长波紫外线照射对培养的正常人黑素细胞增殖及黑素合成的影响
作者：项蕾红 郑志忠 祝绿川 廖康煌
单位：200040上海医科大学附属华山医院皮肤科
关键词：紫外线黑素细胞细胞；培养的
中华皮肤科杂志/990610
【摘要】目的 了解UVA对黑素细胞增殖及黑素合成的影响。方法采用体外细胞培养技术、MTT法及NaOH法研究不同剂量UVA照射对黑素细胞增殖和黑素合成的作用。结果随着照射时间的增加，黑素细胞的增殖率增加，黑素合成量也增加。结论照射剂量在3.6J/cm2以内时，黑素细胞增殖率逐步上升，以后趋向稳定。在测定的照射剂量内，黑素合成量与照射剂量呈正相关。
Effects of UVA Radiation on Proliferation
, 百拇医药
and Melanogenesis of Normal Human Melanocytes in Vitro
XIANG Leihong, ZHENG Zhizhong, ZHU Luchuan, et al.
Department of Dermatology, Hua Shan Hospital,Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【 Abstract】 Objective To investigate the effects of UVA on proliferation and melanogenesis of normal human melanocytes.Methods Normal human melanocytes were cultured from foreskins of healthy men. MTT spectrophotometry and NaOH assay were applied to determine the proliferation of melanocytes and the synthesis of melanin.Results ＆ Conclusion It was found that UVA could induce the proliferation and melanogenesis of melanocytes in a dose-dependent manner. However, the effect of UVA radiation on the induction of melanocyte proliferation was limited.
, 百拇医药
【 Key Words】 Ultraviolet rays Melanocyte Cells, cultured
紫外线照射可引起皮肤的色素改变。为了进一步探讨长波紫外线(UVA)对黑素细胞的作用机理，我们研究了UVA照射对体外培养的黑素细胞增殖和黑素合成的影响，现报道如下。
材料和方法
一、材料
1.正常人黑素细胞的培养：取包皮环切术标本，去除皮下组织后分割成1cm×2cm的小片，0.25%胰蛋白酶4℃消化过夜。将消化后的表皮接种于MCDB153培养液中，其成分为10%小牛血清,霍乱毒素0.2μg/mL、IBMX10-4mol/L、氢化可的松0.5μg/mL、胰岛素5μg/mL、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、二性霉素0.5μg/mL、12-0-十四烷酰法佛醋酸酯-13(TPA)8nmol/L。吹打成单细胞悬液，离心后计数。按4～6×106/mL的密度接种于直径为35mm培养皿中，2～3周后传代，接种于96孔板上继续培养以备用。
, 百拇医药
2.光源：长波紫外线治疗仪(上海Sigma公司)，波长320～400nm，波峰345nm,功率2mW/cm2。
3.其他：911型酶标仪(上海第三分析仪器厂)，96孔培养板、培养皿(美国,Corning),四甲基偶氮唑蓝MTT(上海华美生物工程公司)，胰蛋白酶(Difco,进口分装)，MCDB153培养液(美国,Gibco)，霍乱毒素和法佛酯等添加成分(美国，Sigma)。
二、方法
1.多巴染色：将传代细胞接种于盖玻片上，贴壁后，予10%甲醛固定1h，入0.1%3,4-二羟基苯丙氨酸孵育溶液，37℃孵育45min，再入新鲜的孵育溶液，37℃孵育2～3h冲洗、染色并脱水。可在光镜下见棕黑色，证实为黑素细胞。
2.黑素细胞增殖的测定：将传代细胞的浓度调节至2×104/mL,加入96孔培养板，每孔0.1mL。每列分别用UVA照射10、20、30、60、120、180min，共6组并设置培养液及未经长波紫外线照射的细胞作为对照，每组均设8个孔。置37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养56～72h。于结束前4h弃原液，加入MTT(1mg/mL)溶液，每孔100μL，4h后弃上清液，加入0.04NHCl异丙醇100μL/孔，摇床上振荡10～15min，至甲结晶完全溶解，置酶标仪测A值，波长492nm。按下列公式计算促增殖率：促增殖率=(UVA照射A值-未经UVA照射A值-培养液A值)/(未经照射A值-培养液A值).100%。
, http://www.100md.com
3.黑素合成的测定：培养的人黑素细胞每天UVA照射5、15、25和30min，连续照射4d。用NaOH法测定经UVA累积照射20、60、100和120min的黑素细胞合成黑素的量。将经处理的黑素细胞去上清液，D-Hank冲洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化6～8min，计数后离心，重新悬浮于1NNaOH100μL，37℃孵育1h，加入400μL蒸馏水稀释，在405nm测定A值，同时制备合成黑素的标准曲线。促增殖率计算同黑素细胞促增殖率。
4.实验结果应用方差分析进行统计学检验。
结果
1.体外培养的黑素细胞分成6组，每组8孔，分别经UVA照射10、20、30、60、120和180min，相应剂量为1.2、2.4、3.6、7.2、14.4和28.8J/cm2，发现各处理组与未经UVA照射的对照组相比，其增殖率分别为7.2%、15.9%、28.6%、23.0%、24.7%和27.3%。经方差分析，F=3.8，P<0.01,各组均数间的差异有非常显著性。各组两两间比较，结果示黑素细胞经UVA照射10min和20min时，黑素细胞数量与对照组相比差异无显著性；照射30min组、60min组、120min组和180min组分别与对照组相比，差异有显著性。
, 百拇医药
2.将体外培养人黑素细胞分成4组，每组5孔，经UVA每天照射5、15、25和30min，连续照射4d，即累积剂量为2.4、7.2、12.0和14.4J/cm2，黑素细胞黑素含量分别为76.84、84.21、94.74和115.79fg/细胞。与对照组(76.84fg/细胞)相比，照射剂量为2.4J/cm2时，黑素细胞合成黑素的量无增加，随照射剂量加大，黑素细胞合成黑素的功能明显活跃，黑素含量逐步增加，当照射剂量为7.2、12.0和14.4J/cm2时，黑素含量增加率为9.60%、23.30%和50.69%。经方差分析，F=8.33，P<0.05,各组均数间的差异有显著性。
讨论
我们用MTT比色法[1]检测了照射不同剂量UVA对黑素细胞增殖的作用。结果显示，UVA照射30min内，即照射剂量在3.6J/cm2时，促黑素细胞增殖率逐步上升。以后，随着时间的进一步延长，促增殖率变化不大，其相互间差异无显著性，但与未经照射组相比，差异均有显著性。同时用NaOH法[2]测定了黑素细胞合成黑素的量，随照射剂量的增加，黑素细胞合成黑素的能力被进一步激活，黑素含量逐步增加。当照射剂量达到14.4J/cm2时，与对照组相比，差异有显著性。
, 百拇医药
Libow等[3]认为UVA照射是体外培养正常人黑素细胞的促分裂剂，紫外线照射后使黑素细胞数目增加，可能是由于紫外线促进了黑素细胞的有丝分裂。RamirezBosca[4]观察了不同剂量UV对体外培养黑素细胞的影响。当照射剂量达200mJ/cm2时，细胞树突数量增多，酪氨酸酶活性及细胞黑素总量均明显增加；但随照射剂量增大，细胞增殖呈下降趋势，直至停止。
从本实验中，我们可以推得下述结论：①UVA照射可以促使黑素细胞的增殖和诱导黑素合成。②UVA照射的促增殖作用主要在30min以内，即照射剂量在3.6J/cm2以内。当照射剂量从3.6J/cm2增加到21.6J/cm2,促黑素细胞增殖率无明显增加。因而，UVA的促黑素细胞增殖作用是有限的。③UVA照射可诱导黑素细胞合成黑素能力加强，黑素含量与照射时间呈正比。
参考文献
, 百拇医药
1 Denizot F, Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival— Modification to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods, 1986,89:271-277.
2 Hunt G, Todd C, Kyne S, et al. ACTH stimulates melanogenesis in cultured human melanocytes. J Endocrinol, 1994,140:R1-R3.
3 Libow LF,Scheide S,DeLeo VA. Ultraviolet radiation acts as an independent mitogen for normal human melanocytes in culture. Pigment Cell Res,1988,1:397-401.
4 Ramirez-Bosca A, Bernd A, Werner R,et al. Effect of the dose of ultraviolet radiation on the pigment formation by human melanocytes in vitro. Arch Dermatol Res, 1992,284:358-362.
(收稿：1999-07-06), 百拇医药
单位：200040上海医科大学附属华山医院皮肤科
关键词：紫外线黑素细胞细胞；培养的
中华皮肤科杂志/990610
【摘要】目的 了解UVA对黑素细胞增殖及黑素合成的影响。方法采用体外细胞培养技术、MTT法及NaOH法研究不同剂量UVA照射对黑素细胞增殖和黑素合成的作用。结果随着照射时间的增加，黑素细胞的增殖率增加，黑素合成量也增加。结论照射剂量在3.6J/cm2以内时，黑素细胞增殖率逐步上升，以后趋向稳定。在测定的照射剂量内，黑素合成量与照射剂量呈正相关。
Effects of UVA Radiation on Proliferation
, 百拇医药
and Melanogenesis of Normal Human Melanocytes in Vitro
XIANG Leihong, ZHENG Zhizhong, ZHU Luchuan, et al.
Department of Dermatology, Hua Shan Hospital,Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【 Abstract】 Objective To investigate the effects of UVA on proliferation and melanogenesis of normal human melanocytes.Methods Normal human melanocytes were cultured from foreskins of healthy men. MTT spectrophotometry and NaOH assay were applied to determine the proliferation of melanocytes and the synthesis of melanin.Results ＆ Conclusion It was found that UVA could induce the proliferation and melanogenesis of melanocytes in a dose-dependent manner. However, the effect of UVA radiation on the induction of melanocyte proliferation was limited.
, 百拇医药
【 Key Words】 Ultraviolet rays Melanocyte Cells, cultured
紫外线照射可引起皮肤的色素改变。为了进一步探讨长波紫外线(UVA)对黑素细胞的作用机理，我们研究了UVA照射对体外培养的黑素细胞增殖和黑素合成的影响，现报道如下。
材料和方法
一、材料
1.正常人黑素细胞的培养：取包皮环切术标本，去除皮下组织后分割成1cm×2cm的小片，0.25%胰蛋白酶4℃消化过夜。将消化后的表皮接种于MCDB153培养液中，其成分为10%小牛血清,霍乱毒素0.2μg/mL、IBMX10-4mol/L、氢化可的松0.5μg/mL、胰岛素5μg/mL、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、二性霉素0.5μg/mL、12-0-十四烷酰法佛醋酸酯-13(TPA)8nmol/L。吹打成单细胞悬液，离心后计数。按4～6×106/mL的密度接种于直径为35mm培养皿中，2～3周后传代，接种于96孔板上继续培养以备用。
, 百拇医药
2.光源：长波紫外线治疗仪(上海Sigma公司)，波长320～400nm，波峰345nm,功率2mW/cm2。
3.其他：911型酶标仪(上海第三分析仪器厂)，96孔培养板、培养皿(美国,Corning),四甲基偶氮唑蓝MTT(上海华美生物工程公司)，胰蛋白酶(Difco,进口分装)，MCDB153培养液(美国,Gibco)，霍乱毒素和法佛酯等添加成分(美国，Sigma)。
二、方法
1.多巴染色：将传代细胞接种于盖玻片上，贴壁后，予10%甲醛固定1h，入0.1%3,4-二羟基苯丙氨酸孵育溶液，37℃孵育45min，再入新鲜的孵育溶液，37℃孵育2～3h冲洗、染色并脱水。可在光镜下见棕黑色，证实为黑素细胞。
2.黑素细胞增殖的测定：将传代细胞的浓度调节至2×104/mL,加入96孔培养板，每孔0.1mL。每列分别用UVA照射10、20、30、60、120、180min，共6组并设置培养液及未经长波紫外线照射的细胞作为对照，每组均设8个孔。置37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养56～72h。于结束前4h弃原液，加入MTT(1mg/mL)溶液，每孔100μL，4h后弃上清液，加入0.04NHCl异丙醇100μL/孔，摇床上振荡10～15min，至甲结晶完全溶解，置酶标仪测A值，波长492nm。按下列公式计算促增殖率：促增殖率=(UVA照射A值-未经UVA照射A值-培养液A值)/(未经照射A值-培养液A值).100%。
, http://www.100md.com
3.黑素合成的测定：培养的人黑素细胞每天UVA照射5、15、25和30min，连续照射4d。用NaOH法测定经UVA累积照射20、60、100和120min的黑素细胞合成黑素的量。将经处理的黑素细胞去上清液，D-Hank冲洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化6～8min，计数后离心，重新悬浮于1NNaOH100μL，37℃孵育1h，加入400μL蒸馏水稀释，在405nm测定A值，同时制备合成黑素的标准曲线。促增殖率计算同黑素细胞促增殖率。
4.实验结果应用方差分析进行统计学检验。
结果
1.体外培养的黑素细胞分成6组，每组8孔，分别经UVA照射10、20、30、60、120和180min，相应剂量为1.2、2.4、3.6、7.2、14.4和28.8J/cm2，发现各处理组与未经UVA照射的对照组相比，其增殖率分别为7.2%、15.9%、28.6%、23.0%、24.7%和27.3%。经方差分析，F=3.8，P<0.01,各组均数间的差异有非常显著性。各组两两间比较，结果示黑素细胞经UVA照射10min和20min时，黑素细胞数量与对照组相比差异无显著性；照射30min组、60min组、120min组和180min组分别与对照组相比，差异有显著性。
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2.将体外培养人黑素细胞分成4组，每组5孔，经UVA每天照射5、15、25和30min，连续照射4d，即累积剂量为2.4、7.2、12.0和14.4J/cm2，黑素细胞黑素含量分别为76.84、84.21、94.74和115.79fg/细胞。与对照组(76.84fg/细胞)相比，照射剂量为2.4J/cm2时，黑素细胞合成黑素的量无增加，随照射剂量加大，黑素细胞合成黑素的功能明显活跃，黑素含量逐步增加，当照射剂量为7.2、12.0和14.4J/cm2时，黑素含量增加率为9.60%、23.30%和50.69%。经方差分析，F=8.33，P<0.05,各组均数间的差异有显著性。
讨论
我们用MTT比色法[1]检测了照射不同剂量UVA对黑素细胞增殖的作用。结果显示，UVA照射30min内，即照射剂量在3.6J/cm2时，促黑素细胞增殖率逐步上升。以后，随着时间的进一步延长，促增殖率变化不大，其相互间差异无显著性，但与未经照射组相比，差异均有显著性。同时用NaOH法[2]测定了黑素细胞合成黑素的量，随照射剂量的增加，黑素细胞合成黑素的能力被进一步激活，黑素含量逐步增加。当照射剂量达到14.4J/cm2时，与对照组相比，差异有显著性。
, 百拇医药
Libow等[3]认为UVA照射是体外培养正常人黑素细胞的促分裂剂，紫外线照射后使黑素细胞数目增加，可能是由于紫外线促进了黑素细胞的有丝分裂。RamirezBosca[4]观察了不同剂量UV对体外培养黑素细胞的影响。当照射剂量达200mJ/cm2时，细胞树突数量增多，酪氨酸酶活性及细胞黑素总量均明显增加；但随照射剂量增大，细胞增殖呈下降趋势，直至停止。
从本实验中，我们可以推得下述结论：①UVA照射可以促使黑素细胞的增殖和诱导黑素合成。②UVA照射的促增殖作用主要在30min以内，即照射剂量在3.6J/cm2以内。当照射剂量从3.6J/cm2增加到21.6J/cm2,促黑素细胞增殖率无明显增加。因而，UVA的促黑素细胞增殖作用是有限的。③UVA照射可诱导黑素细胞合成黑素能力加强，黑素含量与照射时间呈正比。
参考文献
, 百拇医药
1 Denizot F, Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival— Modification to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods, 1986,89:271-277.
2 Hunt G, Todd C, Kyne S, et al. ACTH stimulates melanogenesis in cultured human melanocytes. J Endocrinol, 1994,140:R1-R3.
3 Libow LF,Scheide S,DeLeo VA. Ultraviolet radiation acts as an independent mitogen for normal human melanocytes in culture. Pigment Cell Res,1988,1:397-401.
4 Ramirez-Bosca A, Bernd A, Werner R,et al. Effect of the dose of ultraviolet radiation on the pigment formation by human melanocytes in vitro. Arch Dermatol Res, 1992,284:358-362.
(收稿：1999-07-06), 百拇医药