苯丙氨酸羟化酶基因新突变位点与临床的关系
作者：顾学范 张眉 叶军 陈瑞冠
单位：200092上海，上海市儿科医学研究所(顾学范、叶军、陈瑞冠)；上海第二医科大学附属新华医院 (张眉)
关键词：苯丙酮尿症；苯丙氨酸羟化酶突变；基因型；表型
中华儿科杂志990505 【摘要】 目的 观察新发现的两种苯丙氨酸羟化酶基因突变与临床表现型的关系，对其中一个位点进行基因表达的研究。方法 通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)突变检测和固相DNA直接序列分析等方法，对58例苯丙酮尿症(PKU)患儿进行突变检测，对新突变进行体外寡核苷酸定点诱变和在COS细胞中PAH活性表达研究。结果 共发现有IVS6nt-1的G→A突变和Arg252Gln突变的患儿7例，均有典型的PKU临床表现，并有不同程度的智能低下，苯丙氨酸浓度均大于1.2 mmol/L。带有Arg252Gln突变位点的cDNA表达的PAH酶活性为野生型的24%。结论 上述两种新发现的突变是致病性的，但相同基因型的患者临床表现并不均一；携带Arg252Gln位点突变的患者PAH酶活性明显降低。
, 百拇医药
The correlation of genotypes and phenotypes for two novel mutations in phenylalanine hydroxylase gene GU Xuefan, ZHANG Mei, YE Jun, et al. Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To determine the correlation of the genotype and the phenotype for two novel mutations in phenyla lanine hydroxylase gene, and to study the expression of one of the mutated genes. Methods The mutations were analysed using denaturing gradient gel electrophoresis, DNA direct sequencing and in vitro expression. Results Seven children with the mutations of G→A in IVS6nt-1 and Arg252Gln manifested clinically with the typical phenylketonuria and mental retartation. The concentration of phenylalanine in the children were all more than 1 200 μmol/L. The mutation of IVS6nt-1 is an intron-exon junctional mutation that results in a splicing defect in mRNA. The residual PAH activity of Arg252Gln is only 24% of the wild type in mutagenesis in vitro and expressions in COS cells. Conclusion The patients carrying these two mutations demonstrated a strong correlation between genotypes and phenotypes, but clinical manifestations were not homogenous for the same mutation.
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【Key words】 Phenylketonuria Phenylalanine hydroxylase Mutation Genotype Phenotype
苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是因苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因突变所致的氨基酸代谢障碍疾病，属常染色体隐性遗传。新生儿筛查资料显示，中国人群PKU发病率约为1/15 538[1]。我们在联合运用聚合酶链反应(PCR)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electro- phoresis, DGGE)、固相DNA直接序列分析及限制性内切酶谱分析等突变分析研究中发现了两种新的基因突变(Arg252Gln，IVS6nt-1)[2，3]。本研究在此基础上进一步对突变进行基因表达研究，并分析上述两种突变与相关临床表型之间的关系。
材料及方法
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一、材料
1.检测对象：58例经典型PKU患儿均系在上海第二医科大学附属新华医院及上海市儿科医学研究所诊治的病例，其父母来自上海、江苏、浙江、安徽等省市。患儿除有典型PKU的临床表现和智能落后外，血清苯丙氨酸浓度均大于1.2 mmol/L(200 mg/L)。
2.DNA标本提取：取患儿及其父母静脉血，从5ml新鲜血中分离白细胞，经蛋白酶K消化，氯仿抽提基因组DNA。
二、方法
1.PCR扩增：对所有的DNA标本采用PCR扩增PAH基因外显子7及其两端部分内含子序列。采用微机软件设计PCR引物及引物的人工GC丰富区。引物序列：引物1为5′-cctagtgcctctgactcatggtga-3′，引物2为5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCG CCCCCGCCCGgaccagccagcaaatgaaccc-3′。在热循环仪上进行PCR，反应总体积为50 μl，94℃ 3分钟，然后行94℃ 30秒，56℃ 40秒，72℃ 50 秒，35个循环，72℃ 5分钟，最后98℃ 5分钟，72℃ 5分钟，使之形成异源DNA杂交双链片段或同源DNA双链片段。
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2.DGGE突变检测和固相DNA直接序列分析：上述PCR产物均进行DGGE分析。采用软件计算扩增产物片段每个碱基对的解链温度[4，5]和变性剂(甲酰胺及尿素)的浓度梯度，在8%聚丙酰胺凝胶含40%～65%的梯度变性剂电泳上电泳3～4小时(100%变性为7 mol/L尿素及40%甲酰氨)。紫外线透射仪上检测电泳条带并拍片。对出现异常DGGE电泳条带者进行DNA序列分析[6]。DNA测序采用生物素标记的引物重新进行PCR，将PCR产物30 μl与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(Dynabeads-280)25 μl混合，经过0.1 mol/L NaOH处理和洗涤，制备单链模板，用测序药盒(USB V2.0)进行测序反应，按厂商提供的方法在Bio-Rad测序仪上电泳、干胶和压片。
3.限制性内切酶谱分析：取PCR产物9 μl加入限制性内切酶DdeⅠ5 U及酶切缓冲液至总体积10 μl，在37℃水浴中温育3小时，在8%聚丙酰胺凝胶上分离条带，EB染色，UV透射仪上检测条带并拍片。DdeⅠ酶可检测或筛查Arg252Gln突变。
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4.体外寡核苷酸定点诱变(site direct mutagenesis)与基因表达：为进一步明确新发现基因突变点的功能和病理意义，对Arg252Gln与已知突变点的Arg243Gln(阳性对照)进行了体外定点诱变与基因表达研究。定点诱变采用Bio-Rad Mutagenesis药盒。含有PAH外显子6～13的1.55 kb片段用PstI-EcoRI从质粒pSVhPAH(ATCC 61604)中切出，克隆到M13mp18噬菌体中，寡核苷酸定点诱变引物分别使用252-ctttcctctcaggatttcttg和243-ttccgcctccaacctgtggct。定点诱变最后用DNA测序证实。 PAH基因表达研究使用含有全长PAH cDNA片段的pSVhPAH质粒，带有早期SV40启动子。经用含有252突变和243突变的1.55 kb片断替代正常片段，构建形成pSVh252Q与pSVh243Q两种质粒。COS细胞经磷酸钙处理转入质粒，在DMEM中培养40小时后收获。细胞匀浆与14C-苯丙氨酸培养，经薄板层析，计算苯丙氨酸转化成酪氨酸的量。
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结 果
一、DNA序列分析结果
对所有DGGE表现有异常带型的标本进行DNA序列分析，我们在58例患儿PAH基因中发现两种未见报道的突变位点，第一种是IVS6nt-1，为外显子和内含子连接部位突变，可导致mRNA剪切异常；第二种为Arg252Gln，位于外显子7区域。
二、突变位点基因频率
根据DGGE结果及DNA序列分析，发现3例PKU患者携带Ivs6nt-1突变，其基因频率为2.6%。4例携带Arg252Gln突变位点，其基因频率为3.5%。由于Arg252Gln突变产生一个DdeⅠ酶切位点，可将外显子7 PCR扩增片段切为108 bp和183 bp两条片段。采用此方法分析，该突变频率结果与DGGE和序列分析结果完全一致。
三、基因突变表达
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表达质粒pSVh252Q与pSVh243Q经体外寡核苷酸定点诱变与在COS细胞表达，新发现的Arg252Gln cDNA表达的酶活性仅为野生型的24%。在相同条件下，Arg243Gln的cDNA表达的酶活性为17%，与国外文献报告接近。基因突变表达的薄板层析结果见图1。
1.为正常PAH cDNA，苯丙氨酸转化为酪氨酸的转化率为100%；2.为带有Arg243Gln突变的cDNA，转化率为正常PAH的17%；3.带有Arg252Gln突变的cDNA，转化率为正常PAH的24%；4.无PAH cDNA的细胞浆，转化率为0%
图1 苯丙氨酸羟化酶转化苯丙氨酸为酪氨酸的薄板层析分析(TLC)
四、携带新突变位点的PKU患儿临床表型
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携带两种新突变位点的患儿共有7例，其中3例携带Ivs6nt-1位点，另一突变位置不明。4例携带Arg252Gln/Arg243Gln突变，两种突变分别来自其父母。 7例患儿都是未经新生儿筛查的病例，最小一例4个月龄就发病、来我院就诊，所有患儿均表现有明显智能低下，2例CT检查发现有脑萎缩，1例为婴儿痉挛症样发作，其余病例无明显抽搐发生。
讨 论
迄今为止，已经发现并报道的PAH基因突变位点在300种以上。据报道，高加索人约1/3左右PAH基因突变位点位于外显子7[7]。外显子7位于PAH蛋白质核心区，与氧分子或辅因子结合、底物催化等功能有密切关系，其碱基突变易导致酶活性受损，因此是基因突变分析的重点。Arg252Trp突变是地中海地区人群较常见突变类型，在吉普赛人群中也被检出，并已被体外实验证实能导致PAH酶活性极度下降[8，9]。本研究报道的252密码子突变是一种新突变，该密码子第2位碱基发生G→A置换，导致了所编码的氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺(Arg252Gln)。体外基因cDNA表达表明，其PAH酶残余活性仅为野生型的24%。对4例Arg252Gln患者的突变研究还表明，4例带有Arg252Gln突变的患者，其另一等位基因均为Arg243Gln突变，两种突变都导致酶活性严重降低，使临床出现典型的PKU症状。Arg252Gln突变可采用限制性内切酶谱检测，突变在PCR扩增片段上产生一个Dde I内切酶新的识别位点，这一切口既可证实PCR-DGGE和DNA序列分析检测结果，同时也为调查基因频率分布和筛选突变位点提供了快速和方便的检测手段。
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另一个突变新位点IVS6nt-1位于外显子7与内含子6交界处，该类型突变能导致PAH基因外显子7的mRNA在加工过程中发生剪切错误，从而导致外显子7部分或全部缺失，最终导致PAH酶活性的严重受损。
携带Arg252Gln和IVS6nt-1新位点突变的7例PKU患儿，临床症状均较为严重。患者表型的严重性可能与以下因素有关：(1)携带Ivs6nt-1位点者，由于该等位基因所转录的mRNA严重受损，酶活性可能丧失，另外一个等位基因的突变如果也明显影响PAH酶活性，则患者发病年龄早，临床表现严重。(2)携带Arg252Gln位点者，由于双亲来源的突变均位于外显子7，我们能够清楚了解出现的临床表型。由于Arg252Gln和Arg243Gln位点的突变均可以严重影响PAH酶活性，因此导致了患者出现严重的智能低下。
总之，我们新发现的Arg252Gln和Ivs6nt-1这两种突变均导致患者出现严重的智能落后，但在相同基因型患者中，其临床表型(发病年龄、抽搐，脑萎缩等)并不完全一致。推测其原因，可能与下列因素有关：(1)就诊年龄；(2)其他未知因素(如出生前后的环境、脑细胞对高苯丙氨酸及其异常产物的耐受程度等)。近来有学者报道，部分PKU患者基因型和表型不相符合，例如发现I65T、Y414C突变者有的为PKU严重型，有些则为轻型，甚至是高苯丙氨酸血症者[10]。有关临床表型与某些基因型的相互关联，还有待进一步探讨。
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本课题由国家自然科学基金资助(基金项目编号：39400142)
参考文献
1 顾学范，叶军，陈瑞冠，等.我国八大城市新生儿筛查5年回顾.中华儿科杂志，1997，35:655-656.
2 张眉，顾学范，张美华，等.中国南方人苯丙氨酸羟化酶基因外显子7点突变及其频率分析.中华医学遗传学杂志，1995，12：324-326.
3 张眉，沈永年，张雅芬，等.应用PCR-变性梯度凝胶电泳快速分析苯丙氨酸羟化酶基因突变.上海医科大学学报，1997，24(医学遗传学专辑)：13-16.
4 Lerman LS, Silverstein K. Computational simulation of DNA melting and its application to denaturing gradient gel electrophoresis. Methods Enzymol，1987，155: 482, 501, 527.
, 百拇医药
5 Gu XF, De Rooij F, Voortman G，et al. Detection of eleven mutations causing acute intermittent porphyria using denaturing gradient gel electrophoresis. Human Genetics，1994，93:47-52.
6 Hutman T, Stahl S, Hornes E, et al. Direct sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support. Nucleic Acids Res, 1989，17:4937-1946.
7 Eisensmith RC, Woo SL. Molecular basis of phenylketonuria and related hyperphenylalaninemias: mutations and polymorphisms in the human phenylalanine hydroxylase gene. Hum Mutat，1992，1:13-23.
, http://www.100md.com
8 Okano Y, Wang T, Eisensmith RC, et al. PKU missense mutations in the Mediterranean. Genomics,1991,9:96-103.
9 Kalanin J, Takarada Y, Kagawa S, et al. Gypsy phenylketonuria: a point mutation of the phenylalanine hydroxylase gene in Gypsy families from Slovakia. Am J Med Genet，1994，49:235-239.
10 Kayaalp E, Treacy E, Waters PJ,et al.Human phenylalanine hydroxylase mutations and hyperphenylalaninemia phenotypes: a metanalysis of genotype-phenotype correlations. Am J Hum Genet, 1997, 61: 1309-1317.
(收稿：1998-05-06 修回：1999-01-08), 百拇医药
单位：200092上海，上海市儿科医学研究所(顾学范、叶军、陈瑞冠)；上海第二医科大学附属新华医院 (张眉)
关键词：苯丙酮尿症；苯丙氨酸羟化酶突变；基因型；表型
中华儿科杂志990505 【摘要】 目的 观察新发现的两种苯丙氨酸羟化酶基因突变与临床表现型的关系，对其中一个位点进行基因表达的研究。方法 通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)突变检测和固相DNA直接序列分析等方法，对58例苯丙酮尿症(PKU)患儿进行突变检测，对新突变进行体外寡核苷酸定点诱变和在COS细胞中PAH活性表达研究。结果 共发现有IVS6nt-1的G→A突变和Arg252Gln突变的患儿7例，均有典型的PKU临床表现，并有不同程度的智能低下，苯丙氨酸浓度均大于1.2 mmol/L。带有Arg252Gln突变位点的cDNA表达的PAH酶活性为野生型的24%。结论 上述两种新发现的突变是致病性的，但相同基因型的患者临床表现并不均一；携带Arg252Gln位点突变的患者PAH酶活性明显降低。
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The correlation of genotypes and phenotypes for two novel mutations in phenylalanine hydroxylase gene GU Xuefan, ZHANG Mei, YE Jun, et al. Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To determine the correlation of the genotype and the phenotype for two novel mutations in phenyla lanine hydroxylase gene, and to study the expression of one of the mutated genes. Methods The mutations were analysed using denaturing gradient gel electrophoresis, DNA direct sequencing and in vitro expression. Results Seven children with the mutations of G→A in IVS6nt-1 and Arg252Gln manifested clinically with the typical phenylketonuria and mental retartation. The concentration of phenylalanine in the children were all more than 1 200 μmol/L. The mutation of IVS6nt-1 is an intron-exon junctional mutation that results in a splicing defect in mRNA. The residual PAH activity of Arg252Gln is only 24% of the wild type in mutagenesis in vitro and expressions in COS cells. Conclusion The patients carrying these two mutations demonstrated a strong correlation between genotypes and phenotypes, but clinical manifestations were not homogenous for the same mutation.
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【Key words】 Phenylketonuria Phenylalanine hydroxylase Mutation Genotype Phenotype
苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是因苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因突变所致的氨基酸代谢障碍疾病，属常染色体隐性遗传。新生儿筛查资料显示，中国人群PKU发病率约为1/15 538[1]。我们在联合运用聚合酶链反应(PCR)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electro- phoresis, DGGE)、固相DNA直接序列分析及限制性内切酶谱分析等突变分析研究中发现了两种新的基因突变(Arg252Gln，IVS6nt-1)[2，3]。本研究在此基础上进一步对突变进行基因表达研究，并分析上述两种突变与相关临床表型之间的关系。
材料及方法
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一、材料
1.检测对象：58例经典型PKU患儿均系在上海第二医科大学附属新华医院及上海市儿科医学研究所诊治的病例，其父母来自上海、江苏、浙江、安徽等省市。患儿除有典型PKU的临床表现和智能落后外，血清苯丙氨酸浓度均大于1.2 mmol/L(200 mg/L)。
2.DNA标本提取：取患儿及其父母静脉血，从5ml新鲜血中分离白细胞，经蛋白酶K消化，氯仿抽提基因组DNA。
二、方法
1.PCR扩增：对所有的DNA标本采用PCR扩增PAH基因外显子7及其两端部分内含子序列。采用微机软件设计PCR引物及引物的人工GC丰富区。引物序列：引物1为5′-cctagtgcctctgactcatggtga-3′，引物2为5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCG CCCCCGCCCGgaccagccagcaaatgaaccc-3′。在热循环仪上进行PCR，反应总体积为50 μl，94℃ 3分钟，然后行94℃ 30秒，56℃ 40秒，72℃ 50 秒，35个循环，72℃ 5分钟，最后98℃ 5分钟，72℃ 5分钟，使之形成异源DNA杂交双链片段或同源DNA双链片段。
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2.DGGE突变检测和固相DNA直接序列分析：上述PCR产物均进行DGGE分析。采用软件计算扩增产物片段每个碱基对的解链温度[4，5]和变性剂(甲酰胺及尿素)的浓度梯度，在8%聚丙酰胺凝胶含40%～65%的梯度变性剂电泳上电泳3～4小时(100%变性为7 mol/L尿素及40%甲酰氨)。紫外线透射仪上检测电泳条带并拍片。对出现异常DGGE电泳条带者进行DNA序列分析[6]。DNA测序采用生物素标记的引物重新进行PCR，将PCR产物30 μl与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(Dynabeads-280)25 μl混合，经过0.1 mol/L NaOH处理和洗涤，制备单链模板，用测序药盒(USB V2.0)进行测序反应，按厂商提供的方法在Bio-Rad测序仪上电泳、干胶和压片。
3.限制性内切酶谱分析：取PCR产物9 μl加入限制性内切酶DdeⅠ5 U及酶切缓冲液至总体积10 μl，在37℃水浴中温育3小时，在8%聚丙酰胺凝胶上分离条带，EB染色，UV透射仪上检测条带并拍片。DdeⅠ酶可检测或筛查Arg252Gln突变。
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4.体外寡核苷酸定点诱变(site direct mutagenesis)与基因表达：为进一步明确新发现基因突变点的功能和病理意义，对Arg252Gln与已知突变点的Arg243Gln(阳性对照)进行了体外定点诱变与基因表达研究。定点诱变采用Bio-Rad Mutagenesis药盒。含有PAH外显子6～13的1.55 kb片段用PstI-EcoRI从质粒pSVhPAH(ATCC 61604)中切出，克隆到M13mp18噬菌体中，寡核苷酸定点诱变引物分别使用252-ctttcctctcaggatttcttg和243-ttccgcctccaacctgtggct。定点诱变最后用DNA测序证实。 PAH基因表达研究使用含有全长PAH cDNA片段的pSVhPAH质粒，带有早期SV40启动子。经用含有252突变和243突变的1.55 kb片断替代正常片段，构建形成pSVh252Q与pSVh243Q两种质粒。COS细胞经磷酸钙处理转入质粒，在DMEM中培养40小时后收获。细胞匀浆与14C-苯丙氨酸培养，经薄板层析，计算苯丙氨酸转化成酪氨酸的量。
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结 果
一、DNA序列分析结果
对所有DGGE表现有异常带型的标本进行DNA序列分析，我们在58例患儿PAH基因中发现两种未见报道的突变位点，第一种是IVS6nt-1，为外显子和内含子连接部位突变，可导致mRNA剪切异常；第二种为Arg252Gln，位于外显子7区域。
二、突变位点基因频率
根据DGGE结果及DNA序列分析，发现3例PKU患者携带Ivs6nt-1突变，其基因频率为2.6%。4例携带Arg252Gln突变位点，其基因频率为3.5%。由于Arg252Gln突变产生一个DdeⅠ酶切位点，可将外显子7 PCR扩增片段切为108 bp和183 bp两条片段。采用此方法分析，该突变频率结果与DGGE和序列分析结果完全一致。
三、基因突变表达
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表达质粒pSVh252Q与pSVh243Q经体外寡核苷酸定点诱变与在COS细胞表达，新发现的Arg252Gln cDNA表达的酶活性仅为野生型的24%。在相同条件下，Arg243Gln的cDNA表达的酶活性为17%，与国外文献报告接近。基因突变表达的薄板层析结果见图1。
1.为正常PAH cDNA，苯丙氨酸转化为酪氨酸的转化率为100%；2.为带有Arg243Gln突变的cDNA，转化率为正常PAH的17%；3.带有Arg252Gln突变的cDNA，转化率为正常PAH的24%；4.无PAH cDNA的细胞浆，转化率为0%
图1 苯丙氨酸羟化酶转化苯丙氨酸为酪氨酸的薄板层析分析(TLC)
四、携带新突变位点的PKU患儿临床表型
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携带两种新突变位点的患儿共有7例，其中3例携带Ivs6nt-1位点，另一突变位置不明。4例携带Arg252Gln/Arg243Gln突变，两种突变分别来自其父母。 7例患儿都是未经新生儿筛查的病例，最小一例4个月龄就发病、来我院就诊，所有患儿均表现有明显智能低下，2例CT检查发现有脑萎缩，1例为婴儿痉挛症样发作，其余病例无明显抽搐发生。
讨 论
迄今为止，已经发现并报道的PAH基因突变位点在300种以上。据报道，高加索人约1/3左右PAH基因突变位点位于外显子7[7]。外显子7位于PAH蛋白质核心区，与氧分子或辅因子结合、底物催化等功能有密切关系，其碱基突变易导致酶活性受损，因此是基因突变分析的重点。Arg252Trp突变是地中海地区人群较常见突变类型，在吉普赛人群中也被检出，并已被体外实验证实能导致PAH酶活性极度下降[8，9]。本研究报道的252密码子突变是一种新突变，该密码子第2位碱基发生G→A置换，导致了所编码的氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺(Arg252Gln)。体外基因cDNA表达表明，其PAH酶残余活性仅为野生型的24%。对4例Arg252Gln患者的突变研究还表明，4例带有Arg252Gln突变的患者，其另一等位基因均为Arg243Gln突变，两种突变都导致酶活性严重降低，使临床出现典型的PKU症状。Arg252Gln突变可采用限制性内切酶谱检测，突变在PCR扩增片段上产生一个Dde I内切酶新的识别位点，这一切口既可证实PCR-DGGE和DNA序列分析检测结果，同时也为调查基因频率分布和筛选突变位点提供了快速和方便的检测手段。
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另一个突变新位点IVS6nt-1位于外显子7与内含子6交界处，该类型突变能导致PAH基因外显子7的mRNA在加工过程中发生剪切错误，从而导致外显子7部分或全部缺失，最终导致PAH酶活性的严重受损。
携带Arg252Gln和IVS6nt-1新位点突变的7例PKU患儿，临床症状均较为严重。患者表型的严重性可能与以下因素有关：(1)携带Ivs6nt-1位点者，由于该等位基因所转录的mRNA严重受损，酶活性可能丧失，另外一个等位基因的突变如果也明显影响PAH酶活性，则患者发病年龄早，临床表现严重。(2)携带Arg252Gln位点者，由于双亲来源的突变均位于外显子7，我们能够清楚了解出现的临床表型。由于Arg252Gln和Arg243Gln位点的突变均可以严重影响PAH酶活性，因此导致了患者出现严重的智能低下。
总之，我们新发现的Arg252Gln和Ivs6nt-1这两种突变均导致患者出现严重的智能落后，但在相同基因型患者中，其临床表型(发病年龄、抽搐，脑萎缩等)并不完全一致。推测其原因，可能与下列因素有关：(1)就诊年龄；(2)其他未知因素(如出生前后的环境、脑细胞对高苯丙氨酸及其异常产物的耐受程度等)。近来有学者报道，部分PKU患者基因型和表型不相符合，例如发现I65T、Y414C突变者有的为PKU严重型，有些则为轻型，甚至是高苯丙氨酸血症者[10]。有关临床表型与某些基因型的相互关联，还有待进一步探讨。
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本课题由国家自然科学基金资助(基金项目编号：39400142)
参考文献
1 顾学范，叶军，陈瑞冠，等.我国八大城市新生儿筛查5年回顾.中华儿科杂志，1997，35:655-656.
2 张眉，顾学范，张美华，等.中国南方人苯丙氨酸羟化酶基因外显子7点突变及其频率分析.中华医学遗传学杂志，1995，12：324-326.
3 张眉，沈永年，张雅芬，等.应用PCR-变性梯度凝胶电泳快速分析苯丙氨酸羟化酶基因突变.上海医科大学学报，1997，24(医学遗传学专辑)：13-16.
4 Lerman LS, Silverstein K. Computational simulation of DNA melting and its application to denaturing gradient gel electrophoresis. Methods Enzymol，1987，155: 482, 501, 527.
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5 Gu XF, De Rooij F, Voortman G，et al. Detection of eleven mutations causing acute intermittent porphyria using denaturing gradient gel electrophoresis. Human Genetics，1994，93:47-52.
6 Hutman T, Stahl S, Hornes E, et al. Direct sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support. Nucleic Acids Res, 1989，17:4937-1946.
7 Eisensmith RC, Woo SL. Molecular basis of phenylketonuria and related hyperphenylalaninemias: mutations and polymorphisms in the human phenylalanine hydroxylase gene. Hum Mutat，1992，1:13-23.
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8 Okano Y, Wang T, Eisensmith RC, et al. PKU missense mutations in the Mediterranean. Genomics,1991,9:96-103.
9 Kalanin J, Takarada Y, Kagawa S, et al. Gypsy phenylketonuria: a point mutation of the phenylalanine hydroxylase gene in Gypsy families from Slovakia. Am J Med Genet，1994，49:235-239.
10 Kayaalp E, Treacy E, Waters PJ,et al.Human phenylalanine hydroxylase mutations and hyperphenylalaninemia phenotypes: a metanalysis of genotype-phenotype correlations. Am J Hum Genet, 1997, 61: 1309-1317.
(收稿：1998-05-06 修回：1999-01-08), 百拇医药