MDM2癌基因对野生型p53基因诱发凋亡的抑制作用△
作者：郭洪涛 刘彤华 高 洁
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院， 北京100730
关键词：p53；癌基因；凋亡；胰腺肿瘤；MDM2
ize 摘要 目的 研究MDM2癌基因与野生型p53基因在细胞凋亡发生中的相互关系。方法 构建了一个表达人野生型(wt)p53逆转录病毒载体，经PA317细胞包装后转染人胰腺癌细胞(PC-2)，建成PC-2/swtp53转化细胞系。再用含MDM2基因的pCMV-MDM2载体转染PC-2/swtp53细胞，获得双重转染细胞系PC-2/swtp53/pCMV-MDM2。用流式细胞技术，原位检测分析和DNA凝胶电泳分析细胞凋亡。结果 恢复wtp53表达的胰腺癌细胞系(PC-2/swtp53)细胞凋亡明显增多(>12%)，而双重转染的细胞系(PC-2/swtp53/pCMV-MDM2)则凋亡细胞数明显下降(3.2%)。结论 MDM2癌基因可抑制由野生型p53基因诱发的细胞凋亡。
, http://www.100md.com
中图号 R735.9 Q784
野生型p53基因可以使细胞在G1期受阻、细胞生长速度变慢和诱发凋亡，而p53基因突变则使细胞生长失去控制，细胞凋亡明显减少[1]。MDM2蛋白可与P53蛋白结合，进而抑制和灭活P53蛋白[2]。为研究MDM2癌基因与p53基因两者在细胞凋亡发生中的相互关系，本实验选用含p53基因突变的人胰腺癌PC-2细胞为靶细胞，研究人胰腺癌细胞系表达野生型p53基因后对凋亡的诱导作用及MDM2过度表达在野生型p53基因诱导的细胞凋亡中的作用。
1 材料和方法
细胞系 人胰腺癌细胞系PC-2细胞为本室自建[3]，其p53基因第240位密码子有突变，培养在RPMI1640培养基中。包装细胞PA317培养在DMEM培养基中。两种培养基用时均补加10% FBS，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素。
, 百拇医药
重组逆转录病毒载体 将全长2.3 kb、5′和3′端带有非转录顺序的野生型p53 cDNA片段，插入到逆转录病毒载体pBabe-puro(英国Imperial Cancer Research Fund的NR Lemoine博士赠)的多克隆位点BamHⅠ中，经克隆筛选，酶切鉴定出正义p53重组体，命名为pBabe-swtp53。
PA317细胞包装和转染PC-2细胞 利用磷酸钙沉淀法[4]，用PA317细胞包装重组载体pBabe-swtp53和空病毒pBabe-puro载体，分别收集两种载体的病毒上清(加8 μg/ml polybrene)转染人胰腺癌PC-2细胞系，建成含正义野生型p53基因的转化细胞系PC-2/pBabe-swtp53和用空病毒转化的细胞系PC-2/pBabe-puro。
MDM2癌基因表达载体的转染 将PC-2/pBabe-swtp53细胞以5×105个细胞/孔接种于6孔板上，培养48 h后，用pCMV-neo和pCMV-MDM2重组载体(美国Johns Hopkins Oncology Center的Vogelstein教授赠)，按文献5方法转染细胞。所获得的双重转化细胞系为PC-2/swtp53/pCMV-MDM2和PC-2/swtp53/pCMV-neo。
, 百拇医药
用PCR技术分析外源p53基因的插入 为检测转染的细胞是否有外源p53基因的整合，采用两对特异性引物。第一对引物,primer A,5′-TACTCCCTGCCCTCAACAAGA-3′和primer B,5′-CTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGC-3′，该引物对不含内含子的p53 cDNA可扩出一条约546 bp的片段，而对基因组中的p53基因，在同样的反应条件极难扩出，因而可鉴别外源和内源性p53基因。第二对引物为针对基因组的引物，primer C,5′-TGTTATCTCCTA-
GGTTGGCTCTGAC-3′,对应于第6内含子和第7外显子起始处，primer D,5′-GGAATTCAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′，对应于第7外显子的最后4个核苷酸和第7内含子，对内源性p53基因组DNA可扩出一条143 bp的片段。
PCR反应体积为50 μl，含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，模板0.5 μg,Taq酶2 U，引物浓度各50 pmol/L，反应条件是95℃预变性5 min,94℃ 60 s，52.5℃ 60 s，72℃ 80 s，循环35次，然后72℃，延伸7 min。
, 百拇医药
免疫沉淀法检测外源p53基因的表达 选用Oncogene Science公司的PAb1620单克隆抗体，该抗体可特异识别野生型P53蛋白[6]。用35S蛋氨酸标记PC-2，PC-2/pBabe-puro、PC-2/pBabe-swtp53和PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞，提取的裂解产物与PAb1620抗体进行免疫沉淀反应，标本在8%SDS-PAGE上电泳并用X-光片显影[7]。
Western blot分析 按文献4方法进行。
原位检测细胞凋亡 参考原位凋亡细胞检测试剂盒(Boehringer Mannheim)说明书和有关文献[8]，用胰酶消化、收集细胞，制成细胞涂片，多聚甲醛固定2 min后，每张玻片滴加TUNEL(Terminal Deoxynucleotidyl Trasferase Mediated dUTP Nick End Labeling)反应混合液，37℃ 60 min，再用PI(propidium iodide)和RNase混合液染色30 min，置荧光显微镜下观察。
, 百拇医药
流式细胞仪测定 培养的细胞经胰酶消化，离心收集,PBS洗涤，70%乙醇固定后重溶于PBS中，细胞密度为1×106/ml， 加RNase 37℃ 1 h,再加PI(50 μg/ml)，避光染色60 min，以淋巴细胞为正常2倍体细胞，在FACScan流式细胞仪(美国Becton Dickinson)上测定凋亡细胞比例，每组测定104个细胞。
DNA凝胶电泳分析 按文献9方法进行。
2 结果
外源p53 cDNA的插入和整合 提取细胞的DNA，经PCR扩增后，凝胶电泳显示PC-2/pBabe-swtp53、PC-2/swtp53/pCMV-neo和PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞DNA中均可扩出一条546 bp的片段，说明这几株细胞系均有外源p53 cDNA的插入和整合(图1)。
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图1 转化细胞中的p53 cDNA 插入和整合
Fig 1 Identification of integration of p53 cDNA into host cell genome by PCR analysis
Lane1:pBR322/Hinf Ⅰ marker; Lane2: PC-2/pBabe-swtp53 cell; Lane3:PC-2/swtp53/pCMV-neo cell; Lane4:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2； Lane5:PC-2 cell
图2 野生型P53蛋白在转化细胞系的表达
Fig 2 Immunoprecititation of wild-type P53 protein from transfected cells
, 百拇医药
Lane1:PC-2 cell; Lane2:PC-2/pBabe-puro cell; Lane3:PC-2/pBabe-swtp53；Lane4:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
MW:molecular weight
免疫沉淀分析结果 免疫沉淀显示，PC-2/pBabe-swtp53和PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞有相对分子质量为53 000的沉淀带，说明这两株细胞中均有野生型P53蛋白的表达，而PC-2和PC-2/pBabe-puro细胞中未见有wtp53沉淀带(图2)。
MDM2基因的表达 Western blot结果表明PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞有MDM2(相对分子质量90 000)表达，而PC-2/swtp53/pCMV-neo和PC-2/pBabe-swtp53没有MDM2表达(图3)。
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图3 双重转化细胞MDM2蛋白的Western blot分析结果
Fig 3 Western blot analysis of MDM2 protein in transfected cell
Lane1:PC-2/pBabe-swtp53 cell; Lane2:PC-2/swtp53/pCMV-neo cell; Lane3:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
MW:molecular weight
细胞凋亡测定结果 流式细胞仪测定表明，PC-2细胞和PC-2/pBabe-puro细胞的细胞凋亡数少于1%，PC-2/pBabe-swtp53和PC-2/swtp53/pCMV-neo细胞的凋亡数明显升高(12.1%～12.9%)，经wtp53和MDM2双重转染的PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞的凋亡数降至3.2%(图4)。经TUNEL反应后，在荧光显微镜下观察，PC-2细胞几乎均呈生长状态的桔红色荧光，而PC-2/pBabe-swtp53细胞中出现了一些呈绿色荧光的凋亡细胞。DNA凝胶电泳结果显示在PC-2/pBabe-swtp53细胞中可见DNA laddering(图5)，即有细胞凋亡发生。
, 百拇医药
图4 凋亡细胞的流式细胞仪分析结果
Fig 4 FCM analysis of apoptosis
1.PC-2 cell; 2.PC-2/pBabe-puro cell;3.PC-2/pBabe-swtp53；4.PC-2/swtp53/pCMV-neo cell；5.PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
图5 转化细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳
Fig 5 Agarose gel electrophoresis of DNA from transformant cells
Lane1:PC-2/pBabe-swtp53; Lane2:PC-2/pBabe-puro cell; Lane3:PC-2 cell; Lane4:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
, 百拇医药
3 讨论
细胞凋亡和p53基因有密切关系，p53基因调节着细胞的生长和分化，在细胞周期中起着重要调节作用。肿瘤细胞的p53基因常呈突变或灭活状态。当野生型p53基因被激活后，细胞的生长减慢，发生分化或凋亡。一些癌基因的表达和诱导，可以抑制p53基因的作用，如Bcl-2的表达可以抑制依赖于p53基因功能的腺病毒E2A诱发的凋亡[10]。MDM2可以灭活p53基因与DNA结合和激活的功能，解除G1期受阻，使细胞重新进入细胞周期，抑制由p53基因诱发的细胞凋亡，并赋予细胞成瘤性[2]。
采用基因转移的方法，可恢复wtp53的功能，进而恢复程序性死亡的信号，使肿瘤细胞发生凋亡，而达到治疗肿瘤的目的。这一设想已在一些肿瘤细胞，如脑肿瘤、乳腺癌和头颈部肿瘤等得到证实，证明野生型p53基因不仅可以抑制这些细胞的生长，并可以诱导细胞出现凋亡[6～8]，但对胰腺癌是否有这种作用目前尚不十分清楚。本研究发现转染wtp53的人胰腺癌细胞出现凋亡，癌细胞生长受到抑制，表明恢复野生型p53基因的表达在胰腺癌的基因治疗中有一定意义。
, 百拇医药
wtp53的基因产物P53蛋白是一个转录因子，能对许多靶基因起调控作用，其中一个重要的靶基因是癌基因MDM2[2]。MDM2基因编码一个相对分子质量约90 000的蛋白，后者与P53蛋白结合，使P53蛋白功能受到抑制和丧失，p53基因与MDM2构成一种反馈调节。有文献报道在胶质瘤细胞，MDM2蛋白有阻止细胞凋亡发生的作用[11]，本实验结果也显示将pCMV-MDM2表达质粒转导入经wtp53转化的人胰腺癌PC-2细胞后，凋亡细胞明显较其母系细胞系PC-2/pBabe-swtp53细胞减少，说明MDM2具有拮抗wtp53诱发凋亡的作用，也提示wtp53在诱导凋亡发生中可能涉及到多个基因或生长因子间的相互作用和协调。
△国家教委博士科学专项科研基金(96002327)资助
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Lee JM,Bernstein A.Apoptosis,cancer and the p53 tumor suppressor gene.Cancer Metastasis Rev,1995,14:149～161
2 郭洪涛，刘彤华.MDM2癌基因的发现和研究进展.国外医学遗传学分册，1994，17:320～323
3 Chen Jie,Liu Tonghua,Guo Xiuying,et al.Two new human exocrine pancreatic carcinoma cell lines in vitro and in vivo. Chin Med J, 1990,103:369～375
4 Sambrook J,Ftitsch EF,Mauitis T.Molecular cloning.A laboratory manual.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988,362～371,792～793
, 百拇医药
5 郭洪涛，刘彤华，高 洁.人胰腺癌细胞中MDM2癌基因的表达和对野生型p53的拮抗作用.中华病理学杂志，1996，25：232～235
6 Rosenfeld MR,Meneses P,Dallman J, et al.Gene transfer of wild-type p53 results in restoration of tumor-suppresser function in a medulloblastoma cell line.Neurology,1995,45:1533～1539
7 Katayose Dai,Gudas J,Nguyen H, et al.Cytotoxic effects of adenovirus-mediated wild-type p53 protein expression in normal and mammary epithelial cells.Clin Cancer Res,1995,1:889～907
, 百拇医药
8 Liu TJ,EI-Naggar AK,Timothy J,et al.Apoptosis induction mediated by wild-type p53 adenovirus gene transfer in squamous cell carcinoma of the head and neck.Cancer Res,1995,55:3117～3122
9 Yang C, Cirielli C, Capogrossi MC, et al. Adenovirus-mediated wild-type p53 expression induces
apoptosis and suppresses tumorigenesis of prostatic tumorigenesis of prostatic tumor cells.Cancer Res,1995,55:4210～4213
, http://www.100md.com
10 Chiou SK,Rao L,White E,et al.Bcl-2 blocks p53 dependent apoptosis. Mol Cell Biol,1994,14:2556～2563
11 Kondo S,Barnett GH,Hara H,et al.MDM2 protein confers the resistance of a human glioblastoma cell line to cisplatin-induced apoptosis.Oncogene,1995,10:2001～2006
Murine Doube Minute 2 Oncogene Inhibited ApoptosisInduced by Retroviral-mediated Wild-type p53
Guo Hongtao Liu Tonghua Gao Jie
, 百拇医药
(PUMC Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100730)
Objective To investigate the interaction between Murine Doube Minute 2 (MDM2) oncogene and p53 gene in the evolution of apoptosis in pancreatic carcinoma.Methods A recombinant retroviral vector expressing wild-type p53 was constructed and packaged by packaging cell line PA317 cells using calcium phosphate coprecipitation method.The viral supernatant of the packaged vector was used to transfect the pancreatic carcinoma cell line(PC-2),a transformant cell line PC-2/swtp53 was then established.A recombinant vector pCMV-MDM2 was transduced into PC-2/swtp53 cells by lipofectin-mediated method, a double transfected cell line PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 was formed.Results By means of flow cytometry,in situ TdT analysis and DNA agarose gel electrophoresis,an increase of apoptosis was demonstrated in PC-2/swtp53 cell line (>12%)，whereas apoptosis was decreased in PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell line (3.2%).Conclusions MDM2 oncogene can inhibit apoptosis induced by wild-type p53 gene in pancreatic carcinoma.
Key words p53;oncogene;apoptosis;pancreatic carcinoma;MDM2
(1997-05-23收稿), 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院， 北京100730
关键词：p53；癌基因；凋亡；胰腺肿瘤；MDM2
ize 摘要 目的 研究MDM2癌基因与野生型p53基因在细胞凋亡发生中的相互关系。方法 构建了一个表达人野生型(wt)p53逆转录病毒载体，经PA317细胞包装后转染人胰腺癌细胞(PC-2)，建成PC-2/swtp53转化细胞系。再用含MDM2基因的pCMV-MDM2载体转染PC-2/swtp53细胞，获得双重转染细胞系PC-2/swtp53/pCMV-MDM2。用流式细胞技术，原位检测分析和DNA凝胶电泳分析细胞凋亡。结果 恢复wtp53表达的胰腺癌细胞系(PC-2/swtp53)细胞凋亡明显增多(>12%)，而双重转染的细胞系(PC-2/swtp53/pCMV-MDM2)则凋亡细胞数明显下降(3.2%)。结论 MDM2癌基因可抑制由野生型p53基因诱发的细胞凋亡。
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中图号 R735.9 Q784
野生型p53基因可以使细胞在G1期受阻、细胞生长速度变慢和诱发凋亡，而p53基因突变则使细胞生长失去控制，细胞凋亡明显减少[1]。MDM2蛋白可与P53蛋白结合，进而抑制和灭活P53蛋白[2]。为研究MDM2癌基因与p53基因两者在细胞凋亡发生中的相互关系，本实验选用含p53基因突变的人胰腺癌PC-2细胞为靶细胞，研究人胰腺癌细胞系表达野生型p53基因后对凋亡的诱导作用及MDM2过度表达在野生型p53基因诱导的细胞凋亡中的作用。
1 材料和方法
细胞系 人胰腺癌细胞系PC-2细胞为本室自建[3]，其p53基因第240位密码子有突变，培养在RPMI1640培养基中。包装细胞PA317培养在DMEM培养基中。两种培养基用时均补加10% FBS，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素。
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重组逆转录病毒载体 将全长2.3 kb、5′和3′端带有非转录顺序的野生型p53 cDNA片段，插入到逆转录病毒载体pBabe-puro(英国Imperial Cancer Research Fund的NR Lemoine博士赠)的多克隆位点BamHⅠ中，经克隆筛选，酶切鉴定出正义p53重组体，命名为pBabe-swtp53。
PA317细胞包装和转染PC-2细胞 利用磷酸钙沉淀法[4]，用PA317细胞包装重组载体pBabe-swtp53和空病毒pBabe-puro载体，分别收集两种载体的病毒上清(加8 μg/ml polybrene)转染人胰腺癌PC-2细胞系，建成含正义野生型p53基因的转化细胞系PC-2/pBabe-swtp53和用空病毒转化的细胞系PC-2/pBabe-puro。
MDM2癌基因表达载体的转染 将PC-2/pBabe-swtp53细胞以5×105个细胞/孔接种于6孔板上，培养48 h后，用pCMV-neo和pCMV-MDM2重组载体(美国Johns Hopkins Oncology Center的Vogelstein教授赠)，按文献5方法转染细胞。所获得的双重转化细胞系为PC-2/swtp53/pCMV-MDM2和PC-2/swtp53/pCMV-neo。
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用PCR技术分析外源p53基因的插入 为检测转染的细胞是否有外源p53基因的整合，采用两对特异性引物。第一对引物,primer A,5′-TACTCCCTGCCCTCAACAAGA-3′和primer B,5′-CTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGC-3′，该引物对不含内含子的p53 cDNA可扩出一条约546 bp的片段，而对基因组中的p53基因，在同样的反应条件极难扩出，因而可鉴别外源和内源性p53基因。第二对引物为针对基因组的引物，primer C,5′-TGTTATCTCCTA-
GGTTGGCTCTGAC-3′,对应于第6内含子和第7外显子起始处，primer D,5′-GGAATTCAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′，对应于第7外显子的最后4个核苷酸和第7内含子，对内源性p53基因组DNA可扩出一条143 bp的片段。
PCR反应体积为50 μl，含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，模板0.5 μg,Taq酶2 U，引物浓度各50 pmol/L，反应条件是95℃预变性5 min,94℃ 60 s，52.5℃ 60 s，72℃ 80 s，循环35次，然后72℃，延伸7 min。
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免疫沉淀法检测外源p53基因的表达 选用Oncogene Science公司的PAb1620单克隆抗体，该抗体可特异识别野生型P53蛋白[6]。用35S蛋氨酸标记PC-2，PC-2/pBabe-puro、PC-2/pBabe-swtp53和PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞，提取的裂解产物与PAb1620抗体进行免疫沉淀反应，标本在8%SDS-PAGE上电泳并用X-光片显影[7]。
Western blot分析 按文献4方法进行。
原位检测细胞凋亡 参考原位凋亡细胞检测试剂盒(Boehringer Mannheim)说明书和有关文献[8]，用胰酶消化、收集细胞，制成细胞涂片，多聚甲醛固定2 min后，每张玻片滴加TUNEL(Terminal Deoxynucleotidyl Trasferase Mediated dUTP Nick End Labeling)反应混合液，37℃ 60 min，再用PI(propidium iodide)和RNase混合液染色30 min，置荧光显微镜下观察。
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流式细胞仪测定 培养的细胞经胰酶消化，离心收集,PBS洗涤，70%乙醇固定后重溶于PBS中，细胞密度为1×106/ml， 加RNase 37℃ 1 h,再加PI(50 μg/ml)，避光染色60 min，以淋巴细胞为正常2倍体细胞，在FACScan流式细胞仪(美国Becton Dickinson)上测定凋亡细胞比例，每组测定104个细胞。
DNA凝胶电泳分析 按文献9方法进行。
2 结果
外源p53 cDNA的插入和整合 提取细胞的DNA，经PCR扩增后，凝胶电泳显示PC-2/pBabe-swtp53、PC-2/swtp53/pCMV-neo和PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞DNA中均可扩出一条546 bp的片段，说明这几株细胞系均有外源p53 cDNA的插入和整合(图1)。
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图1 转化细胞中的p53 cDNA 插入和整合
Fig 1 Identification of integration of p53 cDNA into host cell genome by PCR analysis
Lane1:pBR322/Hinf Ⅰ marker; Lane2: PC-2/pBabe-swtp53 cell; Lane3:PC-2/swtp53/pCMV-neo cell; Lane4:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2； Lane5:PC-2 cell
图2 野生型P53蛋白在转化细胞系的表达
Fig 2 Immunoprecititation of wild-type P53 protein from transfected cells
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Lane1:PC-2 cell; Lane2:PC-2/pBabe-puro cell; Lane3:PC-2/pBabe-swtp53；Lane4:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
MW:molecular weight
免疫沉淀分析结果 免疫沉淀显示，PC-2/pBabe-swtp53和PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞有相对分子质量为53 000的沉淀带，说明这两株细胞中均有野生型P53蛋白的表达，而PC-2和PC-2/pBabe-puro细胞中未见有wtp53沉淀带(图2)。
MDM2基因的表达 Western blot结果表明PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞有MDM2(相对分子质量90 000)表达，而PC-2/swtp53/pCMV-neo和PC-2/pBabe-swtp53没有MDM2表达(图3)。
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图3 双重转化细胞MDM2蛋白的Western blot分析结果
Fig 3 Western blot analysis of MDM2 protein in transfected cell
Lane1:PC-2/pBabe-swtp53 cell; Lane2:PC-2/swtp53/pCMV-neo cell; Lane3:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
MW:molecular weight
细胞凋亡测定结果 流式细胞仪测定表明，PC-2细胞和PC-2/pBabe-puro细胞的细胞凋亡数少于1%，PC-2/pBabe-swtp53和PC-2/swtp53/pCMV-neo细胞的凋亡数明显升高(12.1%～12.9%)，经wtp53和MDM2双重转染的PC-2/swtp53/pCMV-MDM2细胞的凋亡数降至3.2%(图4)。经TUNEL反应后，在荧光显微镜下观察，PC-2细胞几乎均呈生长状态的桔红色荧光，而PC-2/pBabe-swtp53细胞中出现了一些呈绿色荧光的凋亡细胞。DNA凝胶电泳结果显示在PC-2/pBabe-swtp53细胞中可见DNA laddering(图5)，即有细胞凋亡发生。
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图4 凋亡细胞的流式细胞仪分析结果
Fig 4 FCM analysis of apoptosis
1.PC-2 cell; 2.PC-2/pBabe-puro cell;3.PC-2/pBabe-swtp53；4.PC-2/swtp53/pCMV-neo cell；5.PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
图5 转化细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳
Fig 5 Agarose gel electrophoresis of DNA from transformant cells
Lane1:PC-2/pBabe-swtp53; Lane2:PC-2/pBabe-puro cell; Lane3:PC-2 cell; Lane4:PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell
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3 讨论
细胞凋亡和p53基因有密切关系，p53基因调节着细胞的生长和分化，在细胞周期中起着重要调节作用。肿瘤细胞的p53基因常呈突变或灭活状态。当野生型p53基因被激活后，细胞的生长减慢，发生分化或凋亡。一些癌基因的表达和诱导，可以抑制p53基因的作用，如Bcl-2的表达可以抑制依赖于p53基因功能的腺病毒E2A诱发的凋亡[10]。MDM2可以灭活p53基因与DNA结合和激活的功能，解除G1期受阻，使细胞重新进入细胞周期，抑制由p53基因诱发的细胞凋亡，并赋予细胞成瘤性[2]。
采用基因转移的方法，可恢复wtp53的功能，进而恢复程序性死亡的信号，使肿瘤细胞发生凋亡，而达到治疗肿瘤的目的。这一设想已在一些肿瘤细胞，如脑肿瘤、乳腺癌和头颈部肿瘤等得到证实，证明野生型p53基因不仅可以抑制这些细胞的生长，并可以诱导细胞出现凋亡[6～8]，但对胰腺癌是否有这种作用目前尚不十分清楚。本研究发现转染wtp53的人胰腺癌细胞出现凋亡，癌细胞生长受到抑制，表明恢复野生型p53基因的表达在胰腺癌的基因治疗中有一定意义。
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wtp53的基因产物P53蛋白是一个转录因子，能对许多靶基因起调控作用，其中一个重要的靶基因是癌基因MDM2[2]。MDM2基因编码一个相对分子质量约90 000的蛋白，后者与P53蛋白结合，使P53蛋白功能受到抑制和丧失，p53基因与MDM2构成一种反馈调节。有文献报道在胶质瘤细胞，MDM2蛋白有阻止细胞凋亡发生的作用[11]，本实验结果也显示将pCMV-MDM2表达质粒转导入经wtp53转化的人胰腺癌PC-2细胞后，凋亡细胞明显较其母系细胞系PC-2/pBabe-swtp53细胞减少，说明MDM2具有拮抗wtp53诱发凋亡的作用，也提示wtp53在诱导凋亡发生中可能涉及到多个基因或生长因子间的相互作用和协调。
△国家教委博士科学专项科研基金(96002327)资助
参 考 文 献
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1 Lee JM,Bernstein A.Apoptosis,cancer and the p53 tumor suppressor gene.Cancer Metastasis Rev,1995,14:149～161
2 郭洪涛，刘彤华.MDM2癌基因的发现和研究进展.国外医学遗传学分册，1994，17:320～323
3 Chen Jie,Liu Tonghua,Guo Xiuying,et al.Two new human exocrine pancreatic carcinoma cell lines in vitro and in vivo. Chin Med J, 1990,103:369～375
4 Sambrook J,Ftitsch EF,Mauitis T.Molecular cloning.A laboratory manual.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988,362～371,792～793
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Murine Doube Minute 2 Oncogene Inhibited ApoptosisInduced by Retroviral-mediated Wild-type p53
Guo Hongtao Liu Tonghua Gao Jie
, 百拇医药
(PUMC Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100730)
Objective To investigate the interaction between Murine Doube Minute 2 (MDM2) oncogene and p53 gene in the evolution of apoptosis in pancreatic carcinoma.Methods A recombinant retroviral vector expressing wild-type p53 was constructed and packaged by packaging cell line PA317 cells using calcium phosphate coprecipitation method.The viral supernatant of the packaged vector was used to transfect the pancreatic carcinoma cell line(PC-2),a transformant cell line PC-2/swtp53 was then established.A recombinant vector pCMV-MDM2 was transduced into PC-2/swtp53 cells by lipofectin-mediated method, a double transfected cell line PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 was formed.Results By means of flow cytometry,in situ TdT analysis and DNA agarose gel electrophoresis,an increase of apoptosis was demonstrated in PC-2/swtp53 cell line (>12%)，whereas apoptosis was decreased in PC-2/swtp53/pCMV-MDM2 cell line (3.2%).Conclusions MDM2 oncogene can inhibit apoptosis induced by wild-type p53 gene in pancreatic carcinoma.
Key words p53;oncogene;apoptosis;pancreatic carcinoma;MDM2
(1997-05-23收稿), 百拇医药