DNA传感器与DNA芯片
作者：刘仲明
单位：广州军区广州总医院(510010)
关键词：
广东医学991102 分子生物学技术的迅速发展给临床医学诊断以巨大的影响，与疾病相关的DNA片段的检测，即“基因诊断”，成为一种新兴的临床诊断方法，加之本世纪人类基因组计划的完成使基因诊断技术不断提高，日臻完善。目前，基因诊断均采用PCR技术，它以其简便、快速、灵敏的优势，成为临床诊断学的技术热点。但是PCR技术存在着急需解决的二大问题：一是不能定量，二是污染所致的假阳性问题。
近年来，生物传感器飞速发展，出现了DNA传感器，DNA传感器的出现使对目的DNA的测量时间大大缩短，操作简单，无污染，既可定性，又可定量，且灵敏度高、选择性好，显示出诱人的发展前景。另外，长期以来，人们只能一次有限的研究一个或几个基因，随着人类基因计划的提出，需要新的手段能一次检测大于100 000基因片段，而要处理如此大的数据，目前常用的凝胶电泳测序分析是达不到的，基因芯片技术就这样应运而生。现就DNA生物传感技术与DNA芯片技术作一扼要介绍，并就其发展趋势作初步探讨与评述。
, http://www.100md.com
1 具有动态监测功能的DNA传感器
生物传感器是一类特殊的电子器件，它能把各种非电量生物信号转换为易观测电信号或光信号。以生物传感器为核心的传感技术是获得与量化各种生物信号的重要手段，是生命科学、信息科学的支柱之一。DNA作为生命科学研究领域中最重要的内容之一，其传感器的研究更是倍受青睐。
目前在DNA传感器的研究中，其分子识别均采用分子杂交方法，即DNA碱基配对和系列互补原理，因此较好地解决了特异性问题，但在传感器的响应时间和灵敏度方面却不尽人意。在已报道的DNA传感器中，响应时间大部分在几十分钟到一小时以上，它使传感器动态监测的功能大打折扣。提高DNA传感器的灵敏度，缩短响应时间，成为DNA传感器研究中待解决的难题。为此人们采用了3种方法：①采用PCR技术，应用DNA传感器检测PCR扩增产物[1]。②设计杂交加速剂提高杂交反应速度[2]。③设计小分子杂交指示剂产生嵌入作用，提高灵敏度[3]。上述3个技术手段，虽在一定的程度上取得进展，但仍不尽人意。因此，人们在传感技术本身上挖潜力，采用新原理、新技术、新方法来提高灵敏度，缩短响应时间。值得提及的有以下3种技术，即表面等离子体谐振(SPR)传感技术、功函数型场效应管传感技术和光寻址传感技术。
, 百拇医药
表面等离子体谐振(SPR)技术[4，5]，是在几十纳米厚金属薄膜表面上固定一条含有十几到上千个核苷酸单链DNA，在一定入射角的单色光波激励下，在金属薄膜的表面上产生一种横向电磁波，其强度与金属表面上覆盖的生物敏感膜折射率等光学参数有关，生物敏感膜与待测样品相互作用时发生的细微变化可以通过SPR特性参数的变化来检测。SPR技术是近几年国际上研究的热点，已有产品进入市场，该传感器灵敏度为10 fmol/mm2 ，响应时间<5 min。SPR技术提示我们，通过探测分子之间的相互作用，即探测分子杂交反应初速度的方法，可实现DNA片段的快速检测。
功函数型场效应管DNA传感器，是在场效应管的栅区固定一条含有十几到上千个核苷酸单链DNA片段，当待测物分子与敏感栅作用时，发生电荷转移，导致功函数变化，使阈电压偏移，其改变量△VT，可用ID保持恒定时的漏电压表示出来。同样，功函数型传感器也是探测分子之间的作用，其灵敏度可达ppb级，响应时间小于10 s。由于该传感器可集成化、阵列化，便于多道测量；同时，可微型化，易于实现在体检测。
, 百拇医药
1990年首次出现的光寻址DNA传感器，系电解质/绝缘层/半导体si衬底三层结构，当在电解质溶液与半导体衬底之间施加直流偏置电压，用调制光束(f=10 kHz调制的红外光)照射时，外部光电流与偏压及照射部位对应的光电流有关。光寻址DNA传感技术不仅具有集成化、阵列化、可连续动态监测的特点，而且灵敏度高，其灵敏度为10-13 mol。特别值得提及的是，它采用光寻址代替导线接触。
综观DNA传感器的发展，从探测DNA分子杂交的结果向探测DNA分子之间的相互作用、探测杂交反应初速度的方向发展，从研制单一的DNA传感器向研制DNA传感器阵列，实现多基因同步检测方向发展，同时采用光寻址代替导线接触，使DNA传感器出现了多姿多态。但是，目前DNA传感器的研究尚处于初级阶段，就整体实力与现行生化分析方法还有一定的差距，还得深入研究，方能在基因快速诊断方面占有一席之地。
2 具有高密度特性的DNA芯片
, 百拇医药
人类基因计划的提出促进了许多新的分子生物学技术的产生和发展，DNA芯片技术就是在这时融生命科学、现代物理、现代化学、微电子学和计算机科学于一体而产生发展起来的。DNA芯片被认为是90年代以来在高新科技领域内出现的极具时代特征的重大进展，既具有重大的基础研究价值，又具有明显的高新技术产业化的前景，受到科学界、产业界和政府部门的高度重视。
DNA芯片实质上是一种寡核苷酸阵列，它采用光电化学技术在1 cm2左右的基片上原位合成寡核苷酸序列探针[6]，将大量具有生物意义的特定序列DNA探针有序固定在基片上，从而构成储存有大量生命信息的DNA芯片，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。由此可见，DNA芯片技术的分子识别和DNA传感技术同出一理，即DNA的碱基配对和序列互补原理。同时DNA芯片具有高密度特性，其DNA探针密度可达106探针/cm2，实现了上万个基因同步检测。
, 百拇医药
DNA芯片方法学基础有以下二个关键技术：①光化学引导下的原位DNA合成技术。它是在1 cm2左右的基片上，原位合成DNA探针序列。合成时将传统的以亚磷酰胺为基础的DNA合成技术，加以修饰，亚磷酰胺5′末端改为光不稳定的保护基团，在透光位点紫外光照射下，发生光化学作用可以除去保护基团，通过合成连接子贴附于基片上，再用A，T，C，G 4种核苷液冲洗芯片，发生化学偶合，光线照在基片上的不同区时，加上不同的核苷，重复这一过程，由4个核苷可组成任一探针。②激光聚焦扫描技术。靶DNA标记荧光物质后，杂交到芯片上，并应用激光聚焦扫描原理进行荧光信号采集，这时与靶序列碱基配对良好探针产生强烈的杂交信号，碱基错配则信号强度减弱。CCD摄下平面光学图像，并使转换为电子图像信号，由计算机处理分析。
DNA芯片的出现，不仅使分析整个人类基因表达成为可能，而且对人类健康的核心课题，包括疾病的诊断治疗、新药的开发、抗衰老研究、毒理学研究及心理疾病的治疗带来无法预知的广阔空间，并且在感染疾病的诊断及机理研究，爱滋病研究中感染与非感染细胞识别，癌基因突变及肿瘤基因超表达等许多领域，正成为研究功能基因组的中心平台,应用前景非常可观。但是，我们也要看到DNA芯片技术仅有几年的历史，还有待人们通过科学实践去验证、完善和提高。
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3 结语和展望
DNA传感器和DNA芯片都是集生物分子学技术、现代物理、现代化学、微电子技术于一体而发展起来，该两项技术相互渗透、并行发展，将会使疾病的诊断治疗产生重大突破。由于DNA传感技术和DNA芯片技术的兴起在国外也仅仅是近几年的事，而在国内则是刚刚起步，因此，在国内开展DNA传感器和DNA芯片的研究，对提高我国基因诊断水平是至关重要的。
DNA传感器和DNA芯片对DNA分子识别均是基于碱基配对序列互补原理。而DNA传感器具有动态监测功能，其研究目标是超微型、微系统、多参数，而以床边监测、在体监测、无损监测、细胞内监测为目的而发展。DNA芯片则具有高密度特性，它同时对上万个基因进行同步检测，它的研究目标是实现一个芯片对某一患者全部基因组的变化进行整体的、快速的诊断，并使之成为常规技术。基于国内外DNA传感器和DNA芯片的发展现状，笔者认为我国DNA传感器的研究工作，应仍以提高检测灵敏度，缩短响应时间为重点，加强DNA传感器的可靠性、稳定性和实用性研究；而对DNA芯片的研究，应加强商品化的意识，不宜过分追求高密度，重点应该是研制用于与疾病相关基因片段检测的专用DNA诊断芯片，能取代进口并能出口创汇。
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基于我国MOS传感器的研究起步较早[7]，研究的广度和深度与国外的差距较小，从近几年来Biosensor国际会议我国被录取的论文来看，采用MOS原理生物敏微电极的论文篇数不少，其水平已达到乃至超过国际先进水平。最近，有人提出研究、设计一个基于微电子学原理的DNA芯片，该芯片既具有DNA传感器的动态监测特性，又具有DNA芯片的多基因同步检测的功能。笔者认为，这种新型的DNA芯片设计思想新颖，也是可行的，它的研制成功将对提高我国基因诊断水平具有意义。
作者简介：刘仲明，1963年毕业于武汉大学化学系。现任广州军区广州总医院医学实验科高级工程师、专家组成员、硕士生导师，系中国电子学会敏感技术学会委员，全国气敏传感技术专业委员会委员。1978年出席了全国科学大会，1993年起享受政府特殊津贴。曾获全国科学大会奖两项，国家发明三等奖一项，军队科技进步二等奖三项，发表学术论文20余篇。主要研究方向是生物医学传感器。
参考文献
, 百拇医药
1 Tsuruta H， Matsui S， Hatanaka T, et al. Detection of the products of polymerase chain reaction by an ELISA system based on an ion sensitive field effect transistor.J Immunol Methods,1994,176(1):45
2 Wood SJ. DNA-DNA hybridization in real time using BIAcore.Microchem J,1993,47:330
3 庞代文,齐义鹏,王宗礼,等.DNA的电化学研究.化学通报，1994,2:1
4 Pollard KD, Hawkins E,Yeung D， et al.Immunoassays and nucleic acid detection with a biosensor based on surface plasmon resonance.Ann Biol Clin Paris,1990,48(9):642
5 赵 杰,景 田,韩泾鸿,等.SPR生物化学量检测系统.仪器仪表与传感器,1996,3:37
6 Fodor SPA. DNA sequencing massively parallel genomics. Science, 1997,277:393
7 刘仲明,谭有金.离子敏感场效应管传感器.防化学院学报,1985,4:66, http://www.100md.com
单位：广州军区广州总医院(510010)
关键词：
广东医学991102 分子生物学技术的迅速发展给临床医学诊断以巨大的影响，与疾病相关的DNA片段的检测，即“基因诊断”，成为一种新兴的临床诊断方法，加之本世纪人类基因组计划的完成使基因诊断技术不断提高，日臻完善。目前，基因诊断均采用PCR技术，它以其简便、快速、灵敏的优势，成为临床诊断学的技术热点。但是PCR技术存在着急需解决的二大问题：一是不能定量，二是污染所致的假阳性问题。
近年来，生物传感器飞速发展，出现了DNA传感器，DNA传感器的出现使对目的DNA的测量时间大大缩短，操作简单，无污染，既可定性，又可定量，且灵敏度高、选择性好，显示出诱人的发展前景。另外，长期以来，人们只能一次有限的研究一个或几个基因，随着人类基因计划的提出，需要新的手段能一次检测大于100 000基因片段，而要处理如此大的数据，目前常用的凝胶电泳测序分析是达不到的，基因芯片技术就这样应运而生。现就DNA生物传感技术与DNA芯片技术作一扼要介绍，并就其发展趋势作初步探讨与评述。
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1 具有动态监测功能的DNA传感器
生物传感器是一类特殊的电子器件，它能把各种非电量生物信号转换为易观测电信号或光信号。以生物传感器为核心的传感技术是获得与量化各种生物信号的重要手段，是生命科学、信息科学的支柱之一。DNA作为生命科学研究领域中最重要的内容之一，其传感器的研究更是倍受青睐。
目前在DNA传感器的研究中，其分子识别均采用分子杂交方法，即DNA碱基配对和系列互补原理，因此较好地解决了特异性问题，但在传感器的响应时间和灵敏度方面却不尽人意。在已报道的DNA传感器中，响应时间大部分在几十分钟到一小时以上，它使传感器动态监测的功能大打折扣。提高DNA传感器的灵敏度，缩短响应时间，成为DNA传感器研究中待解决的难题。为此人们采用了3种方法：①采用PCR技术，应用DNA传感器检测PCR扩增产物[1]。②设计杂交加速剂提高杂交反应速度[2]。③设计小分子杂交指示剂产生嵌入作用，提高灵敏度[3]。上述3个技术手段，虽在一定的程度上取得进展，但仍不尽人意。因此，人们在传感技术本身上挖潜力，采用新原理、新技术、新方法来提高灵敏度，缩短响应时间。值得提及的有以下3种技术，即表面等离子体谐振(SPR)传感技术、功函数型场效应管传感技术和光寻址传感技术。
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表面等离子体谐振(SPR)技术[4，5]，是在几十纳米厚金属薄膜表面上固定一条含有十几到上千个核苷酸单链DNA，在一定入射角的单色光波激励下，在金属薄膜的表面上产生一种横向电磁波，其强度与金属表面上覆盖的生物敏感膜折射率等光学参数有关，生物敏感膜与待测样品相互作用时发生的细微变化可以通过SPR特性参数的变化来检测。SPR技术是近几年国际上研究的热点，已有产品进入市场，该传感器灵敏度为10 fmol/mm2 ，响应时间<5 min。SPR技术提示我们，通过探测分子之间的相互作用，即探测分子杂交反应初速度的方法，可实现DNA片段的快速检测。
功函数型场效应管DNA传感器，是在场效应管的栅区固定一条含有十几到上千个核苷酸单链DNA片段，当待测物分子与敏感栅作用时，发生电荷转移，导致功函数变化，使阈电压偏移，其改变量△VT，可用ID保持恒定时的漏电压表示出来。同样，功函数型传感器也是探测分子之间的作用，其灵敏度可达ppb级，响应时间小于10 s。由于该传感器可集成化、阵列化，便于多道测量；同时，可微型化，易于实现在体检测。
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1990年首次出现的光寻址DNA传感器，系电解质/绝缘层/半导体si衬底三层结构，当在电解质溶液与半导体衬底之间施加直流偏置电压，用调制光束(f=10 kHz调制的红外光)照射时，外部光电流与偏压及照射部位对应的光电流有关。光寻址DNA传感技术不仅具有集成化、阵列化、可连续动态监测的特点，而且灵敏度高，其灵敏度为10-13 mol。特别值得提及的是，它采用光寻址代替导线接触。
综观DNA传感器的发展，从探测DNA分子杂交的结果向探测DNA分子之间的相互作用、探测杂交反应初速度的方向发展，从研制单一的DNA传感器向研制DNA传感器阵列，实现多基因同步检测方向发展，同时采用光寻址代替导线接触，使DNA传感器出现了多姿多态。但是，目前DNA传感器的研究尚处于初级阶段，就整体实力与现行生化分析方法还有一定的差距，还得深入研究，方能在基因快速诊断方面占有一席之地。
2 具有高密度特性的DNA芯片
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人类基因计划的提出促进了许多新的分子生物学技术的产生和发展，DNA芯片技术就是在这时融生命科学、现代物理、现代化学、微电子学和计算机科学于一体而产生发展起来的。DNA芯片被认为是90年代以来在高新科技领域内出现的极具时代特征的重大进展，既具有重大的基础研究价值，又具有明显的高新技术产业化的前景，受到科学界、产业界和政府部门的高度重视。
DNA芯片实质上是一种寡核苷酸阵列，它采用光电化学技术在1 cm2左右的基片上原位合成寡核苷酸序列探针[6]，将大量具有生物意义的特定序列DNA探针有序固定在基片上，从而构成储存有大量生命信息的DNA芯片，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。由此可见，DNA芯片技术的分子识别和DNA传感技术同出一理，即DNA的碱基配对和序列互补原理。同时DNA芯片具有高密度特性，其DNA探针密度可达106探针/cm2，实现了上万个基因同步检测。
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DNA芯片方法学基础有以下二个关键技术：①光化学引导下的原位DNA合成技术。它是在1 cm2左右的基片上，原位合成DNA探针序列。合成时将传统的以亚磷酰胺为基础的DNA合成技术，加以修饰，亚磷酰胺5′末端改为光不稳定的保护基团，在透光位点紫外光照射下，发生光化学作用可以除去保护基团，通过合成连接子贴附于基片上，再用A，T，C，G 4种核苷液冲洗芯片，发生化学偶合，光线照在基片上的不同区时，加上不同的核苷，重复这一过程，由4个核苷可组成任一探针。②激光聚焦扫描技术。靶DNA标记荧光物质后，杂交到芯片上，并应用激光聚焦扫描原理进行荧光信号采集，这时与靶序列碱基配对良好探针产生强烈的杂交信号，碱基错配则信号强度减弱。CCD摄下平面光学图像，并使转换为电子图像信号，由计算机处理分析。
DNA芯片的出现，不仅使分析整个人类基因表达成为可能，而且对人类健康的核心课题，包括疾病的诊断治疗、新药的开发、抗衰老研究、毒理学研究及心理疾病的治疗带来无法预知的广阔空间，并且在感染疾病的诊断及机理研究，爱滋病研究中感染与非感染细胞识别，癌基因突变及肿瘤基因超表达等许多领域，正成为研究功能基因组的中心平台,应用前景非常可观。但是，我们也要看到DNA芯片技术仅有几年的历史，还有待人们通过科学实践去验证、完善和提高。
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3 结语和展望
DNA传感器和DNA芯片都是集生物分子学技术、现代物理、现代化学、微电子技术于一体而发展起来，该两项技术相互渗透、并行发展，将会使疾病的诊断治疗产生重大突破。由于DNA传感技术和DNA芯片技术的兴起在国外也仅仅是近几年的事，而在国内则是刚刚起步，因此，在国内开展DNA传感器和DNA芯片的研究，对提高我国基因诊断水平是至关重要的。
DNA传感器和DNA芯片对DNA分子识别均是基于碱基配对序列互补原理。而DNA传感器具有动态监测功能，其研究目标是超微型、微系统、多参数，而以床边监测、在体监测、无损监测、细胞内监测为目的而发展。DNA芯片则具有高密度特性，它同时对上万个基因进行同步检测，它的研究目标是实现一个芯片对某一患者全部基因组的变化进行整体的、快速的诊断，并使之成为常规技术。基于国内外DNA传感器和DNA芯片的发展现状，笔者认为我国DNA传感器的研究工作，应仍以提高检测灵敏度，缩短响应时间为重点，加强DNA传感器的可靠性、稳定性和实用性研究；而对DNA芯片的研究，应加强商品化的意识，不宜过分追求高密度，重点应该是研制用于与疾病相关基因片段检测的专用DNA诊断芯片，能取代进口并能出口创汇。
, 百拇医药
基于我国MOS传感器的研究起步较早[7]，研究的广度和深度与国外的差距较小，从近几年来Biosensor国际会议我国被录取的论文来看，采用MOS原理生物敏微电极的论文篇数不少，其水平已达到乃至超过国际先进水平。最近，有人提出研究、设计一个基于微电子学原理的DNA芯片，该芯片既具有DNA传感器的动态监测特性，又具有DNA芯片的多基因同步检测的功能。笔者认为，这种新型的DNA芯片设计思想新颖，也是可行的，它的研制成功将对提高我国基因诊断水平具有意义。
作者简介：刘仲明，1963年毕业于武汉大学化学系。现任广州军区广州总医院医学实验科高级工程师、专家组成员、硕士生导师，系中国电子学会敏感技术学会委员，全国气敏传感技术专业委员会委员。1978年出席了全国科学大会，1993年起享受政府特殊津贴。曾获全国科学大会奖两项，国家发明三等奖一项，军队科技进步二等奖三项，发表学术论文20余篇。主要研究方向是生物医学传感器。
参考文献
, 百拇医药
1 Tsuruta H， Matsui S， Hatanaka T, et al. Detection of the products of polymerase chain reaction by an ELISA system based on an ion sensitive field effect transistor.J Immunol Methods,1994,176(1):45
2 Wood SJ. DNA-DNA hybridization in real time using BIAcore.Microchem J,1993,47:330
3 庞代文,齐义鹏,王宗礼,等.DNA的电化学研究.化学通报，1994,2:1
4 Pollard KD, Hawkins E,Yeung D， et al.Immunoassays and nucleic acid detection with a biosensor based on surface plasmon resonance.Ann Biol Clin Paris,1990,48(9):642
5 赵 杰,景 田,韩泾鸿,等.SPR生物化学量检测系统.仪器仪表与传感器,1996,3:37
6 Fodor SPA. DNA sequencing massively parallel genomics. Science, 1997,277:393
7 刘仲明,谭有金.离子敏感场效应管传感器.防化学院学报,1985,4:66, http://www.100md.com