蟾蜍灵对人胃癌细胞系MGc-803的细胞毒作用
作者：陈小义 徐瑞成 陈莉 钱进
单位：陈小义 徐瑞成 陈莉(中国人民武装警察部队医学院 天津 300162)；钱进(天津药物研究院)
关键词：蟾蜍灵；细胞毒作用；胃癌细胞系
中草药001224 摘 要 蟾蜍灵(bufalin)是我国传统中药蟾酥中蟾毒的主要成分之 一，研究其抑癌作用及机制具有重要意义。采用台盼蓝染色法、噻唑蓝还原法和光镜观察bu falin对人低分化胃腺癌细胞系MGc-803的生长抑制作用。结果显示，0.01 μmol/L及以上 浓度bufalin对MGc-803细胞具有显著的抑制作用，IC50值约为0.1 μmol/L。bufal in抑制MGc-803生长的机制是致使细胞核染色质凝缩、碎裂，DNA损伤，胞浆RNA含量下降， 导致细胞死亡。
Studies on the Cytotoxicity of Bufalin on Human Gastric Cancer Cell MGc-803 in vitro
, 百拇医药
Chen Xiaoyi Xu Ruicheng Chen Li
(Medical College of Chinese People's Armed Police Forces (Tianjin 3001 62)
Qian Jin
(Tianjin Institute of Pharmaceutical Research)
Abstract To study the cytotoxic activity of bufalin, one of the components of bufadienolides in the TCM “Chansu”, and its mechanism of act ion. Human gastric cancer cell line MGc-803 was used as target cells. Inhibition of t umor cell growth was assessed by trypan blue exclusion and thiazole blue absorba nce and light microscope examination. Result showed that bufalin at concentrati o ns of 0.01 μ mol/L and above could remarkably inhibit the growth of MGc-803 t um or cell, with IC50 of about 0.1 μ mol/L. Further study showed that its me chanism of action involved necrotic changes of nuclear chromatin and fragmentati on of chromosomal DNA leading to cell death.
, 百拇医药
Key words bufalin cytotoxicity human gastric MGc-803 cance r cell
蟾酥是具有多种功效的传统中药，近年来蟾酥细胞毒成分的研究日益受到重 视[1]，蟾蜍灵(bufalin)是从蟾酥中提取的蟾毒的主要成分之一，分子式为C 24H34O4，相对分子量为386.5，我们发现bufalin作用于体外培养的胃癌细胞 ，可显著抑制肿瘤细胞生长，报道如下。
1 材料
1.1 药物：bufalin(纯度大于99%)由天津药物研究院从中华大蟾蜍Bufo bufo ga rgarizans Cantor中提取，用无水乙醇配成储备液，过滤除菌，分装保存。实验时 ，用D-hank's稀释到终浓度的10倍，再按1∶10(工作液∶培养基)的比例 加入培养基中，乙醇终浓度小于0.1 %，预实验证实，0.1%的乙醇对细胞几乎没有毒害作用。
, http://www.100md.com
1.2 胃癌细胞系：人低分化胃腺癌细胞系MGc-803引自北京市肿瘤防治研究所，培养于含 10%小牛血清的DMEM(Gibco公司)培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱(美国Napco)，培养基 中 加双抗。细胞接种后于指数生长期进行不同浓度的bufalin处理，相应时间后取材，进行各 种指标的测定。
2 方法和结果
2.1 bufalin对MGc-803细胞的生长抑制作用：台盼蓝染色法进行活细胞计数，细胞接种 于 25 mL培养瓶，分用药组和对照组，每种处理于不同时间每次取3瓶细胞分别计数，取平均值 。活细胞数量变化见表1。其中大多为台盼蓝染色阳性细胞(死细胞)，细胞增殖速度下降，0 .01 μmol/L及以上浓度处理组，细胞在0～48 h之间数目先有小幅增长，之后，细胞数下降 ，直到近乎全部崩解。
表1 bufalin作用MGc-803活细胞数量的变化
, http://www.100md.com
(×105 CFU/mL)
用药时间
(h)
药物浓度(μmol/L)
0.000
0.001
0.010
0.100
1.000
0
0.70
24
, http://www.100md.com
1.02
0.51
0.25
0.19
0.14
48
1.40
1.75
0.82
0.24
0.35
72
2.84
, 百拇医药
1.66
0.38
0.00
0.00
96
4.70
2.60
0.21
2.2 bufalin抑制MGc-803细胞的剂量效应：将MGc-803胃癌细胞于对数生长期用0.125% 胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×103 CFU/mL，接种于96孔培养板， 每孔 加200 μL细胞悬液，培养24 h后，药物处理4组，分别加入不同浓度的bufalin，并设对照 组(不加药)和空白组(只有培养，无细胞)，每组均设8个复孔；继续培养48 h，加入噻唑蓝( MTT) 20 μL(1 mg/mL),37 ℃，孵育4 h，离心，加入DMSO 200 μL,避光振荡5 min，全自 动酶标仪(上海三科仪器公司)测570 nm处吸光度(A值)。抑制率按以下公式计算：
, 百拇医药
抑制率=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100 %
由表2可见，bufalin处 理48 h，0.01 μmol/L及以上浓度对MGc-803细胞具有显著的抑制作用，IC50值在 0.1 μmol/L附近。表2 bufalin作用MGc-803细胞的剂量效应 药物浓度
(μmol/L)
吸光度A值(x±s ，n=8)
抑制率
(%)
实验组
对照组
, http://www.100md.com
空白组
0.001
1.32±0.14
1.43±0.10
0.44±0.06
11.1
0.010
1.23±0.13*
20.2
0.100
0.77±0.70**△
66.7
, 百拇医药
1.000
0.48±0.07**☆
96.0
与对照组比：*P<0.01 **P<0.001； 与0.01 μmol/L组比：△P<0.01； 与0.1 μm ol/L组比：☆P<0.001
2.3 细胞形态学观察
2.3.1 倒置光显微镜原位观察培养细胞的形态学变化：倒置光显微镜下观察培养瓶中细 胞生长的动态，可见对照组细胞多贴壁生长，呈纤维细胞型，加入bufalin，细胞起鼓、变 圆、脱壁，悬浮细胞增多(图1)。
, 百拇医药
图1 bufalin作用MGc-803细胞形态学 改变
(A-对照组；B-用药组)倒置光显微镜
2.3.2 荧光显微镜观察细胞核染色质和胞浆RNA的变化：细胞接种于洁净盖玻片铺底的6 孔培养板，24 h后加药，药物作用24 h，取出盖玻片，改良的吖啶橙染色法按天津医科大学 许 屏教授试剂盒说明书进行。在荧光显微镜下可见，对照组细胞核染色质被染成均匀的黄绿色 ，胞浆RNA被染成深的橙红色，分裂相细胞多，而药物作用组细胞，核染色质凝缩，碎裂成 不均一的小块，于胞内呈微核样，胞浆橙红色变浅，说明RNA含量下降(图2)。
4 讨论
蟾酥是传统中药，具有多方面作用[2]，曾报道蟾酥水溶液总成分注射液治疗晚期 消 化系癌，蟾酥加其他中药制成的扶正2号治疗晚期胃癌，都取得显著疗效[3]；蟾酥 的 成分比较复杂，我们选择蟾毒的主要成分bufalin与胃癌细胞系MGc-803细胞共育时，细胞 数 量明显下降，台盼蓝染色阳性细胞数随药物浓度和作用时间的增加而增多。MTT实验结果表 明，bufalin作用胃癌细胞48 h的IC50值在0.1 μmol/L附近，可见bufalin具有强细 胞毒作用，可能是其抑制肿瘤的机制之一。
, 百拇医药
bufalin对肿瘤细胞的细胞毒作用的机制还不是很清楚，实验研究发现蟾酥脂质体抑制培养 的膀胱癌细胞生长，是因为细胞DNA合成受到抑制[4]；
图2 bufalin对MGc-803细胞DNA损伤和胞浆R NA的变化(A-对照组；B-用药组荧光显微镜，吖啶橙染色) Numazawa等研究发现，bufa lin可以诱导肿瘤细胞分化，从而抑制肿瘤细胞增殖[5]；Hashimoto等使用 bufalin作 用体外培养的白血病细胞，可检测到细胞拓扑异构酶Ⅱ的水平下降，DNA断裂[6]； 我们的初步研究从细胞形态学方面取得近似的证据：bufalin作用MGc-803胃癌细胞后，贴 壁 细胞逐步变圆，进而脱离瓶壁，吖啶橙染色显示细胞核碎裂，细胞中分布着很多微核样的结 构，可见bufalin损伤了细胞染色质，影响DNA基因的复制、转录，胞浆中RNA含量下降，标 志着细胞的活力降低，最终导致细胞死亡。
, http://www.100md.com
Address： Chen Xiaoyi, Medical College of CPAPF, Tianjin
陈小义 37岁，副教授，第三军医大学分子生物学研究生毕业，主要从事细胞与分子遗传学 的 教学与科研，曾于American Journal of Medical Genetics等国内外期刊上发表论文10余篇 。获得军队科技进步二等奖等4项。
参 考 文 献
1，王正德.医外医学-中医中药分册，1992，14(5)：40
2，金向群.中草药，1996，27(4)：246
3，杨素娟.中医药信息，1992，(5)：12
4，田普训，南勋义，李 旭，等.中华泌尿外科杂志，1994，15(6)：432
5，Numazawa S, Inoue N, Nukura H, et al. Biochem Pharma col, 1996, 52(6):321
6，Hashimoto S,Jing Y, Kawazoe N, et al. Leuk Res, 1997, 21(9):875
(2000-04-30收稿), http://www.100md.com
单位：陈小义 徐瑞成 陈莉(中国人民武装警察部队医学院 天津 300162)；钱进(天津药物研究院)
关键词：蟾蜍灵；细胞毒作用；胃癌细胞系
中草药001224 摘 要 蟾蜍灵(bufalin)是我国传统中药蟾酥中蟾毒的主要成分之 一，研究其抑癌作用及机制具有重要意义。采用台盼蓝染色法、噻唑蓝还原法和光镜观察bu falin对人低分化胃腺癌细胞系MGc-803的生长抑制作用。结果显示，0.01 μmol/L及以上 浓度bufalin对MGc-803细胞具有显著的抑制作用，IC50值约为0.1 μmol/L。bufal in抑制MGc-803生长的机制是致使细胞核染色质凝缩、碎裂，DNA损伤，胞浆RNA含量下降， 导致细胞死亡。
Studies on the Cytotoxicity of Bufalin on Human Gastric Cancer Cell MGc-803 in vitro
, 百拇医药
Chen Xiaoyi Xu Ruicheng Chen Li
(Medical College of Chinese People's Armed Police Forces (Tianjin 3001 62)
Qian Jin
(Tianjin Institute of Pharmaceutical Research)
Abstract To study the cytotoxic activity of bufalin, one of the components of bufadienolides in the TCM “Chansu”, and its mechanism of act ion. Human gastric cancer cell line MGc-803 was used as target cells. Inhibition of t umor cell growth was assessed by trypan blue exclusion and thiazole blue absorba nce and light microscope examination. Result showed that bufalin at concentrati o ns of 0.01 μ mol/L and above could remarkably inhibit the growth of MGc-803 t um or cell, with IC50 of about 0.1 μ mol/L. Further study showed that its me chanism of action involved necrotic changes of nuclear chromatin and fragmentati on of chromosomal DNA leading to cell death.
, 百拇医药
Key words bufalin cytotoxicity human gastric MGc-803 cance r cell
蟾酥是具有多种功效的传统中药，近年来蟾酥细胞毒成分的研究日益受到重 视[1]，蟾蜍灵(bufalin)是从蟾酥中提取的蟾毒的主要成分之一，分子式为C 24H34O4，相对分子量为386.5，我们发现bufalin作用于体外培养的胃癌细胞 ，可显著抑制肿瘤细胞生长，报道如下。
1 材料
1.1 药物：bufalin(纯度大于99%)由天津药物研究院从中华大蟾蜍Bufo bufo ga rgarizans Cantor中提取，用无水乙醇配成储备液，过滤除菌，分装保存。实验时 ，用D-hank's稀释到终浓度的10倍，再按1∶10(工作液∶培养基)的比例 加入培养基中，乙醇终浓度小于0.1 %，预实验证实，0.1%的乙醇对细胞几乎没有毒害作用。
, http://www.100md.com
1.2 胃癌细胞系：人低分化胃腺癌细胞系MGc-803引自北京市肿瘤防治研究所，培养于含 10%小牛血清的DMEM(Gibco公司)培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱(美国Napco)，培养基 中 加双抗。细胞接种后于指数生长期进行不同浓度的bufalin处理，相应时间后取材，进行各 种指标的测定。
2 方法和结果
2.1 bufalin对MGc-803细胞的生长抑制作用：台盼蓝染色法进行活细胞计数，细胞接种 于 25 mL培养瓶，分用药组和对照组，每种处理于不同时间每次取3瓶细胞分别计数，取平均值 。活细胞数量变化见表1。其中大多为台盼蓝染色阳性细胞(死细胞)，细胞增殖速度下降，0 .01 μmol/L及以上浓度处理组，细胞在0～48 h之间数目先有小幅增长，之后，细胞数下降 ，直到近乎全部崩解。
表1 bufalin作用MGc-803活细胞数量的变化
, http://www.100md.com
(×105 CFU/mL)
用药时间
(h)
药物浓度(μmol/L)
0.000
0.001
0.010
0.100
1.000
0
0.70
24
, http://www.100md.com
1.02
0.51
0.25
0.19
0.14
48
1.40
1.75
0.82
0.24
0.35
72
2.84
, 百拇医药
1.66
0.38
0.00
0.00
96
4.70
2.60
0.21
2.2 bufalin抑制MGc-803细胞的剂量效应：将MGc-803胃癌细胞于对数生长期用0.125% 胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×103 CFU/mL，接种于96孔培养板， 每孔 加200 μL细胞悬液，培养24 h后，药物处理4组，分别加入不同浓度的bufalin，并设对照 组(不加药)和空白组(只有培养，无细胞)，每组均设8个复孔；继续培养48 h，加入噻唑蓝( MTT) 20 μL(1 mg/mL),37 ℃，孵育4 h，离心，加入DMSO 200 μL,避光振荡5 min，全自 动酶标仪(上海三科仪器公司)测570 nm处吸光度(A值)。抑制率按以下公式计算：
, 百拇医药
抑制率=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100 %
由表2可见，bufalin处 理48 h，0.01 μmol/L及以上浓度对MGc-803细胞具有显著的抑制作用，IC50值在 0.1 μmol/L附近。表2 bufalin作用MGc-803细胞的剂量效应 药物浓度
(μmol/L)
吸光度A值(x±s ，n=8)
抑制率
(%)
实验组
对照组
, http://www.100md.com
空白组
0.001
1.32±0.14
1.43±0.10
0.44±0.06
11.1
0.010
1.23±0.13*
20.2
0.100
0.77±0.70**△
66.7
, 百拇医药
1.000
0.48±0.07**☆
96.0
与对照组比：*P<0.01 **P<0.001； 与0.01 μmol/L组比：△P<0.01； 与0.1 μm ol/L组比：☆P<0.001
2.3 细胞形态学观察
2.3.1 倒置光显微镜原位观察培养细胞的形态学变化：倒置光显微镜下观察培养瓶中细 胞生长的动态，可见对照组细胞多贴壁生长，呈纤维细胞型，加入bufalin，细胞起鼓、变 圆、脱壁，悬浮细胞增多(图1)。
, 百拇医药
图1 bufalin作用MGc-803细胞形态学 改变
(A-对照组；B-用药组)倒置光显微镜
2.3.2 荧光显微镜观察细胞核染色质和胞浆RNA的变化：细胞接种于洁净盖玻片铺底的6 孔培养板，24 h后加药，药物作用24 h，取出盖玻片，改良的吖啶橙染色法按天津医科大学 许 屏教授试剂盒说明书进行。在荧光显微镜下可见，对照组细胞核染色质被染成均匀的黄绿色 ，胞浆RNA被染成深的橙红色，分裂相细胞多，而药物作用组细胞，核染色质凝缩，碎裂成 不均一的小块，于胞内呈微核样，胞浆橙红色变浅，说明RNA含量下降(图2)。
4 讨论
蟾酥是传统中药，具有多方面作用[2]，曾报道蟾酥水溶液总成分注射液治疗晚期 消 化系癌，蟾酥加其他中药制成的扶正2号治疗晚期胃癌，都取得显著疗效[3]；蟾酥 的 成分比较复杂，我们选择蟾毒的主要成分bufalin与胃癌细胞系MGc-803细胞共育时，细胞 数 量明显下降，台盼蓝染色阳性细胞数随药物浓度和作用时间的增加而增多。MTT实验结果表 明，bufalin作用胃癌细胞48 h的IC50值在0.1 μmol/L附近，可见bufalin具有强细 胞毒作用，可能是其抑制肿瘤的机制之一。
, 百拇医药
bufalin对肿瘤细胞的细胞毒作用的机制还不是很清楚，实验研究发现蟾酥脂质体抑制培养 的膀胱癌细胞生长，是因为细胞DNA合成受到抑制[4]；
图2 bufalin对MGc-803细胞DNA损伤和胞浆R NA的变化(A-对照组；B-用药组荧光显微镜，吖啶橙染色) Numazawa等研究发现，bufa lin可以诱导肿瘤细胞分化，从而抑制肿瘤细胞增殖[5]；Hashimoto等使用 bufalin作 用体外培养的白血病细胞，可检测到细胞拓扑异构酶Ⅱ的水平下降，DNA断裂[6]； 我们的初步研究从细胞形态学方面取得近似的证据：bufalin作用MGc-803胃癌细胞后，贴 壁 细胞逐步变圆，进而脱离瓶壁，吖啶橙染色显示细胞核碎裂，细胞中分布着很多微核样的结 构，可见bufalin损伤了细胞染色质，影响DNA基因的复制、转录，胞浆中RNA含量下降，标 志着细胞的活力降低，最终导致细胞死亡。
, http://www.100md.com
Address： Chen Xiaoyi, Medical College of CPAPF, Tianjin
陈小义 37岁，副教授，第三军医大学分子生物学研究生毕业，主要从事细胞与分子遗传学 的 教学与科研，曾于American Journal of Medical Genetics等国内外期刊上发表论文10余篇 。获得军队科技进步二等奖等4项。
参 考 文 献
1，王正德.医外医学-中医中药分册，1992，14(5)：40
2，金向群.中草药，1996，27(4)：246
3，杨素娟.中医药信息，1992，(5)：12
4，田普训，南勋义，李 旭，等.中华泌尿外科杂志，1994，15(6)：432
5，Numazawa S, Inoue N, Nukura H, et al. Biochem Pharma col, 1996, 52(6):321
6，Hashimoto S,Jing Y, Kawazoe N, et al. Leuk Res, 1997, 21(9):875
(2000-04-30收稿), http://www.100md.com