中国葛属植物花粉形态的研究
作者：曾 明 张汉明 郑水庆 许景峰△ 宋赵军 叶熙亭▲ 苏中武
单位：
关键词：葛属；花粉形态
乙型肝炎是严重危害人民健康的传染病 乙型肝炎是严重危害人民健康的传染病。据统计，全球HBsAg阳性人数达3亿。现有抗乙型肝炎病毒(HBV)的药物中，α-干扰素已普遍被接受，有不少报道于短程糖皮质激素治疗撤药后，再用α-干扰素，能提高后者的抗病毒效果。为了解糖皮质激素对HBV复制与表达的影响，我们研究了糖皮质激素对HBV复制与表达的调控作用。
1 材料和方法
1.1 细胞培养及糖皮质激素处理 人肝癌细胞系HepG2 2215由美国西奈山医学院Gorge Acs博士转赠，可整合HBV全基因。将该细胞系用含10%胎牛血清(英国Globe Pharm公司)的MEM(Gibico公司)培养基(含青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml及0.03%谷氨酰胺)于37℃、5% CO2的温箱中培养，另加G418(Sigma公司)400 μg/ml。取对数生长期HepG2 2215细胞，以1×105个/ml浓度接种于Nunc24孔板中，每孔1 ml，加入用PBS配制的不同浓度(40，4，0.4 mg/L)的地塞米松(上海第九制药厂产品)100 μl与细胞共孵育72 h。另设正常对照组(只加PBS 100 μl)。各组均设3个复孔。每24 h按原地塞米松终浓度加入100 μl。72 h后收集上清待测。
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1.2 HBV-DNA含量测定 上述各组于收集上清后，剩余的细胞每孔加入0.25%胰酶500 μl消化10 min，1×103 r/min离心5 min后，细胞用PBS洗涤1次。DNA抽提方法参照文献[1]。细胞总DNA用TE 40 μl溶解，然后用32P标记的HBV(3.2 kb片段)探针行斑点杂交。
1.3 HepG2细胞活性测定 采用3H-TdR掺入法测定HepG2 细胞活性。各组细胞按2×104个/孔接种于96孔板中，用上述不同浓度地塞米松处理48 h。加入3H-TdR 10 μl/孔(18.5 kBq)，72 h后收集细胞，以0.2%胰酶-0.2%EDTA消化后，用多头细胞收集仪将细胞收集于49号玻璃纤维滤纸上，50℃烘1 h，每一圆孔滤纸片分别加入闪烁液(DPO 1.5 g；POPOP 0.2 g；甲苯500 ml)中，用Beckman 5000液闪仪测定放射性活度。
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1.4 HBsAg和HBeAg表达的检测 采用华美公司ELISA试剂盒测定HBsAg和HBeAg，操作按说明书进行。
2 结 果
2.1 对HepG2 2215细胞HBsAg及HBeAg表达的影响 与对照组相比，地塞米松40 mg/L组HBsAg和HBeAg的表达分别上调32%和40%；4 mg/L组分别上调12%和18%；0.4 mg/L组则无明显改变。
2.2 对HepG2 2215细胞HBV-DNA含量的影响 3个地塞米松组中以40 mg/L组的HepG2细胞HBV-DNA含量增多较为明显(图1)。
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图 1 地塞米松(40 mg/L)对HBV-DNA含量的上调作用
2.3 对HepG2 2215细胞活性的影响 3个地塞米松组及正常对照组3H-TdR掺入的放射性活度均在861～1 056 Bq间，每组3复孔的均值基本相等，说明不同浓度地塞米松对HepG2 2215细胞的活性均无明显影响。
3 讨 论
本研究结果表明，地塞米松对HepG2 (2215)细胞HBV的表达与复制均有一定上调作用。其作用机制可能与HBV基因组中糖皮质激素反应元件(GRE)有关。GRE定位于HBV基因组351～368位核苷酸，位于HBV基因组P区和S区的重叠区，可与激素受体结合，增强基因的转录水平。利用转基因小鼠的研究发现，S区基因的表达受性激素和糖皮质激素的调控。本研究发现，大剂量糖皮质激素对HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制均有一定上调作用，这符合临床上单用糖皮质激素治疗慢性乙肝不但无益而且有害的观点[2]。有报道T淋巴细胞对HBV的免疫应答只有在病毒抗原和主要组织相容抗原(MHC)在靶细胞共同表达才能产生，干扰素增加MHCⅠ类、Ⅱ类抗原的表达[3]。推测糖皮质激素使HBV抗原和MHC在肝细胞共同表达，造成T细胞对HBV的免疫应答，使体内病毒清除增加，增强了抗病毒作用的效果。
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中国图书资料分类法分类号 R512.62
参 考 文 献
1 李尹雄. 核酸的分离与纯化. 见：卢圣栋主编. 现代分子生物实验技术. 北京：高等教育出版社, 1993. 95～145
2 Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rev Immunol,1995,13(1):29
3 Peters M, Vierling J, Gershwin ME, et al. Immunology and the liver. Hepatology, 1991,13(5):977
(1998-04-27收稿， 1998-09-12修回)
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关键词：葛属；花粉形态
乙型肝炎是严重危害人民健康的传染病 乙型肝炎是严重危害人民健康的传染病。据统计，全球HBsAg阳性人数达3亿。现有抗乙型肝炎病毒(HBV)的药物中，α-干扰素已普遍被接受，有不少报道于短程糖皮质激素治疗撤药后，再用α-干扰素，能提高后者的抗病毒效果。为了解糖皮质激素对HBV复制与表达的影响，我们研究了糖皮质激素对HBV复制与表达的调控作用。
1 材料和方法
1.1 细胞培养及糖皮质激素处理 人肝癌细胞系HepG2 2215由美国西奈山医学院Gorge Acs博士转赠，可整合HBV全基因。将该细胞系用含10%胎牛血清(英国Globe Pharm公司)的MEM(Gibico公司)培养基(含青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml及0.03%谷氨酰胺)于37℃、5% CO2的温箱中培养，另加G418(Sigma公司)400 μg/ml。取对数生长期HepG2 2215细胞，以1×105个/ml浓度接种于Nunc24孔板中，每孔1 ml，加入用PBS配制的不同浓度(40，4，0.4 mg/L)的地塞米松(上海第九制药厂产品)100 μl与细胞共孵育72 h。另设正常对照组(只加PBS 100 μl)。各组均设3个复孔。每24 h按原地塞米松终浓度加入100 μl。72 h后收集上清待测。
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1.2 HBV-DNA含量测定 上述各组于收集上清后，剩余的细胞每孔加入0.25%胰酶500 μl消化10 min，1×103 r/min离心5 min后，细胞用PBS洗涤1次。DNA抽提方法参照文献[1]。细胞总DNA用TE 40 μl溶解，然后用32P标记的HBV(3.2 kb片段)探针行斑点杂交。
1.3 HepG2细胞活性测定 采用3H-TdR掺入法测定HepG2 细胞活性。各组细胞按2×104个/孔接种于96孔板中，用上述不同浓度地塞米松处理48 h。加入3H-TdR 10 μl/孔(18.5 kBq)，72 h后收集细胞，以0.2%胰酶-0.2%EDTA消化后，用多头细胞收集仪将细胞收集于49号玻璃纤维滤纸上，50℃烘1 h，每一圆孔滤纸片分别加入闪烁液(DPO 1.5 g；POPOP 0.2 g；甲苯500 ml)中，用Beckman 5000液闪仪测定放射性活度。
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1.4 HBsAg和HBeAg表达的检测 采用华美公司ELISA试剂盒测定HBsAg和HBeAg，操作按说明书进行。
2 结 果
2.1 对HepG2 2215细胞HBsAg及HBeAg表达的影响 与对照组相比，地塞米松40 mg/L组HBsAg和HBeAg的表达分别上调32%和40%；4 mg/L组分别上调12%和18%；0.4 mg/L组则无明显改变。
2.2 对HepG2 2215细胞HBV-DNA含量的影响 3个地塞米松组中以40 mg/L组的HepG2细胞HBV-DNA含量增多较为明显(图1)。
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图 1 地塞米松(40 mg/L)对HBV-DNA含量的上调作用
2.3 对HepG2 2215细胞活性的影响 3个地塞米松组及正常对照组3H-TdR掺入的放射性活度均在861～1 056 Bq间，每组3复孔的均值基本相等，说明不同浓度地塞米松对HepG2 2215细胞的活性均无明显影响。
3 讨 论
本研究结果表明，地塞米松对HepG2 (2215)细胞HBV的表达与复制均有一定上调作用。其作用机制可能与HBV基因组中糖皮质激素反应元件(GRE)有关。GRE定位于HBV基因组351～368位核苷酸，位于HBV基因组P区和S区的重叠区，可与激素受体结合，增强基因的转录水平。利用转基因小鼠的研究发现，S区基因的表达受性激素和糖皮质激素的调控。本研究发现，大剂量糖皮质激素对HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制均有一定上调作用，这符合临床上单用糖皮质激素治疗慢性乙肝不但无益而且有害的观点[2]。有报道T淋巴细胞对HBV的免疫应答只有在病毒抗原和主要组织相容抗原(MHC)在靶细胞共同表达才能产生，干扰素增加MHCⅠ类、Ⅱ类抗原的表达[3]。推测糖皮质激素使HBV抗原和MHC在肝细胞共同表达，造成T细胞对HBV的免疫应答，使体内病毒清除增加，增强了抗病毒作用的效果。
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参 考 文 献
1 李尹雄. 核酸的分离与纯化. 见：卢圣栋主编. 现代分子生物实验技术. 北京：高等教育出版社, 1993. 95～145
2 Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rev Immunol,1995,13(1):29
3 Peters M, Vierling J, Gershwin ME, et al. Immunology and the liver. Hepatology, 1991,13(5):977
(1998-04-27收稿， 1998-09-12修回)
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