h、36h、48h、60h和1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml顺铂作用24h的细胞，提取DNA，行1%琼脂糖凝胶电泳。地塞米松诱导的幼龄Wistar鼠胸腺细胞作阳性对照。②形态学观察：用吖啶橙和溴化乙锭染色，荧光显微镜下鉴别细胞坏死和凋亡[3]。
2 结果
2.1 转染细胞外源wtp53 cDNA和neo基因鉴定 801-D及其转染细胞DNA经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳显示801-D-wtp53细胞有预期的374bp wtp53 cDNA基因片断,未转染细胞和空载细胞均未检出。转染细胞同时可检出190bp neo基因存在。
2.2 801-D细胞转染前后FACS分析 图1中的a和b图显示801-D-wtp53细胞在G0/G1期细胞峰前出现特征性亚G1峰，占细胞20.1%，而801-D和801-D vector 细胞均<5%。
, 百拇医药
2.3 外源wtp53对肺癌细胞药物敏感性的影响 801-D细胞和801-D vector 细胞对各种药物敏感性一致，说明单纯空载质粒转染对细胞药物敏感性无影响，表1为两种转染细胞对6种化疗药物的敏感性结果。其中801-D-wtp53细胞对顺铂和5-FU的敏感性明显高于801-D vector细胞，两者相差7.9倍和11.4倍(图2)。顺铂和5-FU作用两种细胞4d后，FACS分析801-D-wtp53细胞死亡率也较801-D vector 细胞分别提高27.1%和62.5%(图1)。
2.4 细胞凋亡鉴别 经顺铂持续作用后，801-D vector和801-D-wtp53细胞未出现梯状DNA断裂，只逐步出现膜状带型(图3)。形态学观察，801-D-wtp53细胞群体中可见典型染色质凝聚凋亡细胞特征(约占10%)。用 IC50浓度顺铂作用801-D-wtp53细胞，凋亡细胞未见增多，桔黄色淡染细胞比例迅速上升，呈坏死特征。
表1 801-D vector和801-D-wtp53对化疗药物的敏感性
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Tab 1 Cellular sensitivity of 801-D cells transfected with
pEGFP-p53 or pEGFP vector to chemotherapeutic agents Drugs
IC50(nmol/L)
P value
801-D vector
801-D-wtp53
801-D vector/
801-D-wtp53
Cisplatin
, 百拇医药
1421.9±230.5
177.0±28.0
7.9
<0.05
5-FU
51453.2±16465.0
4496.5±728.9
11.4
<0.05
VP-16
1108.0±674.5
3761.9±1767.8
, 百拇医药
<1.0
>0.05
Adriamycin
31.6±1.1
32.5±10.4
1.0
>0.05
Vincristine
1.4±0.5
-*
<1.0
-
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Methylenum
179.0±29.0
179.0±29.0
1.0
>0.05
Caeruleum
*： IC50>(1.4±0.5)nmol/L
3 讨论
野生型p53基因与肿瘤治疗关系有二方面备受关注。一是其对肿瘤细胞确切的抑制作用，野生型p53基因是美国在肿瘤基因治疗方面最先获许进入临床实验的基因之一。二即是近年来人们开始注意到的p53基因对肿瘤的放化疗敏感性的影响，已通过肿瘤组织样本检测发现p53基因异常与肿瘤耐药密切相关，但用转基因方法直接证实p53基因对肿瘤细胞药物敏感性的调节作用报道尚少，最早的有关野生型p53对细胞毒制剂和放射敏感性影响作用的报道是用T24H-ras转化的鼠胚成纤维细胞 (p53+/+或p53-/-)，在 wtp53存在时，细胞对放射治疗以及阿霉素、VP-16等化疗药物的敏感性增加[4]，随后在Burkitt淋巴瘤、非小细胞肺癌等类型肿瘤也证实在wtp53表达后，肿瘤对顺铂、VP-16敏感性增高。然而，同时也有报道在肠癌、卵巢癌等细胞系wtp53的表达对阿霉素和喜树碱等药物及放射线的作用无影响或敏感性降低[5]。这些颇有争议的报道除受细胞p53状态(缺失、突变、二者兼有)及wtp53表达程度影响外，可能还与肿瘤遗传背景的差异有关。我们选用国内建立的人大细胞肺癌细胞系，进行转基因药物敏感试验。所选的6种药物中，西艾克和亚甲兰为非 DNA损伤制剂，西艾克主要阻止纺锤体形成，亚甲兰可干扰肿瘤细胞糖酵解过程，并具有明显抑制肺肿瘤生长作用[6]。结果表明，wtp53的介导不影响801-D细胞对这两种药物的敏感性，提示wtp53对非DNA损伤制剂无调节作用。在4种DNA损伤制剂中，801-D-wtp53对顺铂和5-FU敏感性明显增高，这与国外多数报道相同，其中wtp53提高瘤细胞对顺铂的敏感性具有更广泛的一致性。
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图1 转染801-D细胞及药物作用4dFACS直方图
Fig 1 FACS analysis of transfected 801-D cells treated with DNA-damaging agents
a,b: control; c,d: 0.125μg/ml cisplatin; e,f: 0.65μg/ml 5-FU
图2 转染wtp53增加了801-D细胞对5-FU和顺铂的敏感性
Fig 2 Transfection of wtp53 increased the sensitivity of 801-D cells line to 5-FU and cisplatin
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图3 DNA断裂琼脂糖凝胶电泳
A：不同浓度顺铂作用转染细胞24h。1：阳性对照；2～4：801-D vector 1，10，100μg/ml；5～8：801-D-wtp53 0,1,10,100μg/ml。
B：10μg/ml顺铂作用于801-D-wtp53细胞。1：阳性对照；2～7：0，12，24，36，48，60h。
Fig 3 Analysis of DNA ladder by agarose gel electrophoresis
A：Transfected 801-D cells treated with cisplatin for 24 hours. 1: positive control; 2-4: 801-D vector 1,10,100μg/ml; 5-8:801-D-wtp53 0,1,10,100μg/ml
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B：801-D-wtp53 cell treated by 10μg/ml cisplatin. 1: positive control; 2-7:0,12,24,36,48,60 hours.
试验中选用了4种不同作用机制的DNA损伤药物。VP-16和阿霉素主要是TopII抑制剂；5-FU是抗代谢药物，使DNA合成前体dTTP缺乏；顺铂主要导致 DNA链内交联发挥细胞毒作用，它们分属不同类别的DNA损伤制剂。本结果说明wtp53只选择性增加某些制剂的敏感性，其机制除可能与目前已知的几种途径，如p53通过调节多药耐药(multidrug resistance,MDR)或作用于C-myc等靶基因调节细胞凋亡等有关外[7]，不能排除与p53对某些特定DNA损伤制剂作用的一些环节及其它调节机制有关，对此我们正进行进一步探讨。
一般认为外源 wtp53在肿瘤细胞的表达及化疗药物通过引起肿瘤细胞凋亡发挥作用，我们发现在801-D细胞转染wtp53后，FACS分析出现明显的亚G1细胞群，通常称为“凋亡峰”，且形态学上也符合凋亡特征，证明wtp53确有诱导肿瘤细胞凋亡作用。但顺铂作用801-D-wtp53后DNA断裂分析并未出现典型的梯状DNA断裂(DNA ladder)，而目前DNA梯状条带出现仍然是鉴定凋亡最具特异性的指标。在进行该试验中，我们在相同浓度顺铂作用不同时相和不同浓度顺铂作用相同时间情况下，反复试验，结果均未出现阳性结果，随药物作用强度加大，逐渐出现膜状条带，为细胞 DNA无规律断裂所致，形态学鉴定细胞呈坏死特征，这在国外也有类似的报道[8]。提示wtp53可能通过非凋亡途径调节801-D细胞对化疗药物的敏感性。
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本研究证实野生型p53可以增加大细胞肺癌801-D细胞系对以顺铂为代表的DNA损伤制剂的敏感性，由于p53 在肺癌的突变率很高，且肿瘤细胞普遍存在对化疗药物的耐受性，因此，p53基因结合化疗有可能提供一种更有效的肿瘤综合治疗方案。
本研究受国家自然科学基金(39370354)和北京市自然科学基金(7972006)资助
参考文献
1，汪蕙，赖百塘，李金照，等.外源性野生型p53基因对肺癌细胞生长的抑制.中华结核和呼吸杂志，1998，21(5)∶268-272.
2，Alley MC, Scudiero DA, Monks A, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res,1988,48(3)∶589-601.
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3，Coligan JE， Kruisbeak. Morphological and biochemical assays of apoptosis. Current Protocols in Immunology. New York:John Wiley and Sons,1992.1-16.
4，Lowe SW, Ruley HE, Jacks T, et al. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer drugs. Cell,1993,74(7)∶957-967.
5，Slichenmeyer WJ, Nelson WG, Slebos RJ, et al. Loss of a p53-associated G1 checkpoint does not decrease cell survival following DNA damage. Cancer Res,1993,53(18)∶4164-4168.
, http://www.100md.com
6，赖百塘，汪蕙，刘桂芝，等.亚甲兰抗肿瘤作用的研究.结核病与肺部肿瘤，1988，2(1)∶1-7.
7，Thottassery JV, Zambetti GP, Arimori K, et al. p53-dependent regulation of MDR1 gene expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(20)∶11037-11042.
8，Gibson AA, Harwood FG, Tillman DM, et al. Selective sensitization to DNA-damaging agents in human rhabdomyosarcoma cell line with inducible wild-type p53 overexpression. Clin Cancer Res,1998,4(1)∶145-152.
(收稿：1999-10-25 修回：2000-02-23), 百拇医药
单位：张洪涛 汪蕙 赖百塘 张春燕 扬学惠(101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所)
关键词：人肺肿瘤；p53基因；基因表达；药物敏感性试验；细胞凋亡
中国肺癌杂志000302 【摘要】 目的 了解外源野生型p53(wild-type p53, wtp53)基因表达对人大细胞肺癌801-D细胞对化疗药物敏感性的影响。方法 选用p53基因突变的人大细胞肺癌801-D系。用脂质体介导构建的含wtp53基因载体转染801-D细胞，PCR检测外源wtp53在宿主细胞存在情况，3H-TdR掺入法测定801-D细胞转染 wtp53后药物敏感性变化，流式细胞仪(FACS)分析细胞死亡情况。结果 转染wtp53在801-D细胞有效表达，FACS分析转染细胞死亡率为 20.1%。对多种抗癌药物筛选，转染wtp53细胞对顺铂和5-氟脲嘧啶敏感性分别提高9.7和11.4倍，对非DNA损伤制剂和其它DNA损伤制剂的敏感性无变化；DNA断裂电泳分析和形态学观察显示细胞呈坏死特征。结论 wtp53可选择性增加801-D细胞对某些 DNA损伤制剂的敏感性，其调节机制可能以非凋亡途径为主，此为肺癌综合治疗提供了实验依据。
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Effects of exogenous wild-type p53 gene expression on sensitivity to chemotherapeutic agents in human lung cancer cell
ZHANG Hongtao, WANG Hui, LAI Baitang, ZHANG Chunyan, YANG Xuehui. Cellular and Molecular Biology Lab, Beijing Thoracic Tumor Research Institute, Beijing 101149, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of exogenous wild-type p53 (wtp53) gene expression on sensitivity to chemotherapeutic agents with different mechanism of action in human lung cancer cells. Methods A human lung cancer cells line 801-D with point mutation of p53 was transfected with either constructed recombinant plasmid pEGFP-p53, which expressed wtp53 or pEGFP vector. The expression of neo and wtp53 gene in anti-G418 clone, 801-D vector and 801-D-wtp53, were detected by PCR. The functional activity of transfected wtp53 was demonstrated by partly 801-D apoptosis. 3 H-TdR uptake assay was taken for drug sensitivity measure according to standard procedures. Flow cytometry was employed to determine cell death.Results Sensitivity of 801-D-wtp53 to cisplatin and 5-fluorouracil was higher than that of 801-D vector by 9.7 and 11.4 fold respectively. There was no significant difference for other DNA-damaging agents and non-DNA-damaging agents, such as etoposide and adriamycin, vincristine and methylenum Caeruleum. Analysis of DNA ladder by gel electrophoresis and morphological observation showed cell necrosis characteristics. Conclusion 801-D cell line shows a selective sensitization to DNA-damaging agents when exogenous wtp53 is expressed. The increased sensitivity to cisplatin by exogenous wtp53 expression may be through non-apoptosis pathway. This study results provide experimental bases for comprehensive treatment of lung cancer.
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【Key words】 Human lung neoplasms p53 gene Gene expression Drug sensitivity assay Apoptosis
This work was supported by grants partly from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 39370354) and from the Natural Sciences Foundation of Beijing (No.7972006).
p53蛋白的一个重要功能是对复杂的DNA损伤系统进行调控，监视基因组的完整性。转染野生型p53(wild-type p53, wtp53)基因于肿瘤细胞，可补偿其内源性p53功能丧失，这是一种基因替代疗法，可有效重建p53功能。通过基因转染方法研究p53的功能状态影响肿瘤细胞对化疗，尤其是DNA损伤药物的敏感性是可行的。我们首次用国内建立的有p53突变的肺癌细胞系，导入wtp53基因，检测导入基因后肺癌细胞系对不同作用机制的抗癌制剂的敏感性变化。
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1 材料与方法
1.1 肺癌细胞系 人大细胞肺癌801-D系由301医院建立。该系细胞存在p53基因第7外显子突变，p53核心区248氨基酸密码发生CGG至CTT颠换，免疫组化染色显示801-D细胞p53突变蛋白呈强阳性反应[1]。
1.2 wtp53基因转染 重组表达质粒pEGFP-p53(含1.8kb wtp53 cDNA)和空载质粒pEGFP由中科院生物物理所构建和提供。用Lipofectine介导，转染801-D细胞，筛选G418抗性克隆，转染pEGFP-wtp53和pEGFP的801-D细胞分别命名为801-D-wtp53和801-D vector。801-D-wtp53细胞生长变缓[1]。
1.3 肿瘤细胞外源基因p53 cDNA和neo基因检测 提取801-D和转染细胞总DNA。1.8kb wtp53 cDNA特异性引物：P1 5'-CAT ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG-3'；P2 5'-CG GGA TCC TCA CCC AGC CTG GGC ATC CTT GAG-3'。可扩增外源p53 cDNA 708-1068基因区域374bp基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。用同样方法检测801-D vector和 801-D-wtp53中190bp neo基因存在。
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1.4 药物和药物敏感试验 选用国内临床常用化疗药物。DNA损伤类药物：阿霉素(adriamycin)、足叶乙甙(VP-16)、顺铂(cisplatin)、氟脲嘧啶(5-FU)；非DNA损伤制剂：西艾克(vincristine)、亚甲兰(methylenum Caeruleum)。参照Alley方法[2]，采用3H-TdR掺入药敏试验。取对数生长期801-D，801-D vector和801-D-wtp53细胞接种96孔板，100μl中含500个细胞/孔，贴壁后加入不同浓度上述药物，每孔100μl，对照只加完全培基，每一药物浓度设3复孔。4d后加入3H-TdR(中国原子能研究院产品)0.5μCi/孔，16h后弃上清，胰酶消化，收集细胞于玻璃纤维纸上；生理盐水洗涤、烘干，液闪仪测cpm。
±s表示每组数据，并求出与对照的相对百分率。每组药物重复试验至少3次。1.5 流式细胞仪分析 801-D vector，801-D-wtp53及IC50(801-D-wtp53)浓度的顺铂和 5-FU作用4d后的两种细胞，经200μg/ml RNase 37℃处理1h，50μg/ml碘化丙锭4℃避光染色，FACS分析。
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1.6 .细胞凋亡的检测 ①梯形DNA形成试验：用10μg/ml顺铂作用12h、24h、36h、48h、60h和1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml顺铂作用24h的细胞，提取DNA，行1%琼脂糖凝胶电泳。地塞米松诱导的幼龄Wistar鼠胸腺细胞作阳性对照。②形态学观察：用吖啶橙和溴化乙锭染色，荧光显微镜下鉴别细胞坏死和凋亡[3]。
2 结果
2.1 转染细胞外源wtp53 cDNA和neo基因鉴定 801-D及其转染细胞DNA经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳显示801-D-wtp53细胞有预期的374bp wtp53 cDNA基因片断,未转染细胞和空载细胞均未检出。转染细胞同时可检出190bp neo基因存在。
2.2 801-D细胞转染前后FACS分析 图1中的a和b图显示801-D-wtp53细胞在G0/G1期细胞峰前出现特征性亚G1峰，占细胞20.1%，而801-D和801-D vector 细胞均<5%。
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2.3 外源wtp53对肺癌细胞药物敏感性的影响 801-D细胞和801-D vector 细胞对各种药物敏感性一致，说明单纯空载质粒转染对细胞药物敏感性无影响，表1为两种转染细胞对6种化疗药物的敏感性结果。其中801-D-wtp53细胞对顺铂和5-FU的敏感性明显高于801-D vector细胞，两者相差7.9倍和11.4倍(图2)。顺铂和5-FU作用两种细胞4d后，FACS分析801-D-wtp53细胞死亡率也较801-D vector 细胞分别提高27.1%和62.5%(图1)。
2.4 细胞凋亡鉴别 经顺铂持续作用后，801-D vector和801-D-wtp53细胞未出现梯状DNA断裂，只逐步出现膜状带型(图3)。形态学观察，801-D-wtp53细胞群体中可见典型染色质凝聚凋亡细胞特征(约占10%)。用 IC50浓度顺铂作用801-D-wtp53细胞，凋亡细胞未见增多，桔黄色淡染细胞比例迅速上升，呈坏死特征。
表1 801-D vector和801-D-wtp53对化疗药物的敏感性
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Tab 1 Cellular sensitivity of 801-D cells transfected with
pEGFP-p53 or pEGFP vector to chemotherapeutic agents Drugs
IC50(nmol/L)
P value
801-D vector
801-D-wtp53
801-D vector/
801-D-wtp53
Cisplatin
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1421.9±230.5
177.0±28.0
7.9
<0.05
5-FU
51453.2±16465.0
4496.5±728.9
11.4
<0.05
VP-16
1108.0±674.5
3761.9±1767.8
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<1.0
>0.05
Adriamycin
31.6±1.1
32.5±10.4
1.0
>0.05
Vincristine
1.4±0.5
-*
<1.0
-
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Methylenum
179.0±29.0
179.0±29.0
1.0
>0.05
Caeruleum
*： IC50>(1.4±0.5)nmol/L
3 讨论
野生型p53基因与肿瘤治疗关系有二方面备受关注。一是其对肿瘤细胞确切的抑制作用，野生型p53基因是美国在肿瘤基因治疗方面最先获许进入临床实验的基因之一。二即是近年来人们开始注意到的p53基因对肿瘤的放化疗敏感性的影响，已通过肿瘤组织样本检测发现p53基因异常与肿瘤耐药密切相关，但用转基因方法直接证实p53基因对肿瘤细胞药物敏感性的调节作用报道尚少，最早的有关野生型p53对细胞毒制剂和放射敏感性影响作用的报道是用T24H-ras转化的鼠胚成纤维细胞 (p53+/+或p53-/-)，在 wtp53存在时，细胞对放射治疗以及阿霉素、VP-16等化疗药物的敏感性增加[4]，随后在Burkitt淋巴瘤、非小细胞肺癌等类型肿瘤也证实在wtp53表达后，肿瘤对顺铂、VP-16敏感性增高。然而，同时也有报道在肠癌、卵巢癌等细胞系wtp53的表达对阿霉素和喜树碱等药物及放射线的作用无影响或敏感性降低[5]。这些颇有争议的报道除受细胞p53状态(缺失、突变、二者兼有)及wtp53表达程度影响外，可能还与肿瘤遗传背景的差异有关。我们选用国内建立的人大细胞肺癌细胞系，进行转基因药物敏感试验。所选的6种药物中，西艾克和亚甲兰为非 DNA损伤制剂，西艾克主要阻止纺锤体形成，亚甲兰可干扰肿瘤细胞糖酵解过程，并具有明显抑制肺肿瘤生长作用[6]。结果表明，wtp53的介导不影响801-D细胞对这两种药物的敏感性，提示wtp53对非DNA损伤制剂无调节作用。在4种DNA损伤制剂中，801-D-wtp53对顺铂和5-FU敏感性明显增高，这与国外多数报道相同，其中wtp53提高瘤细胞对顺铂的敏感性具有更广泛的一致性。
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图1 转染801-D细胞及药物作用4dFACS直方图
Fig 1 FACS analysis of transfected 801-D cells treated with DNA-damaging agents
a,b: control; c,d: 0.125μg/ml cisplatin; e,f: 0.65μg/ml 5-FU
图2 转染wtp53增加了801-D细胞对5-FU和顺铂的敏感性
Fig 2 Transfection of wtp53 increased the sensitivity of 801-D cells line to 5-FU and cisplatin
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图3 DNA断裂琼脂糖凝胶电泳
A：不同浓度顺铂作用转染细胞24h。1：阳性对照；2～4：801-D vector 1，10，100μg/ml；5～8：801-D-wtp53 0,1,10,100μg/ml。
B：10μg/ml顺铂作用于801-D-wtp53细胞。1：阳性对照；2～7：0，12，24，36，48，60h。
Fig 3 Analysis of DNA ladder by agarose gel electrophoresis
A：Transfected 801-D cells treated with cisplatin for 24 hours. 1: positive control; 2-4: 801-D vector 1,10,100μg/ml; 5-8:801-D-wtp53 0,1,10,100μg/ml
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B：801-D-wtp53 cell treated by 10μg/ml cisplatin. 1: positive control; 2-7:0,12,24,36,48,60 hours.
试验中选用了4种不同作用机制的DNA损伤药物。VP-16和阿霉素主要是TopII抑制剂；5-FU是抗代谢药物，使DNA合成前体dTTP缺乏；顺铂主要导致 DNA链内交联发挥细胞毒作用，它们分属不同类别的DNA损伤制剂。本结果说明wtp53只选择性增加某些制剂的敏感性，其机制除可能与目前已知的几种途径，如p53通过调节多药耐药(multidrug resistance,MDR)或作用于C-myc等靶基因调节细胞凋亡等有关外[7]，不能排除与p53对某些特定DNA损伤制剂作用的一些环节及其它调节机制有关，对此我们正进行进一步探讨。
一般认为外源 wtp53在肿瘤细胞的表达及化疗药物通过引起肿瘤细胞凋亡发挥作用，我们发现在801-D细胞转染wtp53后，FACS分析出现明显的亚G1细胞群，通常称为“凋亡峰”，且形态学上也符合凋亡特征，证明wtp53确有诱导肿瘤细胞凋亡作用。但顺铂作用801-D-wtp53后DNA断裂分析并未出现典型的梯状DNA断裂(DNA ladder)，而目前DNA梯状条带出现仍然是鉴定凋亡最具特异性的指标。在进行该试验中，我们在相同浓度顺铂作用不同时相和不同浓度顺铂作用相同时间情况下，反复试验，结果均未出现阳性结果，随药物作用强度加大，逐渐出现膜状条带，为细胞 DNA无规律断裂所致，形态学鉴定细胞呈坏死特征，这在国外也有类似的报道[8]。提示wtp53可能通过非凋亡途径调节801-D细胞对化疗药物的敏感性。
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本研究证实野生型p53可以增加大细胞肺癌801-D细胞系对以顺铂为代表的DNA损伤制剂的敏感性，由于p53 在肺癌的突变率很高，且肿瘤细胞普遍存在对化疗药物的耐受性，因此，p53基因结合化疗有可能提供一种更有效的肿瘤综合治疗方案。
本研究受国家自然科学基金(39370354)和北京市自然科学基金(7972006)资助
参考文献
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7，Thottassery JV, Zambetti GP, Arimori K, et al. p53-dependent regulation of MDR1 gene expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(20)∶11037-11042.
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(收稿：1999-10-25 修回：2000-02-23), 百拇医药